范亞朋 芮存 張悅新 陳修貴 陸許可 王帥 張紅 徐楠 王晶 陳超 葉武威

（中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所 棉花生物學國家重點實驗室，安陽 455000）

棉花作為一種重要的自然纖維經(jīng)濟作物在全世界廣泛種植。與其他作物相比，棉花具有一定的耐鹽堿性［1］。鹽堿脅迫是危害農(nóng)作物產(chǎn)量的一個重要因素。據(jù)統(tǒng)計，每年受鹽堿脅迫危害的土地面積大約為8.31 × 109hm2，這個面積還在增加［2］。鹽堿脅迫分為鹽脅迫和堿脅迫，其中鹽脅迫是由NaCl和Na2SO4造成的，堿脅迫是由Na2CO3和NaHCO3造成的。先前的研究主要集中在對于鹽脅迫的研究，對于堿脅迫的研究知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)，堿脅迫比鹽脅迫的危害更嚴重［3］。

鋅指蛋白（ZFPs）是植物中重要的一類蛋白，根據(jù)半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)量和位置可分為不同的種類，包括C2H2、C2HC5、C2C2、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6和 C8［4］。C2H2是ZFPs中的重要一類，植物中第一個C2H2鋅指蛋白是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的［5］。擬南芥C2H2型鋅指蛋白家族包括176個成員，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一［6］。植物C2H2型轉(zhuǎn)錄因子包含了一個保守的QALGGH基序，可以參與識別下游靶基因啟動子中的順式調(diào)控元件［7］。研究發(fā)現(xiàn)，C2H2轉(zhuǎn)錄因子家族在植物的生長、發(fā)育以及非生物脅迫中起著重要的作用［4，8］。在水稻中，C2H2型轉(zhuǎn)錄因子ZFP182參與ABA介導(dǎo)的抗氧化防御系統(tǒng)［9］。在大豆中，兩個C2H2型轉(zhuǎn)錄因子GmZFP1和GmZF1能增強轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和冷脅迫的耐受性［10-11］。在擬南芥中，GmZFP3基因的表達降低了干旱脅迫的耐受性，增加了擬南芥對PEG和ABA的響應(yīng)［12］。ZFP182基因的表達受低溫、干旱和ABA誘導(dǎo)，在煙草和水稻中異源表達該基因可以提高植物對高鹽脅迫的耐性［10］。擬南芥STZ基因有兩個C2H2結(jié)構(gòu)域，其表達受到干旱、低溫、高鹽和ABA誘導(dǎo)。過表達STZ基因能提高擬南芥的抗旱性［13］。在擬南芥中過表達棉花C2H2型鋅指蛋白GhDi19-1、GhDi19-2能增強對高鹽脅迫和ABA的敏感性［14］。棉花中編碼C2H2型鋅指蛋白的基因GhCSTZ在棉花幼苗受到鹽脅迫時表達［15］。

ZAT12基因作為C2H2鋅指蛋白家族的一個成員，研究發(fā)現(xiàn)，其主要參與逆境脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，ZAT12主要與氧化應(yīng)激相關(guān)［16］，ZAT12可以上調(diào)與ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因APX1、ZAT7、WRKY25，同時在擬南芥中，鋅指蛋白Zat12是抗壞血酸過氧化物酶1在氧化應(yīng)激過程中的表達所必需的。在非生物脅迫處理中，ZAT12和APX1的共同表達可以調(diào)控抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）代謝［17］。在擬南芥中，ZAT12在活性氧和非生物脅迫中起核心作用，可以調(diào)節(jié)擬南芥對強光和氧化應(yīng)激反應(yīng)［18］。ZAT12基因能增強抗氧化性，更能適應(yīng)干旱脅迫［19］。另外ZAT12還作為ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個重要的組分，與其他基因相互作用來消除ROS［20］。由此可見，ZAT12基因在逆境脅迫中發(fā)揮了重要的作用。

本研究克隆了一個C2H2家族的基因GhZAT12（Gh_D03G1247.1），利用煙草瞬時表達系統(tǒng)對GhZAT12-GFP融合蛋白進行了亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)其定位于細胞核，通過實時定量PCR技術(shù)分析了GhZAT12在不同部位的表達水平以及在NaHCO3處理下基因表達水平的變化，表明GhZAT12可能在堿脅迫中發(fā)揮重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花材料為陸地棉中9807，由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所抗逆鑒定課題保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理 采用沙培法進行育苗，沙子事先用清水洗去雜質(zhì)并置于120℃烘箱中烘干，棉花種子放置于16 h光照/8 h黑暗的28℃恒溫人工氣候箱30 d。對三葉期棉花幼苗進行125 mmol/L NaHCO3堿脅迫處理，對照為清水處理。

1.2.2 RNA的提取和cDNA的制備 取“三葉一心”期的棉花幼苗的根、莖和葉用于RNA提取和基因克隆。采用北京Aidlab的RN38 EASYspin Plus植物提取試劑盒提取樣品中的RNA，具體步驟見試劑盒說明書。提取到的RNA放置在-80℃超低溫冰箱中保存。使用Thermo SCIENTIFIC的RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒制備cDNA，具體步驟見說明書，制備好的cNDA-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 GhZAT12基因的克隆 從cottonFGD數(shù)據(jù)庫中下載GhZAT12的序列信息，用Primer 5軟件設(shè)計基因全長引物，分別命名為GhZAT12-F和GhZAT12-R（表1），引物預(yù)期長度為474 bp。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版，用Vazyme的2×Phanta Max Master Mix擴增GhZAT12全長mRNA序列。PCR程序設(shè)定如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 20 s；56℃ 15 s；72℃ 90 s；34個循環(huán)；72℃ 10 min。4℃保存。獲得的PCR產(chǎn)物使用Magen的HiPure Gel Pure DNA Kits進行膠回收，膠回收產(chǎn)物與連到Peasy-Blunt Cloning Vector載體上，并采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell。挑取白色陽性克隆接種于含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37℃培養(yǎng)6 h左右，用M13 Forward Primer 和M13 Reverse Primer對陽性克隆進行PCR檢測，正確的菌液用M13F引物測序。對測序結(jié)果進行分析，提取質(zhì)粒獲得克隆載體GhZAT12-T。

表1 實驗所用引物Table 1 Primer pairs used in the experiments

1.2.4 GhZAT12基因序列的生物信息學分析 使用在線分析軟件Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）分析GhZAT12蛋白的理化性質(zhì)。使用ProScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析GhZAT12蛋白的親疏水性。使用SignalP（https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/） 分 析GhZAT12蛋白的信號肽。使用NetPhos3.1（https://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）來預(yù)測GhZAT12蛋白的磷酸化位點。使用TMHMM v2.0（https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用SOPMA對GhZAT12蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。使用Swiss-Model Workspace對蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。利用WoLF PSORT 軟件（https://wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2.5 實時熒光定量PCR 以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進行熒光定量實驗。引物序列見表1。所用試劑盒為北京全式金的TransStart Top Green qPCR SuperMix，qRT-PCR所用設(shè)備為Applied Biosystems@7500 Fast。每個反應(yīng)中包含100 ng cDNA，引物（10 μmol/L）0.4 μL，SuperMix 10 μL，PassiveDye 0.4 μL，加ddH2O至20 μL。擴增程序為94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸34 s，40個循環(huán)。實驗組（3個生物學重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù)）與對照組相對差異倍數(shù)計算利用2-ΔΔCt法［21］。

1.2.6 GhZAT12亞 細 胞 定 位 煙 草（Nicotiana tabacum L.）種子用0.5%的次氯酸鈉浸泡消毒10 min，再用滅菌ddH2O清洗5-7次。將種子均勻點播于1/2 MS培養(yǎng)基上，25℃，16 h光照/8 h黑暗條件培養(yǎng)。待培養(yǎng)基上的煙草長出兩片子葉，將其移栽至營養(yǎng)土中，繼續(xù)培養(yǎng)，至5-7片真葉。取適量活化后的含有目的基因的亞細胞定位載體的農(nóng)桿菌加入到含有卡那霉素（50 mg/L）和利福平（25 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=1.0左右。離心收集菌液并用重懸液重懸菌體。侵染后，先將煙草避光培養(yǎng)24 h，再正常培養(yǎng)。3 d后，在煙草葉片注射部位附近，撕下表皮，使用激光共聚焦觀察綠色熒光，確定靶標蛋白表達部位。使用DNAMAN構(gòu)建亞細胞定位引物，酶切位點為Xba I和Kpn I，引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1 GhZAT12的克隆

以陸地棉品種中9807cDNA為模板，擴增陸地棉GhZAT12基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）并進行測序。結(jié)果顯示GhZAT12的ORF全長為474 bp，編碼157個氨基酸（圖1）。

圖 1 GhZAT12的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoretic analysis of PCR product of GhZAT12

2.2 GhZAT12基因的多重序列對比與進化樹分析

在NCBI中通過blastp對GhZAT12基因進行同源性比對，找到了與GhZAT12基因同源性最高的其他物種的14個蛋白序列。通過DNAMAN軟件進行多重序列比對分析（圖2），結(jié)果顯示GhZAT12的N端第11-19位氨基酸含有保守的L-BOX，序列為DMANCLMLL。同時在第35-55、80-100位氨基酸還含有兩個保守的鋅指結(jié)構(gòu)Zinc Finger Motif，序列分別為CKTCDKKFSSFQALGGHRASH和CSICGLEFAIG QALGGHMRRH。在C端第129-136位氨基酸有一個核心的EAR-motif，序列為LDLSLTSW。在GhZAT12的鋅指結(jié)構(gòu)中含有保守的QALGGH序列，表明GhZAT12可能是C2H2型轉(zhuǎn)錄因子。以往的研究發(fā)現(xiàn)，QALGGH序列可能與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力有關(guān)［22］。GhZAT12蛋白與其他物種的蛋白序列之間的序列相似度比較高，說明該蛋白在進化上比較保守。為了進一步研究ZAT12在不同物種的進化關(guān)系，利用MEGA7.0軟件鄰接法構(gòu)建進化樹（圖3）。分析表明，15個物種的ZAT12蛋白可分為4大類，陸地棉與海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉的親緣關(guān)系較近，陸地棉與可可的親緣關(guān)系較近，這與前人的研究相一致［23］。

圖2 GhZAT12蛋白同源氨基酸序列多重比對Fig.2 Multiple sequence alignment of homologous amino acids in GhZAT12 protein

圖3 不同物種中ZAT12同源蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of ZAT12 homologous proteins in different species

2.3 GhZAT12蛋白的理化性質(zhì)分析

通過Protparam網(wǎng)站分析，GhZAT12的分子式為C736H1205N219O223S12，分子量為17.074 kD，理論等電點為8.57，19個帶負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu），22個帶正電殘基總數(shù)（Arg + Lys），因此該蛋白帶正電，預(yù)測該蛋白為酸性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為31.74，脂肪系數(shù)為80.13，親疏水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.296，表示該蛋白是親水蛋白。亮氨酸（Leu）含量最高為11.5%，谷氨酰胺（Gln）的含量最低為1.9%。

2.4 GhZAT12蛋白的親疏水性分析

使用ProScale對GhZAT12蛋白的親/疏水性進行預(yù)測（圖4），結(jié)果表明，GhZAT12蛋白在55位S親水性最小分值為-2.578，在86位F疏水性最大分值是1.733，推測在蛋白序列中親水性氨基酸數(shù)量大于疏水性氨基酸，因此GhZAT12蛋白是一種親水蛋白。

圖4 GhZAT12蛋白親/疏水性分析Fig.4 Hydrophilic/hydrophobic analysis of GhZAT12 protein

2.5 GhZAT12蛋白的信號肽預(yù)測和磷酸化位點 分析

通過SignalP來預(yù)測GhZAT12的信號肽，發(fā)現(xiàn)GhZAT12不存在信號肽（圖5）。通過NetPhos 3.1對GhZAT12的磷酸化位點進行預(yù)測（圖6）。結(jié)果顯示，絲氨酸Ser位點有5個，蘇氨酸Thr位點有2個，酪氨酸Tyr位點有0個。

圖5 GhZAT12蛋白的信號肽分析Fig.5 Signal peptide analysis of GhZAT12 protein

圖6 陸地棉GhZAT12蛋白磷酸化位點分析Fig.6 Phosphorylation site analysis of GhZAT12 protein of G. hirsutum L.

2.6 GhZAT12蛋白的跨膜分析

通過TMHMM網(wǎng)站對GhZAT12蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析（圖7），結(jié)果表明，GhZAT12沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。在使用SignalP對信號肽進行預(yù)測的時候，發(fā)現(xiàn)Signal peptide probability為0.017 6，other值為0.982 4，表明GhZAT12蛋白無信號肽，因此認為該蛋白為非分泌型蛋白。

圖7 陸地棉GhZAT12蛋白跨膜螺旋預(yù)測Fig.7 Transmembrane helical projections of GhZAT12 protein of G. hirsutum L.

2.7 GhZAT12蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA對GhZAT12蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測（圖8），共有6個α螺旋結(jié)構(gòu)包含37個氨基酸殘基，占總氨基酸數(shù)的23.57%，無規(guī)則卷曲包含88個氨基酸占56.05%，6個鏈狀延伸鏈，包含29個氨基酸，占18.47%。使用Swiss-Model Workspace對GhZAT12蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，從圖中可知，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致（圖9）。

圖8 GhZAT12蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Secondary structure prediction of GhZAT12 protein

圖9 GhZAT12蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Tertiary structure prediction of GhZAT12 protein

2.8 GhZAT12蛋白的亞細胞定位分析

為了研究GhZAT12蛋白的亞細胞定位，構(gòu)建了GhZAT12-GFP載體。通過對煙草葉片注射GhZAT12-GFP融合蛋白的方法來進行實驗。同時以GFP空載的融合蛋白作為對照。注射葉片3 d后，利用熒光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的位置。結(jié)果（圖10）顯示，GFP空載在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布，GhZAT12-GFP只分布在細胞核中。結(jié)果表明GhZAT12蛋白定位在細胞核中。

圖10 GhZAT12在煙草葉片中的亞細胞定位Fig.10 Subcellular localization of GhZAT12 in tobacco leaves

2.9 GhZAT12的組織表達特異性分析

為了研究GhZAT12基因的組織表達模式，對三葉期的棉花幼苗的根、莖、葉進行了實時定量PCR。結(jié)果（圖11-A）顯示，GhZAT12在根莖葉中均檢測到信號，但其表達量存在顯著差異。GhZAT12在根中的表達量最高；其次是葉，在莖中的表達量最低。

為了研究GhZAT12基因在堿脅迫下的表達分析，通過對三葉期的棉花幼苗進行125 mmol/L的NaHCO3堿脅迫，通過實時定量PCR分析，結(jié)果表明，堿脅迫對GhZAT12的表達具有明顯的誘導(dǎo)作用，但在根、莖、葉中的表達模式略有不同。根和葉的基因表達先上升后下降，莖部的表達先下降再上升，在處理時間6 h時表達量最低，當處理時間延長至24 h時達到最高（圖11-B）。結(jié)果表明，GhZAT12基因受堿脅迫誘導(dǎo)，可能在棉花對堿脅迫應(yīng)答中起重要作用。

圖11 棉花GhZAT12基因在不同組織不同堿脅迫時間的相對表達量Fig.11 Relative expressions of GhZAT12 gene in different tissues and different times of alkaline stress in G. hirsutum L.

3 討論

棉花是鹽堿地的先鋒作物，具有一定的耐鹽堿性。隨著全球土壤鹽堿化的日益嚴重，因此研究非生物脅迫機制對于培育棉花耐鹽堿脅迫新材料具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫信號通路的主要調(diào)控因子［24］。在棉花中已經(jīng)報道過許多與逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如bZIPs［25］，WRKYs［26-28］，MYBs［24］等。先前關(guān)于C2H2轉(zhuǎn)錄因子在棉花中主要參與一些逆境脅迫。GhSTOP1基因在棉花中對鋁、質(zhì)子脅迫以及根系發(fā)育中起了重要的作用［29］。棉花中GhSIZ1基因可能在響應(yīng)低溫、高鹽、干旱等非生物脅迫中起著重要的作用［22］。棉花中的GhBsr-d1Ls基因可能在響應(yīng)大麗輪枝菌脅迫時起重要的作用［30］。

本研究以陸地棉中9807為研究材料，克隆了GhZAT12基因的編碼區(qū)序列。對GhZAT12蛋白的理化性質(zhì)、生物信息學信息、亞細胞定位進行了分析。GhZAT12是一個編碼157個氨基酸的親水蛋白質(zhì)。亞細胞定位在細胞核內(nèi)，沒有信號肽。磷酸化位點分析顯示，GhZAT12蛋白中絲氨酸位點有5個，蘇氨酸位點有2個，酪氨酸位點有0個。同時又對棉花和其他物種中ZAT12蛋白進行了序列比對和進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棉花與可可的親緣關(guān)系較近，這與前人的研究相一致。在GhZAT12中有幾個保守結(jié)構(gòu)域，在N端有一個保守的L-BOX，序列為DMANCLMLL，該結(jié)構(gòu)可能與蛋白質(zhì)互作有關(guān)［31］。在N端還有一個保守的EAR-Motif，序列為LDLSLTSW。以往的研究表明含有EAR-Motif的鋅指蛋白能夠激活下游基因的表達［32］，如水稻中發(fā)現(xiàn)的ART1基因［33］和小鹽芥中發(fā)現(xiàn)的ThZF1基因［34］。但是研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的蛋白卻具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，如擬南芥AZF1、AZF2、STZ/ZAT10等［35］。本實驗中GhZAT12基因是否對下游基因的表達起調(diào)控作用，是否具有轉(zhuǎn)錄激活或者抑制作用有待進一步的驗證。

除了鹽、干旱和生物脅迫之外，堿脅迫是危害作物生長的一個重要的非生物脅迫因素。研究發(fā)現(xiàn)MsCBL4在根中的表達量最高，并由鹽和鹽堿脅迫（NaHCO3）誘導(dǎo)，鹽堿脅迫更能誘導(dǎo)MsCBL4的表達［36］。Ca2+傳感器SCaBP3/CBL7調(diào)節(jié)質(zhì)膜H+-ATP酶活性，促進擬南芥耐堿能力［37］。SsMT2基因在除花外的所有器官中均有表達，并且在CdCl2、NaCl、NaHCO3和H2O2處理下均能誘導(dǎo)SsMT2基因表達［2］。棉花中耐堿的研究目前還鮮有報道，Zhang等［38］通過對不同鹽堿脅迫下的棉花進行轉(zhuǎn)錄組分析，初步揭示了棉花鹽堿差異。因此分析棉花C2H2型轉(zhuǎn)錄因子在堿脅迫下的表達模式，有利于拓寬了解棉花C2H2型轉(zhuǎn)錄因子的鹽堿作用機制。

對ZAT12目前并沒有耐堿脅迫的相關(guān)研究，在水稻中，OsZAT12的表達具有明顯的組織特異性，在根部表達量較高，而在莖、葉、劍葉、穗和殼中幾乎沒有表達［39］。本研究發(fā)現(xiàn)GhZAT12基因在根、莖、葉中均有表達，在根和葉中的表達量較高，在莖中的表達量較低，具有明顯的組織表達特異性。對堿脅迫下不同時間段GhZAT12基因表達進行了熒光定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿脅迫下GhZAT12基因在根、莖、葉中的表達量隨處理時間的不同而改變，這說明GhZAT12基因受堿脅迫的調(diào)控。本研究對GhZAT12基因進行初步的克隆和表達模式分析，為以后進一步研究基因的功能提供一定的參考。

4 結(jié)論

從陸地棉中克隆出了脅迫誘導(dǎo)基因GhZAT12，含474 bp的開放閱讀框，編碼157個氨基酸。亞細胞定位顯示GhZAT12蛋白定位在細胞核。GhZAT12基因受堿脅迫的誘導(dǎo)，具有明顯的組織表達特異性。