劉 宇， 李增威， 鄧志鵬， 張慶賢*， 鄒立扣*

1. 成都理工大學， 地學核技術(shù)四川省重點實驗室， 四川 成都 610059 2. 四川農(nóng)業(yè)大學資源學院， 四川 成都 611130

引 言

隨著生活水平不斷提高， 人們對食品安全越來越重視， 從而暴露出各種食品污染問題， 其中， 食源性微生物污染的問題與人們的生活息息相關。 微生物檢測技術(shù)是保證食品安全的基礎技術(shù)， 其核心在于高效、 快速地檢測微生物。 我國常用的傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)主要是顯微鏡檢測法和平板培養(yǎng)法， 它在一段時間內(nèi)為我國的微生物檢測實踐提供了豐富的經(jīng)驗， 但其效率低下、 流程冗長， 無法滿足快速發(fā)展的食品安全檢測需求， 因此相繼提出各種微生物快速檢測技術(shù)。 3M公司和RCP Scientific Inc公司提出即用紙片法， 可檢測大腸桿菌(Escherichiacoli)等常見菌種的計數(shù)及菌落總數(shù)， 此法大大提升了工作效率， 但實驗成本較高。 隨著色譜和光譜檢測技術(shù)被應用于微生物檢測， Kim等利用流式細胞術(shù)(FCM)， 高效、 快速地鑒定了球芽孢桿菌(Bacillusglobigii)、 大腸桿菌(E.coli)和草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)[1]； 高雯瑄等研究總結(jié)了PCR技術(shù)在沙門氏菌(Salmonella)、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等六種食源性致病菌的定量檢測應用[2]。 這些高效的檢測技術(shù)具有良好的重復性和準確性， 但儀器和實驗操作對研究者的要求較高。 從光譜化學分析的角度， Shelly等通過熒光譜鑒定了生長介質(zhì)中的假單胞菌[3]； Giana等基于410和430 nm激光激發(fā)的熒光光譜分析， 研究了糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、 大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的檢測方法[4]； Arabia等利用266和405 nm激光， 獲得液相細菌光譜指紋圖譜， 識別了金黃色葡萄球菌(S.aureus)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[5]； Bhatta等通過乳桿菌(Lactobacillus)、 酵母菌(Saccharomyces)的熒光光譜研究了它們的特性[6]。 這些研究顯示了激光誘導熒光(laser-induced fluorescence spectrometry， LIFS)應用在細菌菌株識別和定量技術(shù)的潛力， LIFS是一種快速、 簡單又經(jīng)濟有效的快速識別細菌方法。

論文提出利用熒光光譜特征對不同的細菌樣品進行快速識別和表征， 以405 nm激光作為激發(fā)光源， 搭建了一套激光誘導熒光光譜的檢測系統(tǒng)， 以三種常見致病細菌為樣本(一種革蘭陽性菌糞腸球菌(E.faecalis)， 兩種革蘭陰性菌包括鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa))， 對三種細菌的菌液樣本進行熒光激發(fā)， 分析了三種細菌樣本的熒光光譜特性差異。 對糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的熒光光譜分段處理， 提取9個特征量， 用于動態(tài)聚類算法(dynamic clustering algorithm,DC)識別， 實現(xiàn)了對糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 測量原理

根據(jù)分子熒光效應和光譜分析原理[7]， 當光致分子受到紫外光照射， 熒光基團吸收能量， 輻射出頻率更低的熒光， 每種物質(zhì)因其獨一無二的結(jié)構(gòu)， 熒光效應都有其特定吸收波長和發(fā)射波長， 表現(xiàn)出不同的熒光光譜特性。

細菌中含有各種具有固有熒光基團的生物分子[8]， 由于熒光基團含量、 細菌結(jié)構(gòu)或者理化成分存在差異， 不同細菌在激光誘導下產(chǎn)生的熒光光譜有所差別， 可根據(jù)熒光特性進行細菌的分類識別。

1.2 系統(tǒng)與參數(shù)

實驗系統(tǒng)由405 nm激光模塊、 熒光探頭模塊、 熒光光譜采集模塊、 控制模塊、 控制和能譜處理軟件模塊組成[9]， 如圖1所示。

圖1 便捷式405 nm激光誘導熒光檢測儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of portable 405 nm laser-inducedfluorescence detector

工作時， 激光器光源發(fā)射出405 nm激光， 經(jīng)熒光探頭用聚焦透鏡將激發(fā)光聚焦到待激發(fā)樣品， 激光能量激發(fā)熒光分子， 進而發(fā)生能級躍遷并發(fā)出熒光， 利用同一聚焦透鏡同時收集熒光。 探頭內(nèi)置405 nm濾光片組， 將反射回來的激發(fā)光濾除并保留熒光信號， 由光譜儀采集熒光信號并由軟件進行處理。 其中， 激光器與光譜儀的參數(shù)列在表1、 表2。

表1 激光器參數(shù)Table 1 Parameters of the laser

表2 光譜儀性能參數(shù)Table 2 Parameters of the spectrometer

1.3 試劑耗材

實驗材料由四川農(nóng)業(yè)大學應用微生物學實驗室(四川， 成都)提供， 包括細菌菌株(糞腸球菌、 鼠傷寒沙門氏菌、 銅綠假單胞菌)， TSA培養(yǎng)基， TSB培養(yǎng)基， 氯化鈉(分析純)， 50 mL離心管， 超純水等。

1.4 細菌培養(yǎng)

用接種環(huán)將甘油管中的菌株在TSA平板上劃線， 37 ℃下培養(yǎng)20 h； 用接種環(huán)挑取TSA平板上的單菌落接種到50 mL TSB培養(yǎng)基中， 37 ℃振蕩培養(yǎng)20 h； 培養(yǎng)完成后將菌液3 000 r·min-1離心10 min， 倒去培養(yǎng)基。 用30 mL 0.9%生理鹽水洗滌細菌， 離心倒去生理鹽水， 重復三次， 以充分洗去TSB培養(yǎng)基的殘留。 最后用0.9%生理鹽水制成細菌懸液， 并在600 nm處調(diào)節(jié)菌液濃度為1.5OD。 為了避免雜菌污染， 整個過程在超凈工作臺完成。

1.5 測定

將裝有細菌懸液的試管充分震蕩后， 用移液槍在試管中部吸取3 mL菌液轉(zhuǎn)移到石英比色皿(容量為4 mL)， 蓋上比色皿蓋子防止細菌污染儀器。 為了避免其他光源的影響， 將比色皿的光面垂直激光發(fā)射方向放置到暗室， 利用405 nm激光誘導熒光檢測系統(tǒng)對菌液樣本進行熒光激發(fā)與采集， 如圖2所示。

圖2 儀器與操作流程圖Fig.2 The instrument and operation flow chart

2 結(jié)果與討論

2.1 激光器功率驗證

在單位時間內(nèi)， 激光器功率越高， 代表的激光器輸出能量越高， 對一些深色物質(zhì)容易因為能量太高而被“燒焦”， 而一些弱熒光信號的物質(zhì)需要更高的功率激發(fā)熒光信號[7]， 設置合適的激光器功率對采集的熒光信號至關重要。 選用鼠傷寒沙門氏菌菌液樣本驗證分析熒光光譜強度(Intensity)與激光器功率(Power)的關系。 根據(jù)圖3(b)發(fā)現(xiàn)， 隨著激光器功率上升， 細菌的熒光強度隨之上升。 在功率10～100 mW范圍內(nèi)， 細菌樣本的熒光強度與激光器功率呈良好的線性關系， 擬合優(yōu)度R2=0.997。

圖3 P=10～100 mW， c=1.5OD， 糞腸球菌的熒光譜圖(a)； 熒光強度與功率的線性關系圖(b)Fig.3 P=10～100 mW， c=1.5OD， the fluorescence spectra of E.faecalis (a); and Relationship between Intensity and Power (b)

為了避免功率過低光譜噪聲大、 功率過高引起“燒灼”， 影響細菌的熒光效果， 建議選用50～80 mW的激光器功率， 本實驗采用50 mW。

2.2 光譜分析

在P=50 mW，λ=405 nm激光下誘導熒光， 光譜儀將采集到的熒光光譜進行平滑和峰值歸一化處理， 光譜范圍設置為400～800 nm， 得到如圖4所示的熒光光譜圖， 細菌樣本的峰值特征在表3列出。

圖4 細菌樣本的熒光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of bacteria samples

表3 P=50 mW， λ=405 nm時， 細菌樣本的 峰值波長和相對強度Table 3 P=50 mW,λ=405 nm, peak wavelengthand relative intensity of bacteria samples

實驗發(fā)現(xiàn)， 鼠傷寒沙門氏菌、 糞腸球菌和銅綠假單胞菌顯示出獨特的熒光光譜。 細菌具有的熒光基團大致相同， 主要由卟啉(Porphyrin)、 輔酶(Coenzyme)、 NADH(NADPH)和黃素(Flavins)等組成[8]， 但熒光基團含量、 細菌生物體結(jié)構(gòu)以及不同細菌吸收激光能量的程度都存在差異， 形成了獨特的細菌熒光譜圖。 同為革蘭陰性菌， 鼠傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌發(fā)射出的熒光在515 nm附近， 此外， 銅綠假單胞菌的熒光光譜還分別在634和703 nm顯示出熒光峰， 且634 nm處熒光峰峰值對應光譜峰值最大值， 而革蘭陽性菌糞腸球菌的光譜在530 nm才出現(xiàn)熒光峰。 資料表明革蘭陽性菌細胞壁較厚(約20～80 nm)， 肽聚糖是其主要成分， 而革蘭陰性菌細胞較薄(約10 nm)， 除了肽聚糖， 還包含其他復雜成分， 如脂多糖、 脂蛋白等[10]。 前人的研究表明不同熒光基團對應特定的熒光峰， 如表4所示。 溶劑生理鹽水(NS)的熒光峰出現(xiàn)在λ=467 nm， 對應—OH熒光基團[11]； Koenig等研究指出， 黃酮類發(fā)出綠色熒光(530 nm)[8]， 由此認為糞腸球菌在528 nm附近的熒光峰可能對應著黃酮類基團的熒光發(fā)射， 而銅綠假單胞菌在634 nm的熒光峰則可能對應著原卟啉基團的熒光響應(633 nm)。

表4 具有較高熒光量子效率的熒光基團及其最大吸收和發(fā)射波長[12]

2.3 細菌識別

實驗發(fā)現(xiàn)， 利用P=50 mW，λ=405 nm的激光， 誘導出銅綠假單胞菌的熒光峰， 分別在634和707 nm處產(chǎn)生異于其他兩種細菌的熒光峰， 顯示出較強的獨特性， 根據(jù)該熒光特性， 可以直接實現(xiàn)對銅綠假單胞菌的特異性識別。 糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的熒光光譜圖除本底熒光峰， 僅包含一個較寬的熒光峰， 峰位也大致相同， 無法直接進行識別， 但細菌熒光峰與溶劑熒光峰的相對強度比和熒光峰上升、 下降的梯度都存在區(qū)別， 考慮兩種差異， 論文基于多元分析方法， 提出LIFS結(jié)合動態(tài)聚類的方法識別細菌種類， 具體實驗操作步驟為： 分別配置濃度為1.5OD的糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌液樣本各60組， 在P=50 mW，λ=405 nm激光條件下進行激發(fā)熒光， 獲得熒光光譜120組； 如圖5所示， 對459～586 nm之間光譜劃分為9個特征區(qū)域， 以a1(溶劑的熒光峰)作為標準進行標準化處理得到9個特征量(Characteristic value)， 由此得到120組包含9個特征量的標準化數(shù)據(jù)(聚點， Point)， 見表5， 隨機將120組聚點按照7∶3的比例分為訓練集和測試集。

圖5 劃分特征區(qū)域Fig.5 Division of characteristic areas

表5 特征區(qū)域和特征量Table 5 Characteristic areas and values

實驗中， 在訓練集中隨機選取兩組聚點作為初始聚點； 分別計算其他聚點與初始標準聚點的歐氏距離[式(1)]； 按照最短距離原則， 將距離最近的聚點與初始標準聚點合并(對特征量求平均值)作為二代標準聚點； 重復如上步驟， 直到進行完全聚類， 得到最終的標準聚點[圖6(a)]。 將測試集的樣本聚點與標準聚點按照最短距離進行聚類判斷[圖6(b)]， 實現(xiàn)對未知細菌的識別， 得到識別結(jié)果(表6)。

表6 動態(tài)聚類對糞腸球菌、 鼠傷寒沙門氏菌的識別率Table 6 Correct recognition rate of E.faecalisand S. Typhimurium by DC

圖6 訓練集標準聚點(a)、 測試集樣本聚點(b)Fig.6 The standard cluster point of training set (a),sample cluster points of test set (b)

式(1)中， xk為標準聚點的特征量的值， k=1∶9； yk為測試集的特征量的值。

對測試集數(shù)據(jù)進行識別， 糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的識別率皆為100%， 無識別錯誤和未識別數(shù)據(jù)， 說明LIFS結(jié)合動態(tài)聚類分析對三種常見食源性致病菌快速檢測的可行性。 本研究方法檢測費用較低， 無需大量的生化實驗準備及耗材[1-2]， 儀器成本較低； 識別速度快， 銅綠假單胞菌實現(xiàn)了即時識別， 糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌數(shù)據(jù)處理耗時10 min左右， 優(yōu)于FCM法(約3 d)[1]、 PCR反應體系(2 d)[2]等； 同時， 三種細菌都實現(xiàn)了100%識別， 該法識別率高。

利用便捷式405 nm激光誘導熒光檢測系統(tǒng)實現(xiàn)了對三種常見食源性致病菌的無接觸檢測， 檢測速度快， 識別效率高， 但目前所做的工作僅限于對樣品熒光光譜特征進行研究， 沒有討論微生物在培養(yǎng)、 制樣及照射過程中涉及的生物化學變化等， 這些將值得更深入的分析討論。

3 結(jié) 論

利用便捷式405 nm激光誘導熒光檢測系統(tǒng)， 對糞腸球菌、 鼠傷寒沙門氏菌、 銅綠假單胞菌等常見食品污染致病菌誘導熒光， 發(fā)現(xiàn)三種細菌的熒光光譜各有差異。 簡單驗證了激光器功率與細菌熒光強度的關系， 得出最佳激光器功率范圍為50～80 mW。 在P=50 mW，λ=405 nm激光誘導下， 銅綠假單胞菌的熒光光譜在λ=634 nm和λ=703 nm產(chǎn)生有別于其他兩種細菌的熒光峰， 可以據(jù)此對銅綠假單胞菌進行直接識別。 基于動態(tài)聚類的思想， 采集糞腸球菌， 鼠傷寒沙門氏菌120組熒光數(shù)據(jù)并隨機分為訓練集84組、 測試集36組， 對熒光譜圖劃分9個特征區(qū)域進行特征量聚類識別， 得出糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的識別率為100%， 實現(xiàn)對糞腸球菌和鼠傷寒沙門氏菌的快速識別。 經(jīng)實驗驗證， 激光誘導熒光光譜法操作簡單， 檢測速度快， 效率高， 結(jié)合動態(tài)聚類的思想， 為實際微生物快速檢測討論設計了一種新的測試方法。