田嘉慧 封佳麗 盧俊樺 毛林靜 胡著然 王瑩 楚杰

（1 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物研究所，濟南 250103；2山東省碧藍生物科技有限公司，寧陽 271400）

漆酶（laccase，EC 1. 10. 3. 2）屬于藍多銅氧化酶（blue multi-copper oxidases，BMCOs）家族，是一種含銅多酚氧化酶［1］。相較于其他來源的漆酶，真菌產(chǎn)漆酶具有底物范圍廣、作用條件較溫和、活性穩(wěn)定、無副產(chǎn)物等特點。漆酶在生物體內(nèi)參與多種代謝過程，如木質(zhì)素降解、細胞壁構建等［2］。漆酶具有較廣泛的應用前景，在降解染料、造紙、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護、生物傳感器等方面都可以發(fā)揮比較大的作用［3］。

真菌產(chǎn)漆酶的方式主要有固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵，真菌漆酶的大小一般為50-90 kD，其最適溫度范圍為25-80℃，最適pH在2.0-5.0之間，F(xiàn)e2+對真菌漆酶有強烈抑制作用，其他化合物也可以不同程度的抑制漆酶的催化進程［4-7］。不同來源漆酶的酶學性質(zhì)存在一定差異，作用條件也各不相同，因此，分離純化出一種活性不易受到其他外界因素影響且作用及保存條件較溫和的漆酶是十分必要的。

近年來對一色齒毛菌漆酶的研究取得了一定的進展，研究內(nèi)容主要集中在以下兩個方面：一是提高漆酶產(chǎn)量，主要方法有基因調(diào)控［8］、優(yōu)化分離純化方式［9］、使用不同波長光照或者添加誘導物等手段調(diào)控發(fā)酵條件［10-11］等；二是拓展漆酶的應用范圍，Deniz等［12］研究了漆酶對染料的脫色效率與染料種類和發(fā)色基團的關系，Anna等［13］發(fā)現(xiàn)一色齒毛菌漆酶具有抗白血病細胞活性，Polak等［14］研究發(fā)現(xiàn)漆酶可以合成具有抗菌和抗氧化活性及良好染色性能的新型紡織染料。本研究以漆酶活性較高的一色齒毛菌為試驗對象，玉米秸稈為碳源對其進行液態(tài)發(fā)酵，通過（NH4）2SO4沉淀、疏水層析（phenyl sepharose fast flow）、離子層析（DEAE sepharose fast flow）、凝膠層析（TSK gel G2000SWxl）對漆酶進行分離純化，然后對漆酶酶學性質(zhì)進行研究，并利用純化后漆酶降解8種常見的染料，探討一色齒毛菌的生產(chǎn)潛力及漆酶的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗用菌株一色齒毛菌，由山東省科學院生物研究所工業(yè)微生物實驗室提供，并進行18S rDNA鑒定（Accession number：MW150799）。

1.1.2 設備和試劑 AKTA purifier 蛋白純化系統(tǒng)（GE）；HiTrap Phenyl FF（GE）；HitrapTMDEAE（GE）；GEL G2000SWxl（TSK）；紫外分光光度計（普析TU-1901）；酶標儀（TECAN infinite M200PRO）。 2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，簡稱ABTS，Solarbio；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，國藥集團有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（pH 5.0）：酵母浸粉（2.0 g/L），NaNO3（3.0 g/L），KH2PO4（0.8 g/L），K2HPO4（0.2 g/L），CuSO4·5H2O（0.0125 g/L），MgSO4·7H2O（0.5 g/L），MnSO4（0.034 g/L），玉 米秸稈2.15 g/L。

培養(yǎng)條件：250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基接種一色齒毛菌于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 酶活測定方法 本試驗采用ABTS法測定漆酶活力：2.79 mL的乙酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 3.8）與60 μL 0.05 mol/L的ABTS混合，再加入150 μL待測酶液，混合均勻于30℃反應1 min，420 nm條件下測定吸光度。

V總：表示反應體系的總體積，單位為mL；ΔOD表示吸光度在1 min內(nèi)的變化量；ε表示摩爾消光系數(shù)，ABTS的吸光系數(shù)為36 000 L/（mol·cm）；V酶表示加入待測酶液的體積，單位為mL；Δt為1 min；n為待測酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.2 漆酶的分離純化 2 L發(fā)酵液上清依次經(jīng)過飽和度為60%的（NH4）2SO4沉淀、疏水層析（0.05 mol/ L NaCl+0.02 mol/L、pH 7.0的NaH2PO4&Na2HPO4緩沖液（PB緩沖液）、DEAE離子層析（0.2 mol/L NaCl+0.02 mol/L、pH 7.0的PB緩沖液）、凝膠層析（0.1 mol/L Na2SO4+0.1 mol/L、pH 5.8的PB緩沖液）將漆酶LacT-1進行分離純化，試驗過程中樣品的脫鹽步驟均使用10 kD的超濾柱來完成。分離純化后的漆酶進行SDS-PAGE電泳驗證。

1.2.3 酶學性質(zhì)研究

1.2.3.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 最適溫度：在不同溫度（0-70℃，梯度為10℃）下測定純化后的漆酶活性，以活力最高值為100%，計算各組相對酶活。

溫度穩(wěn)定性：將純化后的酶液在不同溫度（0-70℃，梯度為10℃）保溫1 h后，在最適溫度條件下測漆酶活性，以活力最高值為100%，計算各組相對酶活。

1.2.3.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 最適pH：將純化后的酶液在60℃、不同pH（3.2-8.0）條件下測漆酶活性，以活力最高值為100%，計算各組的相對酶活。

pH穩(wěn)定性：將純化后的酶液在不同pH（3.2-8.0）條件下，4℃保存24 h后，在60℃、pH4.8條件下測漆酶活性，以活力最高值為100%，計算各組的相對酶活。

1.2.3.3 離子對漆酶活性的影響 在反應體系中加入1 mmol/L金屬離子（K+、Ca2+、Fe3+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+），在最適溫度和pH條件下測定漆酶活性，以未添加金屬離子組為對照組，分析各金屬離子對漆酶活性的影響。

1.2.3.4 化合物的影響 在反應體系中分別加入1 mmol/L或10 mmol/L的SDS、β-ME、DEAE-2Na、H2O2、抗壞血酸、草酸、TCA溶液，在最適溫度和pH條件下，測定漆酶活性，以未添加化合物的LacT-1的酶活為100%，分析各化合物對漆酶活性的影響。

1.2.3.5 動力學常數(shù)的測定 在最適反應溫度和pH條件下，改變ABTS濃度（0.25%-2.25%），測定漆酶反應初速度。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖得到1/［V］和1/［S］的關系方程，計算米氏常數(shù)Km和酶被底物飽和時的速度Vmax。V表示反應速度（mmol/（L·min）），S表示底物濃度（mmol/L）。

1.2.3.6 染料降解 配制10 g/L的甲基橙、酸性紅1、剛果紅、活性黑5、考馬斯亮藍R250、孔雀石綠、結晶紫、溴酚藍母液，將其稀釋為100 mg/L，以去離子水為對照，在酶標儀紫外可見光區(qū)（200-900 nm）進行全波長掃描得到染料最大吸收波長。

反應體系為6 mL：60 μL染料（10 g/L），10 μL ABTS（0.05 mol/L），4.93 mL乙酸緩沖液（pH4.8，0.05 mol/L），1 mL的LacT-1酶液。反應體系置于40℃、150 r/min的搖床，每隔2 h測一次染料在其特征波長處的OD值，以未添加酶液的體系為對照［15］，染料降解率計算公式如下：

A0表示未添加酶液反應體系的OD值，Ai表示添加酶液反應一定時間的OD值。

2 結果

2.1 LacT-1的分離純化

通過產(chǎn)酶曲線（圖1）可得，一色齒毛菌連續(xù)培養(yǎng)第7天時，漆酶活性最高為8 395.66 U/L。收集發(fā)酵上清，經(jīng)（NH4）2SO4沉淀、疏水層析、離子層析、凝膠層析，最終收集到的樣品通過SDS-PAGE電泳驗證發(fā)現(xiàn)為單條帶，大小約為65 kD，表明經(jīng)過以上實驗過程得到了電泳純的漆酶（圖2）。該酶比活力為41.31 U/mg，純化倍數(shù)為21.86，酶活回收率達到6.57%（表1）。

表1 一色齒毛菌漆酶各純化步驟的純化效率Table 1 Purification efficiency of each purification step of laccase from C. unicolor

圖 1 一色齒毛菌的產(chǎn)酶曲線Fig.1 Enzyme production curve of C. unicolor

圖2 SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE

2.2 LacT-1酶學性質(zhì)

2.2.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 根據(jù)圖3可知，LacT-1最適溫度為60℃，在40℃時，漆酶的酶活可達71.75%，在80℃，酶活仍可保持65.64%；由圖4可知，漆酶在40℃保存1 h后，LacT-1還具有65.57%的活性。

圖 3 LacT-1的最適溫度Fig.3 Optimal temperature of LacT-1

圖4 LacT-1的溫度穩(wěn)定性Fig.4 Temperature stability of LacT-1

2.2.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 根據(jù)圖5可知，Lac- T-1最適pH為4.8，在pH 4.0-5.0范圍內(nèi)，漆酶的酶活可達80%以上：由圖6可知，LacT-1在pH 5.4-8.0保存24 h后，漆酶活性仍可保持在80%以上。

圖5 LacT-1的最適pHFig.5 Optimal pH of LacT-1

圖6 LacT-1的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of LacT-1

2.2.3 不同金屬離子對LacT-1活性的影響 由圖7可知，相同濃度的Na+、Cu2+對漆酶活性有不同程度的促進作用；K+、Ca2+、Fe3+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+對漆酶酶活有不同程度的抑制，抑制程度由大到小依次為Mn2+＞Fe3+＞Zn2+＞Co2+＞Mg2+＞K+＞Ca2+，F(xiàn)e2+則完全抑制漆酶活性。

圖7 金屬離子對LacT-1活性的影響Fig.7 Effect of metal ions on LacT-1 activity

2.2.4 化合物對LacT-1活性的影響 根據(jù)表2可知，不同的化合物對漆酶酶活均有一定程度的抑制作用，1 mmol/L β-ME完全抑制LacT-1活性；添加1 mmol/L SDS時，LacT-1活性僅保持在29.32%，SDS濃度增加到10 mmol/L時，LacT-1活性完全被抑制；DEAE-2Na濃度為1 mmol/L時，LacT-1活性仍保持89.64%，當濃度提高到10 mmol/L時，LacT-1活性仍可達到61.55%；1 mmol/L的H2O2對LacT-1活性有促進作用，而10 mmol/L的H2O2抑制漆酶活性；草酸對LacT-1的作用與H2O2相反，濃度為1 mmol/L時，草酸對LacT-1有抑制作用，當濃度增加到10 mmol/L時，草酸對LacT-1有較小程度的促進作用；TCA對LacT-1則是促進作用，當濃度達到10 mmol/L時，活性可達145.95%。

表2 化合物對LacT-1活性的影響Table 2 Effect of compounds on the activity of LacT-1

2.2.5 動力學常數(shù)的測定 在60℃和pH為4.8的條件下，添加不同濃度的ABTS（0.25%-2.25%），測定漆酶反應初速度。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖得1/［V］和1/［S］的關系方程（圖8），最終通過計算得到Km為0.075 mmol/L，Vmax為250 000 mmol/（L·min）。

圖8 LacT-1酶學動力常數(shù)Fig.8 Kinetic enzyme constant of LacT-1

2.2.6 染料降解 由表3可知，LacT-1對孔雀石綠和結晶紫的降解率均達到90%以上，對甲基橙、酸性紅1、活性黑5、考馬斯亮藍和溴酚藍的降解率為70%以上，對剛果紅的降解率僅有48.59%。

表3 LacT-1對染料的降解Table 3 Degradation of dyes by LacT-1

3 討論

真菌漆酶自身氧化還原電動勢高于其他生物產(chǎn)的漆酶，可以催化木質(zhì)素、酚類、芳香族化合物等物質(zhì)的降解，而這些物質(zhì)處理不當會造成環(huán)境污染，因此，漆酶在實際生活中具有廣闊的應用前景。迄今為止，關于漆酶的研究雖然取得了一定成果，但是大部分漆酶存在酶活不穩(wěn)定、對一些化合物耐受力不強等問題，對漆酶基礎和應用的研究需進一步發(fā)展。

本研究對一色齒毛菌進行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵液上清經(jīng)（NH4）2SO4沉淀、疏水層析、DEAE離子交換層析和凝膠層析純化得到漆酶LacT-1，其大小約為65 kD，與Pleurotus eryngii var Tuoliensis漆酶的大小相同［4］。LacT-1的純化倍數(shù)為21.86，回收率為6.57%。Bagewadi等［16］和馬倩倩［17］研究表明，Trichoderma harzianum HZN10和Pleurotus ostreatus漆酶的純化倍數(shù)分別為25，27.5，回收率分別為7%，6.5%，與本研究的純化參數(shù)相近，但是與Wang等［18］發(fā)現(xiàn)的C. unicolor GSM-01漆酶純化倍數(shù)30.64，回收率33.9%有一定差距。C. unicolor GSM-01發(fā)酵上清經(jīng)DEAE Cellulose、SP-Sepharose、Q-Sepharose、Superdex 75實現(xiàn)純化，其中DEAE Cellulose的純化倍數(shù)為5.26，高于其他各方式的純化倍數(shù)［18］；根據(jù)表1，對比本文各純化方式的純化倍數(shù)可知，DEAE層析的純化效率最高，所以在進行漆酶分離純化的研究中，可

以考慮優(yōu)先使用DEAE層析。

以ABTS為底物，LacT-1最適溫度為60℃，與Pleurotus sp MAK-II［19］、Pleurotus ostreatus yu 6［20］和Echinodontium taxodii［21］的漆酶最適溫度相同，但不同漆酶對溫度的耐受性不同，Pleurotus sp MAKII漆酶在30-70℃保存1 h后活性可保持在50%以上，Pleurotus ostreatus yu 6在60℃保存0.5 h剩余酶活約50%，而Echinodontium taxodii漆酶在60℃保存1 h后剩余酶活只有30%。LacT-1在0-40℃的條件下保存1 h，其活性仍保留65.57%，所以LacT-1最佳實際應用溫度為40℃。LacT-1的最適pH為4.8，與Pholiota nameko SW-01最 適pH相 同［22］，而Pleurotus sp MAK-II、Echinodontium taxodii的 最適pH值分別為4.5、3.0。Pholiota nameko SW-01僅在弱酸環(huán)境中有較高活性，Pleurotus sp MAK-II漆酶在pH 3.5-6.0范圍內(nèi)保持其初始活性的60%以上，當pH ＞ 7.5時，幾乎沒有活性；Echinodontium taxodii漆酶在pH 4.0-6.0條件下保存2 h后剩余酶活為80%以上；LacT-1在pH 5.4-8.0條件下保存24 h后，活性仍可保持在80%以上。與上述漆酶相比，LacT-1的pH穩(wěn)定性更強，貯存條件對pH的要求比其他漆酶要廣泛，并且其最適pH呈弱酸性，在實際應用中LacT-1對pH要求較低，在保證較高的活性同時節(jié)約了成本。

終濃度為1 mmol/L 的金屬離子Cu2+、Na+對LacT-1有不同程度的促進作用，K+、Ca2+、Fe3+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+對酶活有抑制作用，F(xiàn)e2+則完全抑制酶活。Cu2+對LacT-1有一定促進作用，與劉芹等［23］發(fā)現(xiàn)的Cu2+對Pleurotus ostreat漆酶的作用一致，而竇隆等［24］研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對sathyrella candollean漆酶有抑制作用，說明Cu2+對不同漆酶作用不同。由于漆酶屬于藍多銅氧化酶，可以以此為切入點，進一步對漆酶的催化機制進行研究［25］。此外，若想在實際應用中提高LacT-1活性，可以在反應體系中加入一定量的Na+。有研究表明，F(xiàn)e2+有較強的還原性，對漆酶的抑制屬于競爭性抑制，當Fe2+全部被氧化成Fe3+時，漆酶恢復催化作 用［5，26-27］，在以ABTS為底物或介體時，可以利用Fe2+來延緩漆酶的氧化催化進程。

一些常見的化合物如SDS、β-ME、DEAE-2Na、抗壞血酸對LacT-1均有明顯的抑制作用，其中以β-ME、抗壞血酸的抑制作用最為明顯，在1 mmol/L時就可完全抑制漆酶活性，而10 mmol/L SDS也可以完全抑制漆酶活性。當DEAE-2Na濃度為1 mmol/L時，LacT-1活性為89.64%，當濃度提高到10 mmol/L，LacT-1還可剩余61.55%活性；在1 mmol/L的H2O2作用下LacT-1活性提高了23.66%，而同等濃度的H2O2則會抑制Treametes. pubescens MB89漆酶活性的9%［28］；濃度為10 mmol/L的草酸可使LacT-1活性提高3.80%，而該濃度條件下的草酸完全抑制Flammulina velutipes漆酶活性［29］；1 mmol/L TCA可以使LacT-1活性提高11.41%，10 mmol/L TCA則可以提高45.95%，而7.5 mmol/L的TCA可以抑制Bcillus thuringiens漆酶約50%活性［30］。綜上所述，在利用LacT-1進行催化氧化作用時，要特別注意β-ME、SDS、抗壞血酸的存在，在濃度較低的DEAE-2Na、草酸環(huán)境中，LacT-1活性受的影響不是很大，若想提高LacT-1活性，則可以在反應體系中添加適宜濃度的H2O2和TCA。

LacT-1對ABTS的Km為0.075 mmol/L，低于Ganodermatsugae Murr（0.909 mmol/L）［7］，Pleurotuseryngii（0.087 mmol/L）［25］，Pleurotus ostreatus Het- erosis-2（2.1 mmol/L）［5］，高于psathyrella candolleana（0.016 mmol/L）［31］，Armillariella tabescens（0.018 mmol/L）［32］，Km值表示與底物結合的能力，LacT-1對ABTS結合能力較強，為漆酶與ABTS構成介體系統(tǒng)進行實際應用提供了可能。

合成染料具有著色力強、色澤鮮艷、成本低等特點，目前已廣泛應用于紡織、造紙、印刷等行業(yè)，但每年有10%-15%染料以廢水的形式排放［33］，對環(huán)境造成了極大地損壞。本文選擇了甲基橙、酸性紅1、剛果紅、活性黑5、考馬斯里亮藍R250、孔雀石綠、結晶紫、溴酚藍這8種比較常見的染料為降解對象，以ABTS為介體，試驗結果表明，LacT-1對孔雀石綠、結晶紫的降解效果比較突出，降解率分別為95.17%、90.61%，Cerrena unicolor GSM-01［18］漆酶24 h后對孔雀石綠的降解率為86.2%，Cerrena unicolor BBP6［33］漆酶對結晶紫的最大降解率為83.97%，比LacT-1對孔雀石綠、結晶紫的降解效果稍差一些。而LacT-1對甲基橙、酸性紅1、活性黑5、考馬斯亮藍和溴酚藍的降解率均在70%以上，對剛果紅的降解率也有48.59%，說明LacT-1在染料降解領域有比較大的應用潛力。

4 結論

本文所分離純化的漆酶LacT-1活性較高，在溫度為0-30℃保存1 h或pH 5.4-8保存24 h后酶活仍可保持80%以上，大部分金屬離子對其影響不大，TCA對該酶酶活有明顯的促進作用，LacT-1催化ABTS的Km值較低，對孔雀石綠、結晶紫降解率分別為95.17%、90.61%。但本文所采取的分離純化方式仍需進一步改進，在未來的研究中可以進一步優(yōu)化一色齒毛菌的發(fā)酵條件以及漆酶的分離純化方式來獲得高產(chǎn)漆酶，或者還可以對漆酶基因進行調(diào)控或修飾以改善漆酶的酶學性質(zhì)。