杜振偉 朱帥鵬 馬向飛 李東華 孫桂榮

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 540046）

CEBPA是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個(gè)亞家族成員中最早發(fā)現(xiàn)的［1-2］.，該增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族在脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、骨髓組織細(xì)胞生成及機(jī)體免疫過程中發(fā)揮重要作用［3］，同時(shí)在脂肪的生長(zhǎng)過程中起正向調(diào)和反向調(diào)節(jié)作用。CEBPA被認(rèn)為是調(diào)節(jié)脂肪形成的關(guān)鍵分子之一［4-5］，在脂肪細(xì)胞的終末分化中有著很重要的作用［6］。牙髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞（DPSc）沿成骨和成軟骨途徑分化時(shí)，因DPSc不含脂泡，檢測(cè)到CEPPA的表達(dá)水平降低［7］。在特發(fā)性肺纖維化（IPF）細(xì)胞中過表達(dá)CEBPA可增加脂肪生成潛能和脂肪成纖維細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，抑制CEBPA的表達(dá)會(huì)降低了成脂潛能并促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的活化［8］。全反式維甲酸（atRA）可通過RARG-FRA1-PPARG2或CEBPA軸或兩者抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的脂肪形成［9］。白藜蘆醇通過使PPARG、CEBPA、FABP4和LMO3的表達(dá)下調(diào)來抑制脂肪分化［10］。CEBPA增強(qiáng)了Slc2a4基因和GLUT4蛋白的表達(dá)，是脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志［11］。Gao等［12］研究表明CEBPA 的啟動(dòng)子區(qū) CpG 位點(diǎn)甲基化使瘦肉系雞顯著高于脂肪系雞，且啟動(dòng)子區(qū)域-1 494 bp - -1 478 bp 的 CpG CEBPA mRNA 表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，這就表明該基因在脂肪組織中發(fā)生甲基化并調(diào)控脂肪發(fā)育。CEBPA與脂肪分解、脂肪生成和脂肪酸飽和相關(guān)基因聚在一起［13］，同時(shí)秦川牛的脂肪沉積也與CEBPA有關(guān)［14］。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)CEBPA基因編碼序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并測(cè)得其在不同組織，不同發(fā)育時(shí)期及不同品種的表達(dá)量且加以分析，為以后CEBPA基因在胸肌脂肪沉積方面的研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)的試驗(yàn)對(duì)象為固始雞和羅斯雞，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽種質(zhì)資源場(chǎng)提供。分別取6、12、22、30、55周齡的健康固始雞各3只和6周齡羅斯雞3只，置于相同的環(huán)境下飼養(yǎng)一段時(shí)間后，進(jìn)行頸部放血法處死試驗(yàn)動(dòng)物后，迅速采集胸肌、肝臟、腿肌、皮下脂肪，腹脂組織并及時(shí)用液氮進(jìn)行冷凍，并置于-80℃保存?zhèn)溆谩１狙芯客ㄟ^河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20-0086）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 使用TRIzol法提取固始雞胸肌、肝臟、腿肌、皮下脂肪，腹脂以及羅斯肉雞胸肌的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，放入-20℃冰箱保存以備后用。

1.2.2 雞CEBPA CDS區(qū)的克隆 根據(jù)NCBI上雞（NP_001026630.1）的CEBPA基因的CDS區(qū)，在Oligo 7上設(shè)計(jì)克隆引物見表1，以肝臟的cDNA模板。PCR反應(yīng)體系：cDNA 4 μL，上、下游引物各 6 μL，KOD OneTMPCRMaster Mix 100 μL，加水至200 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃ 3 min；98℃ 10 s，70℃ 5 s，68℃ 15 s，15個(gè)循環(huán)；98℃ 10 s，55℃ 5 s，68℃ 15 s，25個(gè)循環(huán)；68℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，為DNA平末端加A尾，再向PCR產(chǎn)物中添加約體系1/3的 2×Rapid Taq Master Mix，震蕩混勻，再放入PCR儀中，72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，并將目的片段進(jìn)行切膠回收，用回收產(chǎn)物與pMDTM18-T Vector Cloning Kit連接，16℃ 16 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，37℃培養(yǎng)，挑選陽性菌落，經(jīng)菌液PCR鑒定，送上海生工生物公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用TMHMM和SignalP 5.0在線軟件分析其跨膜結(jié)構(gòu)域與信號(hào)肽；運(yùn)用PSIPRED和 SWISS-MODE在線軟件對(duì)其蛋白的二級(jí)，三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用PSORT II Prediction在線軟件對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；用DNAStar軟件對(duì)雞（NP_001026630.1）、小鼠（NP_001274443.1）、人（NP_001272758.1）、豬（XP_003127063.1）、牛（NP_789741.2）、家兔（XP_008255494.1）、日本鵪鶉（XP_015729433.1），斑馬魚（NP_571960.1）的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；用 MEGA 7.0 軟件構(gòu)建CEBPA蛋白物種進(jìn)化樹。并用STRTNG進(jìn)行蛋白互作分析，相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：最小相關(guān)得分為0.40，一級(jí)最大相關(guān)因子數(shù)為10。在NCBI網(wǎng)站中搜索雞CEBPA基因的核苷酸序列，以其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為界限，截取基因序列上游-2 000 bp - -1 bp共2 000 bp序列作為CEBPA基因5'調(diào)控區(qū)進(jìn)行序列分析，并利用在線軟件BDGP：Neural Network Promoter Prediction，Promoter 2.0和FPROM對(duì) 雞CEBPA基因5'調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，同時(shí)用在線軟件EMBOSS和MethPrimer對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行甲基化CpG島預(yù)測(cè)，相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：CpG島長(zhǎng)度＞200 bp，CpG檢測(cè)含量/期望含量（Obs/Exp）＞0.60，GC%＞50%。

1.2.4 熒光定量PCR 該反應(yīng)以得到的cDNA為模板，采用SYBR GreenⅠ染料法和LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，按照試劑盒中的操作說明，以β-action作為內(nèi)參基因，檢測(cè)目的基因的表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中TBGreen Mix 5 μL，無RNA酶水 3 μL，上、下游引物（表1）各0.5 μL，cDNA 1 μL。qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；37℃ 30 s。每組實(shí)驗(yàn)包含2個(gè)技術(shù)重復(fù)和6個(gè)生物重復(fù)。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequences

1.2.5 實(shí)時(shí)定量數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 23.0軟件單因素分析方法，利用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P＜0.01表示差異具有極顯著性，P＜0.05表示差異具有顯著性。數(shù)值表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，利用GraphPad Prism5.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 雞CEBPA CDS區(qū)的克隆

以雞肝臟的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)目的片段以及陽性菌落測(cè)序（圖1）。該片段為CEBPA基因的CDS區(qū)的全長(zhǎng)（GenBank登錄號(hào)：NC_006098.5），975 bp，共編碼氨基酸325個(gè)，位于Chromosome 11：10295396-10296370，一個(gè)外顯子。

2.2 雞CEBPA的生物信息學(xué)分析

2.2.1 CEBPA蛋白結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)CEBPA蛋白結(jié)構(gòu)表明，該蛋白不存在跨膜域，且無信號(hào)肽（圖2-A，2-B），有211個(gè)氨基酸組成的無規(guī)則卷曲序列，占整個(gè)序列的65.12%，是CEBPA蛋白的重要組成部分，有113個(gè)氨基酸構(gòu)成了α-螺旋占全部結(jié)構(gòu)的34.88%，與在線預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果基本相似（圖2-C，2-D）。同時(shí)預(yù)測(cè)得知雞CEBPA蛋白主要在細(xì)胞核中占60.9%，一部分還分布在細(xì)胞質(zhì)中占21.7%。運(yùn)用STRTNG顯示該蛋白與Runx轉(zhuǎn)錄因子家族、TRBs家族、PPARs核受體超級(jí)家族等有相互作用的關(guān)系，結(jié)果見圖2-E。

2.2.2 CEBPA氨基酸序列的同源性分析 為了研究該基因的生物進(jìn)化進(jìn)程，對(duì)不同物種CEBPA的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，雞與鵪鶉、人、豬、牛、兔、小鼠、斑馬魚的同源性分別為99.4%、93.9%、83.5%、85.3%、82.7%、83.3%、74.8%（圖3-A）。并用這8個(gè)物種的CEBPA氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3-B），發(fā)現(xiàn)雞與鵪鶉的親緣關(guān)系最近，雞與人和小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.2.3 CEBPA啟動(dòng)子和CpG島的預(yù)測(cè) 在NCBI數(shù)據(jù)庫獲得雞CEBPA 5'調(diào)控區(qū)-2 000 bp序列，在染色體上的位點(diǎn)為：Chromosome 11：10293396-10295395。并將這-2 000 bp作為候選啟動(dòng)子區(qū)用3種啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，BDGP：Neural Network Promoter Prediction預(yù)測(cè)雞CEBPA有7個(gè)啟動(dòng)子，Promoter 2.0預(yù)測(cè)雞CEBPA有2個(gè)啟動(dòng)子，F(xiàn)PROM預(yù)測(cè)雞CEBPA有4個(gè)啟動(dòng)子（圖4-A）。使用EMBOSS和MethPrimer對(duì)雞CEBPA 5'調(diào)控區(qū)-2 000 bp序列進(jìn)行CpG島預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖4-BC）兩個(gè)預(yù)測(cè)軟件結(jié)果完全一樣，CpG島位于CEBPA 5'調(diào)控區(qū)-2 000 bp序列的-265 bp - -1 895 bp之間，大小為1 640 bp。

圖 1 雞 CEBPA CDS 區(qū)克隆結(jié)果Fig.1 Cloning results of chicken CEBPA CDS region

2.3 雞CEBPA在固始雞時(shí)空表達(dá)譜的構(gòu)建

本試驗(yàn)利用qRT-PCR方法構(gòu)建12周齡固始雞CEBPA的組織表達(dá)譜（圖5-A）。結(jié)果表明，CEBPA胸肌和腿肌的表達(dá)量顯著低于腹脂、皮下脂肪、肝臟的表達(dá)量（P＜0.05）。利用qRT-PCR方法測(cè)量的6周齡、12周齡、22周齡、30周齡、55周齡固始雞胸肌中CEBPA的表達(dá)量，構(gòu)建時(shí)序表達(dá)圖譜（圖5-B）。結(jié)果表明，CEBPA在6周齡到55周齡的相對(duì)表達(dá)量呈U型，6周齡到22周齡CEBPA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，22周齡到55周齡CEBPA的相對(duì)表達(dá)量逐漸增高。在22周齡時(shí)，相對(duì)表達(dá)量最低，且顯著低于6周齡和55周齡（P＜0.05）。

2.4 CEBPA在固始雞和羅斯肉雞胸肌中表達(dá)譜的構(gòu)建

通過對(duì)6周齡的羅斯雞（LS）和固始雞（GS）胸肌中CEBPA的表達(dá)量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)羅斯肉雞中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于固始雞（P＜0.05），大約為2.5倍，結(jié)果見圖6。

圖 2 CEBPA 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of CEBPA protein structure and function

3 討論

傳統(tǒng)的生物學(xué)認(rèn)為，蛋白質(zhì)的序列決定了它的功能［15］。因此我們預(yù)測(cè)雞CEBPA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，表明該蛋白不存在跨膜域、無信號(hào)肽，不是分泌蛋白。結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中具有特異空間結(jié)構(gòu)和獨(dú)立功能的區(qū)域，能夠決定蛋白質(zhì)發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)效用［16］。秦川牛脂肪沉積基因CEBPA的兩種蛋白亞型都定位在細(xì)胞核中［14］，與雞CEBPA蛋白預(yù)測(cè)的結(jié)果不同，雞CEBPA蛋白有21.7%存在于細(xì)胞質(zhì)中，這為后續(xù)研究CEBPA在脂肪沉積中功能提供了理論基礎(chǔ)。

PPI網(wǎng)絡(luò)圖中顯示CEBPA蛋白多個(gè)家族存在互作作用，PPARG是一種依賴于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。PPARG、PPRα和PPARβ一起組成核受體超級(jí)家族，PPARs主要調(diào)節(jié)糖代謝和脂肪分布［17］；HNF4A是肝細(xì)胞核因子（heptocytenuclear、HNF）家族的一員。在肝臟中表達(dá)量較高的一類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)肝臟基因的特異性表達(dá)。HNF4A主要調(diào)控葡萄糖、氨基酸和脂質(zhì)的代謝［18-19］；TRBs家族有TRIB1、TRIB2和TRIB3，擁有類似激酶結(jié)構(gòu)，卻缺乏激酶的催化活性。其主要通過與靶蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)靶蛋白的功能的促進(jìn)或抑制或蛋白穩(wěn)定性［20］。TRIB2在人類急性髓系白血病表達(dá)增高，可抑制CEBPA的功能進(jìn)而促進(jìn)白血病的進(jìn)展［21］。

圖 3 CEBPA 氨基酸序列保守性分析Fig.3 Conserved amino acid sequence analysis of CEBPA

圖 4 CEBPA 啟動(dòng)子和CpG 島預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Schematic diagram of the predicted structure of CEBPA promoter and CpG island

圖 5 CEBPA 在固始雞中的時(shí)空表達(dá)譜Fig.5 Spatial and temporal expression profiles of CEBPA in Gushi chickens

圖 6 CEBPA 在 6 周齡固始雞和羅斯雞胸肌中的相對(duì)表達(dá)量比較Fig. 6 Comparison of the relative expression of CEBPA in the pectoral muscle of 6-week-old Gushi and Rose chickens

C/EBP通過結(jié)合抑制干細(xì)胞更新的基因以及激活髓樣分化基因的啟動(dòng)子來誘導(dǎo)骨髓祖細(xì)胞的粒細(xì)胞分化和維持成人造血干細(xì)胞（HSC）靜止［22-24］。人類已知的大多數(shù)CEBPA啟動(dòng)子在肝細(xì)胞或脂肪細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控［25］，因此我們利用在線軟件預(yù)測(cè)雞CEBPA基因5'調(diào)控區(qū)-2 000 bp序列的啟動(dòng)子，NNPP預(yù)測(cè)得到7個(gè)啟動(dòng)子，其中有兩個(gè)啟動(dòng)子的分值在0.9以上。FPROM預(yù)測(cè)得到的4個(gè)啟動(dòng)子中只有一個(gè)有TATA盒。而Promoter2.0預(yù)測(cè)得到的2個(gè)啟動(dòng)子可信度都是臨界性預(yù)測(cè)，且分值都在0.9以下，假陽性的可能性較大，為后來研究CEBPA的激活對(duì)脂肪沉積提供基礎(chǔ)的信息；CpG島主要位于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域，約有60%以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。而人類的基因組中，約80%的CpG二核苷酸是甲基化的，常位于基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG二核苷酸是未甲基化的［26］。DNA的甲基化具有穩(wěn)定性，可阻止轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而調(diào)控基因的低表達(dá)或不表達(dá)［27］。在乳腺癌發(fā)病過程中，CEBPA的甲基化通過阻斷CEBPA與精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶1（PRMT1）抑制因子HDAC3結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)［28］。抑制組蛋白賴氨酸去甲基化酶7A（KDM7A）使CEBPA和分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（Sfrp1）的表達(dá)下降，從而抑制了細(xì)胞的成脂分化，促進(jìn)了成骨分化［29］。因此預(yù)測(cè)CEBPA的CpG島，為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)的資料。

基因在同一種生物不同器官組織中存在表達(dá)廣泛性和特異性［30］，基因在組織中的表達(dá)受多種因素調(diào)控，不同組織的功能不同，導(dǎo)致同一基因在不同組織中的表達(dá)也有所不同［31］。前人實(shí)驗(yàn)證實(shí)CEBPA是維持造血系統(tǒng)粒系分化過程中的重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化的平衡中也起著關(guān)鍵作 用［32-34］。CEBPA是第一個(gè)在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。它在大多數(shù)特異性脂肪細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄之前就已經(jīng)得以表達(dá)，此外許多特異性脂肪細(xì)胞基因的最近端啟動(dòng)子上都含有CEBPA結(jié)合點(diǎn)。Wang等［13］在小鼠體內(nèi)干擾了CEBPA，小鼠表現(xiàn)出白色脂肪組織發(fā)育停滯現(xiàn)象。本試驗(yàn)通過構(gòu)建固始雞不同組織表達(dá)譜可以發(fā)現(xiàn)，皮下脂肪、腹脂、肝臟中CEBPA的相對(duì)表達(dá)量較高，且差異不顯著。因肝臟是產(chǎn)生脂肪的主要組織，由此可見肝臟中CEBPA相對(duì)表達(dá)量較高可能與肝臟的功能有關(guān)。同時(shí)腹脂與皮脂都是產(chǎn)生脂肪的組織，因此推測(cè)CEBPA對(duì)家禽體內(nèi)脂肪的形成有重要作用。

本研究測(cè)定6周齡的羅斯雞與固始雞胸肌中CEBPA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)羅斯雞的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于固始雞中的表達(dá)量。經(jīng)查資料可知，羅斯雞為肉雞，體內(nèi)脂肪含量多，且生長(zhǎng)快，飼料報(bào)酬高［35］。而固始雞為蛋雞，胸肌內(nèi)的脂肪含量少。CEBPA與脂肪的合成有關(guān)，因此在羅斯雞的表達(dá)量高與脂肪含量含量多有關(guān)。同時(shí)本研究還測(cè)得了固始雞胸肌不同發(fā)育時(shí)期CEBPA的表達(dá)量，結(jié)果呈U型。在22周齡時(shí)表達(dá)最低，55周齡表達(dá)量最高。另課題組測(cè)得的6周齡、12周齡、22周齡、30周齡固始雞胸肌的脂肪含量與CEBPA表達(dá)的趨勢(shì)一致［36］，還測(cè)得55周齡與20周齡相比胸肌的脂肪含量明顯增加，也與CEBPA表達(dá)趨勢(shì)相同。22周齡時(shí)固始雞進(jìn)入產(chǎn)蛋期，55周齡時(shí)已經(jīng)經(jīng)歷了產(chǎn)蛋高峰期，進(jìn)入衰老期，將要被淘汰［37］。產(chǎn)蛋期的雞體內(nèi)激素分泌旺盛，代謝能力增強(qiáng)［38］，因此在產(chǎn)蛋期雞體內(nèi)的脂肪含量會(huì)有所變化。但隨著雞的年齡日漸增大，產(chǎn)蛋高峰期也逐漸過去［39］，雞體內(nèi)的脂肪沉積會(huì)越來越多，所以推測(cè)此時(shí)期CEBPA基因?qū)π丶≈兄境练e發(fā)揮著較大功能。

4 結(jié)論

本研究克隆了雞CEBPA CDS區(qū)的全長(zhǎng)序列（Genebank登錄號(hào)：NC_006098.5），全長(zhǎng)為975 bp，一個(gè)外顯子。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白在物種間的保守性高，不是分泌蛋白，定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中；該蛋白還與Runx轉(zhuǎn)錄因子家族、TRBs家族、PPARs核受體超級(jí)家族等多個(gè)家族相互作用；3種在線軟件預(yù)測(cè)CEBPA 5'調(diào)控區(qū)-2 000 bp序列上共有13個(gè)啟動(dòng)子；預(yù)測(cè)該區(qū)域共有一個(gè)CpG島且位于CEBPA 5'調(diào)控區(qū)-2 000 bp序列的-265 bp - -1 895 bp之間，大小為1 640 bp；qRT-PCR結(jié)果表明，CEBPA在胸肌和腿肌的表達(dá)量顯著低于腹脂、皮下脂肪、肝臟的表達(dá)量；固始雞胸肌中CEBPA的表達(dá)量在6周齡、12周齡、22周齡、30周齡、55周齡成U型結(jié)構(gòu)，22周齡的表達(dá)量相對(duì)于6周齡和55周齡表達(dá)量顯著降低；6周齡固始胸肌的表達(dá)量顯著低于羅斯肉雞的表達(dá)量。CEBPA可能參與調(diào)控胸肌的脂質(zhì)沉積。