劉媛媛 楊冬杰 左東云 程海亮 張友平 呂麗敏 王巧連 宋國立

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽 455000）

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉纖維品質(zhì)的好壞直接關(guān)系到其經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和使用價值。因此，篩選出棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因，研究不同類型的相關(guān)基因在棉纖維發(fā)育中的作用，對纖維品質(zhì)改良具有重要意義。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STPK）在細(xì)胞代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞的生長分化及逆境脅迫響應(yīng)方面［1］發(fā)揮重要作用。了解STPK在棉纖維發(fā)育中的作用，研究他們的表達(dá)特征將為棉纖維形成的遺傳機(jī)制提供更寬廣的理論基礎(chǔ)。

STPK的活性中心由11個保守的亞結(jié)構(gòu)域組成，通過結(jié)合ATP及Mg2+，可以轉(zhuǎn)移ATP的可-磷酸到絲氨酸蘇氨酸的羥基上。該活性中心由2個區(qū)（N端區(qū)域和C端區(qū)域）及二者之間的Linker（位于亞結(jié)構(gòu)域V）組成［2］。亞結(jié)構(gòu)域Ⅰ，序列特征為：GxGxxG，是ATP結(jié)合的位點(diǎn)；亞結(jié)構(gòu)域Ⅱ中的賴氨酸（K）用于磷酸基的轉(zhuǎn)移［3］；亞結(jié)構(gòu)域Ⅵ（序列特征為：DLKPEN）中的天冬氨酸（D），可以通過Mg2+鹽橋與ATP相互作用；位于近C端的亞結(jié)構(gòu)域Ⅶ、Ⅷ為STPK的重要活性位點(diǎn)。亞結(jié)構(gòu)域Ⅶ作為Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，其序列特征為：DFD（天冬氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸）或DFG（天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸）；亞結(jié)構(gòu)域Ⅷ中高度保守的APE序列可以作為蛋白激酶活性位點(diǎn)的標(biāo)志序列；亞結(jié)構(gòu)域Ⅷ緊鄰N端有一個T-loop，其保守序列為：SxSFVGTxEY。研究表明T-loop的磷酸化導(dǎo)致α-C helix構(gòu)象的改變，從而使激酶處在穩(wěn)定的開放狀態(tài)用于與受體結(jié)合。亞結(jié)構(gòu)域Ⅶ和Ⅷ活性位點(diǎn)間的氨基酸數(shù)目不定、相似性不高，屬于T-loop及Mg2+結(jié)合Loop之間的插入序列［4］。Linker區(qū)域作為連接體，可通過C、N兩端間一定程度的旋轉(zhuǎn)，控制ATP結(jié)合口袋的開關(guān)［5］。

作為最主要的一類蛋白激酶，STPK又可以分為CaMK（鈣調(diào)依賴蛋白激酶）組、CMGC（包括絲裂原活化蛋白激酶-MAPK、周期素依賴蛋白激酶-CDK）組和AGC組［6］。其中，AGC組又可以分為5個亞組，AGC Ⅷ、AGC Ⅶ、AGC Ⅵ、AGC other 和PDK1［7］。D6PKs（D6PK，D6PKL1-D6PKL3）則屬于AGC Ⅷ亞組的成員［8］。研究表明，AGC Ⅷ在Ⅶ亞結(jié)構(gòu)域處為真核生物中特有的DFD序列，而非真核生物外的其他激酶類型為DFG序列［6］；擬南芥基因組中有23個AGC Ⅷ激酶基因［9］。這些激酶中有和生長素運(yùn)輸相關(guān)的，有和依賴生長素運(yùn)輸?shù)陌l(fā)育進(jìn)程相關(guān)的：向光素phot1和phot2是一類藍(lán)光受體［10］，在子葉節(jié)向光性彎曲中發(fā)揮一定作用［11］；WAG1或WAG2過表達(dá)后，植物表現(xiàn)出根尖部位PIN蛋白的大量聚集，影響擬南芥根的發(fā)育［12］；PINOID（PID）受PDK1的磷酸化作用而被激活，而后通過進(jìn)一步磷酸化生長素運(yùn)輸載體PIN蛋白，參與生長素的極性運(yùn)輸和分布［13］。AGC1.5和AGC1.7影響花粉管的定向生長［14］；UCN（AGC2-3），通過與轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)控珠被發(fā)育等的極性平面生長過程［15］；D6PKs家 族（D6PK、D6PKL1、D6PKL2、D6PKL3）主要通過磷酸化PIN參與擬南芥生長素運(yùn)輸［8］及子葉節(jié)的向光性等過程［16］。另外，AGC Ⅷ蛋白激酶在其他生長發(fā)育進(jìn)程中的作用也在陸續(xù)研究和報道中。蕃茄AGC1激酶基因——Adi3為哺乳動物中Akt/PKB的同源基因，2個基因的編碼蛋白均負(fù)調(diào)控細(xì)胞的程序性死亡［17］。類病毒誘導(dǎo)的蛋白激酶（protein kinase- viroid induced，PKV）屬于AGC Ⅷ蛋白激酶，蕃茄過表達(dá)該激酶基因，影響維管組織發(fā)育、根的形態(tài)建成，使植株表現(xiàn)出生長遲緩、不育等生長狀態(tài)［18］。擬南芥AGC1-4激酶基因通過調(diào)控細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)育，進(jìn)而調(diào)控種子大?。?9］。

盡管AGC Ⅷ蛋白激酶在植物生長發(fā)育中發(fā)揮一定作用，但該類基因在棉纖維生長發(fā)育階段中的作用所知甚少，該激酶信號通路是否參與調(diào)控棉纖維的各發(fā)育階段還有待研究。

本研究分析GhD6PKL2在棉纖維不同發(fā)育時期的表達(dá)量情況；通過過表達(dá)轉(zhuǎn)化擬南芥，觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥表型性狀并推測其可能的功能。為更好地理解STPK蛋白激酶在擬南芥表皮毛、根的生長發(fā)育，以及棉纖維發(fā)育機(jī)制方面提供新的可借鑒信息，為棉纖維發(fā)育理論奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1、哥倫比亞野生型擬南芥及本氏煙草；菌株：DH5a、LBA4404以及Y2H Gold；所用到的限制性內(nèi)切酶如Sal I、EcoR I、BamH I等購買于TOYOBO公司；重組酶如Exnase II等購買于鄭州威展生物公司；RNA提取試劑盒購買于天根公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑及定量PCR所需的熒光染料試劑購買于abm公司；膠回收試劑盒購買于QIAGEN公司。植物表達(dá)載體pRI101由棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及cDNA的合成 分別對陸地棉TM-1不同發(fā)育時期（-3、-1、0、1、3、5、7、10、15、20和30 d）的胚珠或棉纖維進(jìn)行取樣，采用TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit（DP441）多糖多酚植物總RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取。根據(jù)5×All-In-One RT MasterMix（abm）試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，獲得的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GhD6PKL2的克隆及生物信息學(xué)分析 本研究篩選了一個STPK中AGC VIII蛋白激酶家族成員，命名為GhD6PKL2。以TM-1開花后3 d胚珠cDNA為模板，設(shè)計擴(kuò)增引物（表1）克隆目的基因。使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對分析；使用GSDS2. 0（https://gsds. cbi. pku.edu. cn/）在線軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；使用NCBI的CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）程序進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測；利 用ExPASy- Protparam（https://web.expasy.org/cgi-bin/ protparam/protparam）程序進(jìn)行預(yù)測蛋白的理化性質(zhì)及親水性/疏水性分析。利用TMHMM2. 0 SERVER（https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線進(jìn)行蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用人工網(wǎng)絡(luò)神經(jīng) 算 法SignalP5. 0（https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對其信號肽進(jìn)行預(yù)測；最后使用NetPhos3. 1（https://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）程序進(jìn)行預(yù)測蛋白的磷酸位點(diǎn)分析。

1.2.3 GhD6PKL2的表達(dá)模式分析 以不同發(fā)育時期的棉纖維cDNA為模板，利用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ（Perfect Real Time）試劑盒及Bio- Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共44個循環(huán)；65℃ 5 s；95℃ 15 s；60℃ 15 s。每個樣品同時進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。用2-ΔΔCt相對定量法，以Histone 3（AF024716）［20］為內(nèi)參基因（表1），分析目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 GhD6PKL2的亞細(xì)胞定位 利用同源重組方法，構(gòu)建pRI101-GhD6PKL2-GFP亞細(xì)胞定位載體。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后注射煙草葉片，2-4 d后通過激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8 STED 3X）觀察GFP熒光在細(xì)胞中的定位分布情況。

1.2.5 GhD6PKL2的轉(zhuǎn)錄活性分析 將構(gòu)建的誘餌蛋白表達(dá)載體pGBKT7-GhD6PKL2分別涂布于SDtrp、SD-trp/X-α- gal以及SD- trp/X- α- gal/AbA培養(yǎng)基上；同時涂布陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T）和陰性對照（pGBKT7-Lam和pGADT7-T）于SD-trpleu/X-α-gal培養(yǎng)基；涂布空載體pGBKT7于SD-trp培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)2-5 d至各培養(yǎng)基長出明顯菌落，觀察各菌落生長狀態(tài)。

1.2.6 GhD6PKL2的過表達(dá)轉(zhuǎn)化擬南芥 將GhD6PKL2的ORF構(gòu)建到含35S啟動子的pRI101載體上，利用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)及浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過卡那霉素篩選及分子檢測、RT- PCR及Actin（鑒定檢測引物見附表1）的鑒定，獲得目的基因較穩(wěn)定遺傳的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，觀察其根生長情況，并用體式顯微鏡觀察其表皮毛表型，進(jìn)一步推測該基因可能的功能。

表1 本研究所用到的引物列表Table1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 GhD6PKL2的克隆及序列分析

從陸地棉TM-1中克隆GhD6PKL2，其全長3 578 bp，含有1個內(nèi)含子（圖1-A），CDS長度為1 362 bp，編碼453個氨基酸。CDD程序預(yù)測GhD6PKL2蛋白序列的71-434位氨基酸處存在STPK活性位點(diǎn)；多重序列比對結(jié)果（圖1-B）同時驗(yàn)證顯示，GhD6PKL2核苷酸序列中存在11個STPK家族典型的活性位點(diǎn)。上述結(jié)果表明，GhD6PKL2屬于STPK家族成員。ExPASy-Protparam分析顯示，該蛋白理論的相對分子質(zhì)量為49.74 kD，等電點(diǎn)為6.17，蛋白質(zhì)可能的分子式為C2223H3463N595O667S17，預(yù)測脂肪酸系數(shù)為78.98，總平均親水性為-0.257（正值為疏水，負(fù)值為親水）；在GhD6PKL2編碼的453個氨基酸中，47個為正電荷（Arg+Lys）氨基酸，53個為負(fù)電荷（Asp+Glu）氨基酸，不穩(wěn)定系數(shù)為53.14＞40。說明GhD6PKL2可能是一個不穩(wěn)定的、酸性親水蛋白。TMHMM2. 0 SERVER程序預(yù)測GhD6PKL2不存在跨膜結(jié)構(gòu)，為胞外蛋白（圖1）。利用人工網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)算法SignalP5. 0的默認(rèn)參數(shù)，預(yù)測到該蛋白N端1-70個氨基酸中不存在信號肽。使用NetPhos3.1進(jìn)行GhD6PKL2磷酸位點(diǎn)分析（圖2），預(yù)測結(jié)果顯示目的蛋白可能含有42個絲氨酸、14個蘇氨酸、2個酪氨酸，并且絲氨酸蘇氨酸磷酸化可能的位點(diǎn)多預(yù)測在N端（0-60氨基酸）序列處，推測該激酶基因可能通過這些磷酸化位點(diǎn)處發(fā)生的磷酸化作用，參與調(diào)控了棉纖維生長發(fā)育的生理生化過程。

圖1 GhD6PKL2序列分析及蛋白比對Fig.1 Analysis of the GhD6PKL2 sequence and protein sequence alignment

圖2 GhD6PKL2蛋白的磷酸位點(diǎn)預(yù)測Fig.2 Pridiction of phosphorylation sites in GhD6PKL2

2.2 GhD6PKL2在不同發(fā)育時期的表達(dá)模式分析

qRT-RCR分析GhD6PKL2在不同發(fā)育時期的相對表達(dá)量（圖3），GhD6PKL2在開花前3 d到開花后5 d的表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，開花后10-20 d時表達(dá)量顯著升高，并在20 d時表達(dá)量達(dá)到最大值，而開花后30 d時表達(dá)量則呈現(xiàn)顯著下降狀態(tài)。該表達(dá)趨勢與棉花纖維伸長與細(xì)胞壁加厚階段發(fā)育情況相吻合，推測GhD6PKL2可能參與棉花纖維伸長與細(xì)胞壁加厚階段的發(fā)育。

圖3 GhD6PKL2在棉纖維各發(fā)育時期的相對表達(dá)分析Fig.3 Relative expression level of GhD6PKL2 in different periods at cotton fiber development

2.3 GhD6PKL2的亞細(xì)胞定位

在線預(yù)測軟件software softberry（https:// www. softberry. com/ berry. Phtm）顯示GhD6PKL2定位在細(xì)胞膜上。通過將構(gòu)建好的pRI101-GhD6PKL2-GFP載體注射煙草葉片發(fā)現(xiàn)，GFP熒光在細(xì)胞中的發(fā)光部位，表明GhD6PKL2確實(shí)定位在細(xì)胞膜上（圖4）。推測GhD6PKL2蛋白激酶的膜定位結(jié)果，可能與其在細(xì)胞膜上發(fā)揮其激酶作用相關(guān)。

圖4 GhD6PKL2的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of GhD6PKL2

2.4 GhD6PKL2的轉(zhuǎn)錄活性檢測

通過培養(yǎng)，在SD-trp-leu/X-α-gal培養(yǎng)基上的陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T）出現(xiàn)藍(lán)色菌斑，陰性對照（pGBKT7- Lam和pGADT7-T）出現(xiàn)白色菌斑；在SD-trp培養(yǎng)基上的空白對照PGADT7-T及誘餌載體pGBKT7-GhD6PKL2均呈現(xiàn)白色菌斑。進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)誘餌載體pGBKT7-GhD6PKL2在SD-trp/X-α-gal及SD-trp/ X-α-gal/AbA培養(yǎng)基上都呈現(xiàn)白色均勻分散的酵母單克隆菌斑，沒有出現(xiàn)藍(lán)色菌斑（圖5），說明構(gòu)建的GhD6PKL2的誘餌載體pGBKT7-GhD6PKL2不存在自激活情況。同時，誘餌載體pGBKT7- GhD6PKL2在SD-trp培養(yǎng)基中呈現(xiàn)的酵母單克隆菌株大小與攜帶空載體的pGBKT7相差不多，基本判斷pGBKT7-GhD6PKL2對酵母細(xì)胞無毒性。以上結(jié)果表明構(gòu)建的pGBKT7-GhD6PKL2誘餌載體可以繼續(xù)下一步的互作蛋白的篩選驗(yàn)證工作。

圖5 GhD6PKL2誘餌載體自激活的檢測Fig.5 Detection of transcriptional activity of GhD6PKL2

2.5 轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥的分子鑒定

共得到20株T1轉(zhuǎn)基因植株，編號為D6PKL2-1、D6PKL2-2…D6PKL2-20。選擇其中的2個株系D6PKL2-1、D6PKL2-2的T3植株用于分子鑒定（圖6）。所有擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期完全一樣，表明GhD6PKL2已經(jīng)整合到擬南芥的基因組DNA中，并且能夠在擬南芥植株中表達(dá)形成轉(zhuǎn)錄本。

圖6 轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥的分子鑒定Fig.6 PCR and RT- PCR analysis of the GhD6PKL2 transgenic plants

2.6 轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥表皮毛表型

利用體視顯微鏡觀察T3代轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥與野生型擬南芥表皮毛生長情況。選擇生長天數(shù)相同、生長狀態(tài)相近及葉片面積基本一致的T3代D6PKL2的3個株系，比較及分析后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥表皮毛出現(xiàn)較野生型擬南芥表皮毛顯著增多的表型（圖7）。推測GhD6PKL2在擬南芥表皮毛發(fā)生及生長發(fā)育中可能起到促進(jìn)作用。

圖7 轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥葉片表皮毛的表型Fig.7 Phynotype of Arabidopsis trichome between GhD6PKL2 trans-genic plants and wide type

2.7 轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥根的表型

萌發(fā)野生型擬南芥（點(diǎn)種于MS培養(yǎng)基）及T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子（點(diǎn)種于含卡那的MS培養(yǎng)基），至種子剛伸展開2片子葉時（大約萌發(fā)后5 d），移入同一皿不加抗生素的、新鮮MS培養(yǎng)基中繼續(xù)生長（圖8-A，左邊6株為野生型，右邊6株為轉(zhuǎn)基因擬南 芥）。7 d后觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥表現(xiàn)出主根長度顯著變短、同時側(cè)根數(shù)目明顯變多的性狀（圖8）；除此之外的其他表型（如生長快慢、植株大小、葉色、根毛等）在觀察時沒有明顯差異。說明GhD6PKL2可能還參與擬南芥主根伸長、側(cè)根發(fā)育的過程。

圖8 轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥根的表型Fig.8 Phenotype of Arabidopsis main root between GhD6PKL2 trans-genic plants and wide type

3 討論

棉纖維是由胚珠表皮分化、生長而形成的不分支單細(xì)胞，與擬南芥葉片表皮毛、根毛同屬于植物腺毛體。研究表明棉花和擬南芥在腺毛體的發(fā)育調(diào)控機(jī)制方面非常相似［21-23］。GaMYB2能使gl1無表皮毛突變體恢復(fù)表皮毛表型，證明該基因參與了表皮毛的分化調(diào)控［24］。擬南芥過表達(dá)GhMYB2能使轉(zhuǎn)基因擬南芥種子表現(xiàn)出類似于棉花纖維的種皮毛［25］。表明棉纖維與擬南芥確實(shí)存在相似的腺毛體發(fā)育機(jī)制。

GhD6PKL2屬于STPK中AGC VIII亞族- D6PKs的成員。目前對D6PKs的功能也進(jìn)行了一定的研究。D6PK在側(cè)根起始位點(diǎn)強(qiáng)烈高表達(dá)，d6pk突變體在側(cè)根起始、根的向重力性及腋芽分化等性狀上明顯減弱，表現(xiàn)出和生長素運(yùn)輸量減少的一致表型。研究報導(dǎo)D6PK和生長素運(yùn)輸載體PIN蛋白存在互作，二者同時極性共定位在細(xì)胞膜上，因此得出D6PK通過直接磷酸化PIN蛋白參與生長素的運(yùn) 輸［8，26］。通過對生長素極性運(yùn)輸過程的調(diào)控，D6PK也陸續(xù)被報道有影響子葉節(jié)向光性彎曲［27］及頂端彎曲［28］等作用。有研究表明，該基因在根毛細(xì)胞凸起中發(fā)揮平面極性作用［29］。除此之外，D6PKL3為該亞家族中分化最大的成員（和該家族中其他3個成員的相似性為60%），在花粉孔徑形成中也發(fā)揮一 定作用［30］。

通過氨基酸的序列比對，GhD6PKL2與陸地棉中注釋為STPK-D6PKL2- L（XP_ 016753337. 1）的蛋白有最高相似性（為97.57%），與擬南芥中注釋為AGC1-12（At3g44610）的蛋白相似性為72.41%，可以發(fā)現(xiàn)上述2個相似性較高的蛋白均屬于AGC VIII亞族。同時該基因亞結(jié)構(gòu)域VII的序列特征為DFD，表明GhD6PKL2為一個AGC VIII亞族成員。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，VII和VIII亞結(jié)構(gòu)域附近還存在3個S/TxxxxxS/T序列，該序列為STPK中絲裂原活化蛋白激酶的激酶（MAPKK）在植物中保守的特征序列［31］。因此，通過進(jìn)一步和擬南芥MAPKK2（UniProtKB/ Swiss- Prot：O80396. 1）進(jìn)行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)二者僅存在14.29%的相似性。因此GhD6PKL2非MAPKK成員，確定為一個AGC VIII亞族成員。

亞細(xì)胞定位特征在一定程度上可以預(yù)測基因可能的功能。植物AGC激酶特有的VII和VIII活性位點(diǎn)間存在一段氨基酸插入數(shù)目可變的序列［6-7］，這段無規(guī)律的插入序列已經(jīng)陸續(xù)被報道出對激酶的定位有重要影響［4］：擬南芥中AGC VIII激酶的AGC3亞組成員PID，其VII和VIII之間的插入序列與其細(xì)胞膜定位相聯(lián)系［32］；ADI3是與D6PK相聯(lián)系的AGC激酶成員，具有核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙定位現(xiàn)象［33］。植物特有的AGC VIII激酶亞族的這段插入序列由36-118個氨基酸組成［4］，本研究中GhD6PKL2的VII和VIII間確實(shí)存在一段100左右的大插入片段。許多研究結(jié)果還表明，磷脂的識別作用是AGC VIII亞族大多數(shù)成員極性定位在細(xì)胞膜上的一個重要特性［29］。最近的研究結(jié)果也表明，AGC激酶家族重要成員PDK1的細(xì)胞膜定位，取決于細(xì)胞膜上磷脂的積累，在生長素處理時可以促進(jìn)細(xì)胞膜對PDK1的招募［34］。本研究表明GhD6PKL2也為一個細(xì)胞膜定位基因。該結(jié)果和軟件預(yù)測定位結(jié)果一致，推測：作為磷酸化生長素運(yùn)輸載體-PIN蛋白的重要激酶，D6PK及許多AGC VIII家族成員是通過其VII和VIII之間的插入序列、特異性地識別細(xì)胞膜上磷脂類分子而在細(xì)胞膜上發(fā)揮一定的作用。

生長素是植物體內(nèi)重要的激素，PIN蛋白則是生長素運(yùn)輸過程中最重要的載體。棉花中克隆出的PIN基因，在棉纖維起始階段發(fā)揮顯著促進(jìn)作用［35］。許多研究表明PIN蛋白介導(dǎo)的生長素運(yùn)輸過程依賴于蛋白激酶的磷酸化作用［36］，其中，AGC激酶家族成員在磷酸化PIN蛋白進(jìn)而調(diào)控生長素的極性運(yùn)輸和分布方面具有較顯著作用［37］。轉(zhuǎn)GhD6PKL2擬南芥較野生型出現(xiàn)了表皮毛數(shù)目增多的表型性狀，初步表明擬南芥中過表達(dá)該基因，對擬南芥表皮毛發(fā)育起正調(diào)控作用。由于STPK及AGC等激酶基因在棉纖維發(fā)育中的研究還是相對較少，該類蛋白激酶在棉纖維發(fā)育通路中的具體調(diào)控機(jī)制更是不清楚，只能根據(jù)該基因所在家族中其他成員已經(jīng)相對研究清楚的功能、進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥表型的可能機(jī)制的推測。故結(jié)合GhD6PKL2所在的AGC激酶家族中成員的主要生理作用，可以大膽推測：擬南芥表皮毛數(shù)量的增多，和過量表達(dá)的GhD6PKL2可能會加快磷酸化生長素運(yùn)輸載體PIN蛋白的運(yùn)輸活性和速率［8，26-27］有關(guān)?；诖?，可以引用Tan等［38］根據(jù)哺乳動物中PDK1-AKT信號通路而提出的一個模型來解釋GhD6PKL2和增多的表皮毛數(shù)量之間的關(guān)系：細(xì)胞膜上生物合成的磷脂會在細(xì)胞膜基部招募PDK1和D6PK，隨后D6PK在PDK1的磷酸化作用下將信號放大；激活的D6PK進(jìn)一步磷酸化生長素運(yùn)輸載體PIN蛋白，從而提高PIN蛋白的生長素運(yùn)輸能力，最終產(chǎn)生生長素在擬南芥表皮毛分化起始階段發(fā)揮一定作用的現(xiàn)象。又因?yàn)镚hD6PKL2在棉纖維伸長期顯著高表達(dá)，推測該激酶信號傳導(dǎo)途徑中，可能還存在其他協(xié)同作用的激酶或因子共同又促進(jìn)了伸長期的發(fā)育，因而在棉纖維伸長階段也起到了一定的調(diào)控作用，說明GhD6PKL2可能為一個潛在的雙重調(diào)控棉纖維發(fā)育的功能基因。

本試驗(yàn)中，過表達(dá)GhD6PKL2后，轉(zhuǎn)基因擬南芥同時表現(xiàn)出了主根顯著變短，側(cè)根明顯變多的表型性狀。該試驗(yàn)側(cè)根變多的性狀和之前的一些結(jié)論有一致之處：在擬南芥d6pk突變體中，發(fā)現(xiàn)生長素運(yùn)輸量明顯減少，植物的側(cè)根起始等活動受到抑制［8，26-27］；擬南芥STPK超家族成員MAPK激酶中，MKK4/ 5- MPK3/ 6組成的信號通路，在生長素介導(dǎo)的側(cè)根起始方面也發(fā)揮重要作用［39］，該信號通路缺失功能后，即在mkk4 mkk5以及mpk3 mpk6雙突變體情況下，植物生長發(fā)育早期側(cè)根表現(xiàn)出顯著減少的表型。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，包括AGC VIII在內(nèi)的蛋白激酶基因，在擬南芥?zhèn)雀鹗茧A段發(fā)揮一定的正調(diào)控作用。本試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出的主根變短和之前的一些研究結(jié)論完全不同：PAX/AGC1.3屬于AGC1［40］，同樣可以磷酸化生長素運(yùn)輸載體-PIN蛋白，通過調(diào)控生長素運(yùn)輸活性進(jìn)一步影響根部韌皮部的分化及根的形態(tài)，但該基因的功能缺失突變體，表現(xiàn)出由于韌皮部分化受阻而導(dǎo)致主根變短的表型［34］。上述試驗(yàn)結(jié)果表明AGC VIII蛋白家族成員，主要是通過調(diào)控生長素極性運(yùn)輸、進(jìn)一步促進(jìn)根的伸長生長。對本試驗(yàn)表現(xiàn)出的主根變短的現(xiàn)象，可以大膽推測原因?yàn)椋涸诿藁ㄖ羞^表達(dá)該基因可能抑制了主根伸長通路中重要基因的作用，具體原因還要進(jìn)一步通過該激酶信號通路中可能的協(xié)同作用因子的發(fā)掘與試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。AGC家族中，其他成員也被報道參與調(diào)控根發(fā)育及其形態(tài)建成。IRE激酶基因在根毛的伸長階段有明顯的GUS啟動子活性，其ire突變體，表現(xiàn)出根毛比野生型短約40%的表型，表明IRE可能正調(diào)控根毛伸長［41］；受生長素調(diào)控及AtPDK1激活的OXI1（AGC2- 1）定位在根毛部位，PDK1- OXI1在抗氧化和抗病等方面發(fā)揮重要作用，沉默OXI1后，導(dǎo)致根毛變短，表明OXI1（AGC2-1）在根毛的生長發(fā)育中起到正調(diào)控作用［42］。上述結(jié)果綜合表明，STPK超家族尤其是AGC VIII激酶亞族成員，主要是通過體內(nèi)某種復(fù)雜的聯(lián)合機(jī)制配合調(diào)控生長素的極性運(yùn)輸，或促進(jìn)或抑制調(diào)控擬南芥根的生長發(fā)育。

本研究表明植物生長發(fā)育進(jìn)程是一個龐大復(fù)雜而又精致的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，植物表現(xiàn)出的某一形態(tài)特征或生理變化，都可能是由很多信號通路共同協(xié)作、調(diào)控的結(jié)果。轉(zhuǎn)GhD6PKL2植株表現(xiàn)表皮毛數(shù)量增多、主根變短、側(cè)根數(shù)目變多的表型，可能是AGC激酶中多個成員共同調(diào)控的生長素極性響應(yīng)的表現(xiàn)。本研究同時也表明GhD6PKL2不存在自激活情況，可以繼續(xù)酵母雙雜交試驗(yàn)、篩選與之互作的蛋白。故本試驗(yàn)下一步的工作重點(diǎn)為：檢測該基因的激酶活性、期望在GhD6PKL2蛋白激酶基因的上下游信號分子中探索出棉纖維生長發(fā)育的信號通路傳導(dǎo)機(jī)制。

4 結(jié)論

從陸地棉TM-1中克隆出GhD6PKL2，其定位于細(xì)胞膜上，檢測該激酶基因無自激活活性，GhD6PKL2在棉纖維伸長期顯著高表達(dá)，過表達(dá)轉(zhuǎn)化擬南芥后，轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型表現(xiàn)出表皮毛數(shù)量增加，同時，主根變短、側(cè)根數(shù)目增多的表型性狀，推測該基因參與擬南芥表皮毛及主側(cè)根的發(fā)育，可能為一個潛在的棉纖維發(fā)育相關(guān)基因。