岑由飛 朱牧孜 葉偉 李賽妮 鐘國華 章衛(wèi)民

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物有害生物綜合防治重點實驗室 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，廣州510642；2. 廣東省微生物研究所 廣東省科學(xué)院 華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣州 510070）

單端孢霉烯族毒素主要是由鐮刀菌、單端孢霉、木霉和其他霉菌產(chǎn)生的生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的有毒代謝產(chǎn)物，可污染小麥、大麥、玉米等禾谷類作物，給農(nóng)業(yè)帶來巨大危害［1-2］，同時，研究還發(fā)現(xiàn)單端孢霉烯毒素具有抗腫瘤、抗真菌、抗瘧疾和植物毒活性［3-6］，在藥物開發(fā)方面具有良好的應(yīng)用前景。據(jù)報道，tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12是單端孢霉烯生物合成的關(guān)鍵基因［7-9］。啟動子是能夠準(zhǔn)確與RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，是基因轉(zhuǎn)錄最重要的功能組件?；虮磉_水平受多個因素的影響，其中啟動子的強弱是一個重要的因素，基因表達水平高低與啟動子啟動活性強弱直接相關(guān)［10］。因此，啟動子活性的強弱決定了基因的轉(zhuǎn)錄效率，從而決定細胞中mRNA的總體豐度和目標(biāo)蛋白的含量［11-12］。近年來，人們不斷從絲狀真菌中發(fā)掘出具有很好生物活性的新型次級代謝產(chǎn)物以及生物酶，但是這些次級代謝產(chǎn)物以及生物酶的產(chǎn)量在原始菌株中往往很低，為了提高產(chǎn)量，不少絲狀真菌的強啟動子相繼被發(fā)掘，如里氏木霉（Trichoderma reesei）的cbh1、pdcl、tef1啟動子，橡膠樹白粉菌（Oidium heveae）的WY193啟動子，疣孢青霉（Penicillium verruculosum）的xylA啟動子，木霉（Trichoderma sp.）的pki1啟動子，構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的glaA、trpC啟動子等［13-14］。 啟動子的啟動效率與啟動子中的功能組件密切相關(guān)，常見的啟動子功能組件有TATA box，CAAT box和GC box。TATA box能指導(dǎo)起始前復(fù)合物的形成，決定轉(zhuǎn)錄起始位點，并調(diào)控上游激活蛋白的行為，CAAT box可以提高啟動子的啟動效率，GC box是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，有激活轉(zhuǎn)錄的功能［15］。據(jù)報道，tri5和tri12分別編碼倍半萜環(huán)化酶和MFS協(xié)同超家族轉(zhuǎn)運蛋白，是單端孢霉烯類化合物生物合成和外排過程中的關(guān)鍵酶［7-8］。

本課題組前期通過熒光定量PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析單端孢霉烯生物合成相關(guān)基因tri3、tri4、tri5、tri6、tri11、tri12的表達量，結(jié)果顯示tri5的表達量最高，tri12的表達量次之，推測tri5和tri12的啟動子可能具有較強的啟動能力［16］。本研究采用染色體步移技術(shù)對P. roridum A553中單端孢霉烯毒素的生物合成關(guān)鍵基因tri5和tri12啟動子進行克隆，采用氨芐青霉素抗性和潮霉素抗性基因表達載體進行功能驗證；同時，為尋找啟動子的核心區(qū)域，進一步利用熒光素酶載體對啟動子核心區(qū)域進行定量分析，并利用軟件對啟動子的功能組件進行預(yù)測和分析，為后期通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和異源表達以獲得更多高活性的單端孢霉烯毒素奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑 通用型DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化試劑公司，北京），pEASY-T1 Cloning Kit、DNA Marker 2k（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），Genome walking kit、PrimeSTAR MAX Premix（TaKaRa，大連），2× taq master mix（Microanalysis生物科技公司，北京），ClonExpress II One Step Cloning Kit C112（諾唯贊生物科技有限公司，南京）。

1.1.2 菌株和載體 植物內(nèi)生真菌Paramyrothecium roridum A553分離自藥用植物廣藿香［5］，pET30a載體、YEp352載體、pGL3-basic載體（淼靈生物科技有限公司，武漢），DH5α感受態(tài)細胞（全式金生物技術(shù)有限公司，北京），釀酒酵母BJ5464，保藏于廣東省微生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 tri5和tri12啟動子的克隆和序列分析 基于前期的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，根據(jù)Genome walking kit試劑盒說明書，設(shè)計tri5和tri12啟動子序列的特異性反向引物（表1）。以菌株A553基因組DNA為模板，利用通用正向引物和特異性反向引物AP3進行3次巢式PCR反應(yīng)，并將巢式PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將最后一步的PCR產(chǎn)物純化回收，回收產(chǎn)物利用pEASY-T1試劑盒進行TA克隆，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，利用通用引物T7和T7-ter進行菌落PCR篩選陽性克隆并提質(zhì)粒測序加以驗證，獲得目的基因tri5和tri12上游相關(guān)啟動子片段。將巢式PCR獲得的相關(guān)啟動子序列在啟動子預(yù)測網(wǎng)站（https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）進行分析獲得啟動子序列，并預(yù)測啟動子的核心區(qū)域。

表1 目的基因tri5和tri12特異性反向引物序列Table 1 Specific reverse primer sequences of the target genes tri5 and tri12

1.2.2 啟動子-pET30a-Amp、啟動子-YEp352-HYRB-CYC1和啟動子-pGL3-basic載體構(gòu)建 為了尋找tri5和tri12啟動子的核心區(qū)域，以1.2.1克隆得到的啟動子片段為模板，設(shè)計同樣的反向同源臂引物和不同的正向同源臂引物，通過PCR得到tri5和tri12啟動子不同長度的片段，分別記為5-f0、5-f1、5-f2和12-f0、12-f1、12-f2。

啟動子-pET30a-Amp載體構(gòu)建：設(shè)計針對pET30a載體的同源臂引物，利用PrimeSTAR MAX Premix酶，以pEASY-T1載體為模板進行PCR得到Amp片段，同時擴增pET30a-ACP載體作為backbone，純化回收PCR產(chǎn)物，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit C112（Vazyme）將Amp片段和pET30a-ACP同源重組連結(jié)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后涂布于卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR和提質(zhì)粒測序驗證，獲得帶有氨芐青霉素抗性的pET30a-Amp空載。設(shè)計針對pET30a-Amp空載的同源臂引物，以1.2.1克隆得到的啟動子為模板擴增得到6個片段，同時利用限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I對pET30a-Amp空載進行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進行切膠回收并測定其濃度。利用同源重組試劑盒將6個啟動子片段分別與pET30a-Amp空載體進行同源重組連結(jié)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后涂布于卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR和提質(zhì)粒測序驗證。

啟動子-YEp352-HYRB-CYC1載體構(gòu)建：設(shè)計針對pFC332-HYRB載體的同源臂引物，以pFC332-HYRB載體為模板擴增HYRB基因，同時擴增YEp352-TEF1-Amp載體作為backbone，純化回收PCR產(chǎn)物，將其進行同源重組連結(jié)，得到Y(jié)Ep352-TEF1-HYRB-CYC1載體。利用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sal I對YEp352-TEF1-HYRB-CYC1載體進行雙酶切除去TEF1啟動子，同時設(shè)計針對ddYEp352-HYRB-CYC1載體的同源臂引物，以1.2.1克隆得到的啟動子為模板擴增得到5-f0和12-f1啟動子片段，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將這兩個片段與ddYEp352-HYRB-CYC1載體進行切膠回收，利用同源重組試劑盒分別將這兩個片段與ddYEp352-HYRB-CYC1載體重組連結(jié)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR和提質(zhì)粒測序驗證。將測序結(jié)果正確的重組載體轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞BJ5464，再通過菌落PCR驗證。

啟動子-pGL3-basic載體構(gòu)建：設(shè)計針對pGL3-basic載體的同源臂引物，以1.2.1克隆得到的啟動子片段為模板擴增得到5-f0和12-f2啟動子片段，同時利用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII對pgpd-pGL3-basic載體（pgpd是真菌中已鑒定的強啟動子［17］）進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進行切膠回收，獲得啟動子的5-f0、12-f2啟動子片段和ddpGL3-basic。利用重組試劑盒將這2個片段分別與ddpGL3-basic同源重組后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR和提質(zhì)粒測序驗證。

1.2.3 氨芐青霉素抗性基因表達驗證 將1.2.2得到的DH5α-pET30a-5-f0/5-f1/5-f2/12-f0/12-f1/12-f2-Amp 轉(zhuǎn)化子以及DH5α-pET30a-ACP空載（陰性對照）接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，將DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1（陽性對照）接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)的菌液稀釋至OD600值為 1.0左右，取出10 μL加入到990 μL無菌水中稀釋100倍，記為10-2，然后從10-2取出10 μL加入到90 μL無菌水中稀釋10倍，記為10-3，再從10-3取出10 μL加入到90 μL無菌水中稀釋10倍，記為10-4，從不同濃度菌液中各取5 μL點在氨芐青霉素濃度為0、50、75 μg/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)10-12 h，觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長情況并拍照。根據(jù)點板結(jié)果，將陽性菌株與長出的菌落數(shù)與陽性菌株無差異的菌株分別接種于對應(yīng)的抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，利用含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基作為稀釋液，按上述方法進行稀釋，37℃，180 r/min培養(yǎng)。將不同稀釋濃度的菌液加至96孔板中，每孔200 μL，每個稀釋菌液設(shè)置五個重復(fù)，用Thermo多功能酶標(biāo)儀測定菌株的OD600值。每隔1 h測定1次，共10次，實驗重復(fù)3次。利用GraphPad Prism 8.0.1對相同濃度稀釋菌液的不同菌株的生長OD值進行顯著性分析。

由于上述點板結(jié)果不能比較3個tri5啟動子片段的轉(zhuǎn)錄活性，故重新培養(yǎng)DH5α-pET30a-ACP空載（陰性對照）、DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1（陽性對照）和DH5α-pET30a-5-f0/5-f1/5-f2-Amp系列轉(zhuǎn)化子，再按上述方法稀釋，各取5 μL點在氨芐青霉素濃度為0、10、25 μg/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)10-12 h，觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長情況并拍照。

1.2.4 潮霉素抗性基因表達驗證 將1.2.2得到的BJ5464-YEp352-HYRB-CYC1空載（陰性對照）、BJ5464-YEp352-TEF1-HYRB-CYC1（陽 性 對 照）、BJ5464-YEp352-5-f0-HYRB-CYC1、BJ5464-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1接種于SD-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，傳代一次再培養(yǎng)24 h。將菌液按1.2.3的方法進行稀釋，各取5 μL點在0、75、100 μg/mL潮霉素抗性的YPD平板上，30℃培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)皿中各菌落的生長情況并拍照。根據(jù)點板結(jié)果，將陽性菌株與長出的菌落數(shù)與陽性菌株無差異的菌株分別接種于對應(yīng)的SD-Ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，利用含有潮霉素抗性的SD-Ura培養(yǎng)基作為稀釋液，按1.2.3的方法進行稀釋，30℃，180 r/min培養(yǎng)。將不同稀釋濃度的菌液加至96孔板中，每孔200 μL，每個稀釋菌液設(shè)置5個重復(fù)，用Thermo多功能酶標(biāo)儀下測定生長OD600值。每隔6 h測定1次，共8次，實驗重復(fù)3次。利用GraphPad Prism 8.0.1對相同濃度稀釋菌液的不同菌株的生長OD值進行顯著性分析。

1.2.5 啟動子啟動熒光素酶基因的表達 將構(gòu)建成功的含有pGL3-5-f0-basic和pGL3-12-f1-basic質(zhì)粒載體和pGL3-pgpd-basic載體的菌株分別接種于含有1.0 mL LB液體培養(yǎng)基的EP管中，37℃，200 r/min培養(yǎng)10-12 h，按1∶100傳代到10 mL LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3-5 h，測定OD600值。當(dāng)OD600值為0.8-1.0時，離心收集菌液，并用PBS緩沖液洗滌2-3次，最后用500 μL的PBS重懸，利用手持細胞超聲儀破碎（振幅 30%，工作3 s/停頓10 s）20 min，12 000 r/min離心2 min，分離上清和沉淀。分別取50 μL上清和50 μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑于96孔板中，快速混勻后立即使用Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀檢測各反應(yīng)的RU值，反應(yīng)時間為10 s。

1.2.6 tri5和tri12啟動子核心區(qū)域分析 利用在線PlantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測tri5和tri12啟動子轉(zhuǎn)錄相關(guān)的功能組件。結(jié)合點板結(jié)果，預(yù)測啟動子的核心 區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 tri5啟動子和tri12啟動子的克隆分析

通過3次巢式PCR反應(yīng)對P. roridum A553基因組擴增，得到tri5和tri12對應(yīng)的擴增產(chǎn)物G1、G2和G3，tri5和tri12最后一次巢式PCR擴增產(chǎn)物G3的目的條帶大小分別約為2.5 kb（圖1-A）和2.8 kb（圖1-B）。純化回收最后一次巢式PCR產(chǎn)物，利用pEASY-T1試劑盒進行TA克隆，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選出陽性克隆，菌落PCR驗證陽性克隆并測序，獲得tri5和tri12的相關(guān)啟動子片段，利用啟動子預(yù)測網(wǎng)站（https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測得到的啟動子序列，tri5和tri12啟動子大小分別為1 458 bp和1 356 bp。將tri5和tri12啟動子序列在網(wǎng)站上進行核心區(qū)域分析，分別在網(wǎng)站（https://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）和（https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測tri5和tri12啟動子的核心區(qū)域，分值相對較高（表2）。

表2 目的基因tri5、tri12啟動子核心序列Table 2 Core sequences of tri5 and tri12 promoters

圖1 tri5、tri12染色體步移擴增得到的目的片段Fig.1 Target fragments of tri5 and tri12 obtained by chromosome walking

2.2 啟動子-pET30a-Amp質(zhì)粒的構(gòu)建及氨芐青霉素抗性的驗證

設(shè)計同源臂引物將tri5和tri12啟動子分別分成3個片段（圖2），與pET30a-ACP空載體同源重組得到重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR驗證并測序成功（圖3-A），得到啟動子-pET30a-Amp載體（圖3-B），即得到對應(yīng)的DH5α-pET30a-5-f0/5-f1/5-f2/12-f0/12-f1/12-f2-Amp菌株。將這6個菌株及DH5α-pET30a-ACP空載（陰性對照）與DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1（陽性對照）接種于對應(yīng)的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，將菌液稀釋后分別點在氨芐青霉素抗性濃度為0、50、100 μg/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h。發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL氨芐青霉素抗性板上只有DH5α-pET30a-12-f1-Amp和DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1長出菌落（圖4-A），通過測定生長曲線和顯著性分析發(fā)現(xiàn)，相同稀釋濃度的DH5α-pET30a-12-f1-Amp和DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1的生長OD值沒有顯著性差異（P＞0.05，圖4-C），說明tri12啟動子片段12-f1和陽性對照啟動子的啟動效率均比tri5啟動子片段5-f0強，而tri12啟動子片段12-f1的啟動效率與陽性對照啟動子相當(dāng)。

圖2 構(gòu)建具有不同長度片段的tri5和tri12基因啟動子Fig.2 tri5 and tri12 promoters with different lengths of fragments

為了確定3個tri5啟動子片段的啟動效率，重新培養(yǎng)含tri5啟動子片段的菌株以及DH5α-pET30a-ACP空載（陰性對照）和DH5α-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1（陽性），將菌液稀釋后分別點在氨芐青霉素抗性濃度為0、10、25 μg/mL的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h。發(fā)現(xiàn)在25 μg/mL的平板上只有DH5α-pET30a-ACP空載（陽性對照）和DH5αpET30a-5-f0-Amp長出菌落（圖4-B），且菌落數(shù)較多，說明tri5的啟動子片段中，5-f0的啟動效率最強。

圖4 不同濃度的氨芐青霉素抗性平板篩選含不同啟動子片段的大腸桿菌Fig.4 Screening of E. coli containing different promoter fragments on resistance plates with different concentrations of ampicillin

2.3 啟動子-YEp352-HYRB-CYC1質(zhì)粒的構(gòu)建及潮霉素抗性的驗證

設(shè)計針對YEp352載體的同源臂引物，將tri5和tri12啟動子分別分成3個片段，與雙酶切的YEp352-HYRB-CYC1載體進行同源重組連結(jié)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板篩選陽性克隆，通過菌落PCR驗證并測序成功（圖3-C），得 到Y(jié)Ep352-5-f0/5-f1/5-f2/12-f0/12-f1/12-f2-HYRB-CYC1載 體（圖3-D）。將YEp352-TEF1-HYRB-CYC1（陽 性 對 照）、YEp352-No pro-HYRB-CYC1（陰 性 對 照）、YEp352-12-f1-HYRBCYC1和YEp352-5-f0-HYRB-CYC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞BJ5464。通過菌落PCR和測序驗證，結(jié)果表明這4個載體都成功轉(zhuǎn)入酵因細胞中。將成功轉(zhuǎn)入YEp352系列載體的酵母菌株分別接種至SDUra液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2 d，將菌液稀釋后分別點在潮霉素濃度為0、25、50、75 μg/mL的YPD平板上，37℃培養(yǎng)2 d，發(fā)現(xiàn)在75 μg/mL的YPD上BJ5464-YEp352-5-f0-HYRB-CYC1的菌落數(shù)極少，而BJ5464-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1和BJ5464-YEp352-TEF1-HYRB-CYC1的菌落數(shù)較多（圖5-A），通過測定生長曲線和顯著性分析發(fā)現(xiàn)，相同稀釋濃度的BJ5464-YEp352-12-f1-HYRB-CYC1和BJ5464-YEp352-TEF1-HYRB-CYC1的生長OD值均沒有顯著性差異（P＞0.05，圖5-B），說明tri12啟動子片段12-f1和陽性對照啟動子的啟動效率均比tri5啟動子片段5-f0強，而tri12啟動子片段12-f1的啟動效率與陽性對照啟動子相當(dāng)。

圖3 DH5α菌落PCR驗證及啟動子載體Fig.3 Colony PCR verification of DH5α and promoter vector maps

圖5 不同濃度的潮霉素抗性平板篩選含不同啟動子片段的釀酒酵母Fig.5 Screening of S. cerevisiae containing different promoter fragments on resistant plates with different concentrations of hygromycin

2.4 熒光素酶活性檢測

利用同源重組的方法成功構(gòu)建了分別含有5-f0、12-f0啟動子片段的pGL3-basic重組表達載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，并通過菌落PCR和測序驗證。利用熒光素酶檢測試劑對成功導(dǎo)入pGL3-basic重組載體的重組菌進行檢測。結(jié)果（圖6）顯示含有pgpd啟動子的菌株其熒光素酶活性均高于含有5-f0和12-f0啟動子片段的重組菌，含有5-f0啟動子片段的重組菌的熒光素酶活性高于含有12-f1啟動子片段的重組菌，說明5-f0啟動子片段對熒光素酶基因的啟動效率高于12-f1啟動子片段。這與點板的結(jié)果相反，說明同一個啟動子在啟動不同基因時的啟動效率不同。

圖6 pGL3-5-f0-basic、pGL3-12-f1-basic和pGL3-pgpdbasic載體在DH5α中的熒光素酶活性檢測Fig.6 Luciferase activity detection of pGL3-5-f0-basic，pGL3-12-f1-basic and pGL3-pgpd-basic vectors in DH5α

2.5 tri5和tri12啟動子活性區(qū)域分析

利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測啟動子的功能組件，結(jié)合啟動子序列特點進行分析發(fā)現(xiàn)，在tri5啟動子的-43處有一個TATA box，使轉(zhuǎn)錄精確起始；在啟動子的-66處有一個CAAT box，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。在tri12啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游30-50 bp處并沒有TATA box，因此認(rèn)為該啟動子是一個TATAless啟動子；但在啟動子的-54處有一個CAAT box，控制轉(zhuǎn)錄起始頻率；在CAAT-box前面與其相連有一個GC box，起到激活轉(zhuǎn)錄的作用（圖7）。結(jié)合點板的結(jié)果分析，片段5-f0啟動活性強于5-f1，5-f2，說明tri5啟動子的ATG上游941-1 458 bp之間存在正向調(diào)控的功能組件，可增強啟動活性。片段12-f1的啟動活性顯著高于12-f0和12-f2，表明在tri12啟動子的ATG上游999-1 356 bp之間和1-516 bp之間存在轉(zhuǎn)錄抑制因子，影響啟動活性；而ATG上游516-999 bp之間存在正向調(diào)控的功能組件，可增強啟動活性，即說明片段12-f1就是tri12啟動子的核心區(qū)域。

圖7 tri5和tri12功能組件預(yù)測Fig.7 Functional component prediction of gene tri5 and tri12

3 討論

絲狀真菌中次級代謝產(chǎn)物的生物合成需要一些關(guān)鍵酶的調(diào)控，而轉(zhuǎn)錄效率高的啟動子可以啟動關(guān)鍵酶的高效表達進而促進次級代謝產(chǎn)物的高效生物合成［17］。絲狀真菌中的許多強啟動子已經(jīng)用于內(nèi)源或外源蛋白的表達，例如構(gòu)巢曲霉甘油醛3磷酸脫氫酶啟動子（PgpdA）用于異源表達治療性蛋白質(zhì)-人干擾素β（HuIFNβ）［18］，里氏木霉CBH1啟動子用于異源表達纖維二糖水解酶Cel7A［19］。單端孢霉烯毒素是一類抗腫瘤活性顯著的倍半萜類化合物，其生物合成基因簇已被許多文獻報道，其中tri5、tri12是單端孢霉烯合成家族tri簇中不可或缺的關(guān)鍵基因。tri5編碼的倍半萜環(huán)化酶是單端孢霉烯生物合成中的關(guān)鍵酶，可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控提高單端孢霉烯類化合物的產(chǎn)量。tri12不直接參與單端孢霉烯的生物合成，但其編碼的MFS協(xié)同超家族轉(zhuǎn)運蛋白在毒素外排的過程中起著關(guān)鍵性作用，防止毒素在細胞內(nèi)過量積累而導(dǎo)致細胞死亡，毒素只有源源不斷地外排，才能源源不斷地在細胞內(nèi)合成。盡管已報道了不少單端孢霉烯生物合成基因，但這些基因的啟動子卻很少被研究。

本研究對露濕漆斑菌中tri簇關(guān)鍵基因tri5和tri12啟動子進行了克隆和功能鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者都具有良好的轉(zhuǎn)錄活性，提示其啟動子在單端孢霉烯生物合成中發(fā)揮著重要作用。氨芐青霉素抗性基因和潮霉素抗性基因分別是原核和真核表達系統(tǒng)中最常見的抗性篩選基因，因此，本課題組利用這兩種抗性基因?qū)ri5和tri12啟動子的核心區(qū)域進行鑒定［20］，在后續(xù)的研究中還可將啟動子整合至釀酒酵母染色體上進一步驗證其活性。為了尋找啟動子核心區(qū)，本研究將tri5和tri2啟動子進行分段克隆，發(fā)現(xiàn)片段12-f1的轉(zhuǎn)錄活性比其他片段的轉(zhuǎn)錄活性強，因此可通過改造啟動子而增強其活性。同時，通過對tri5和tri2啟動子的克隆以及在酵母細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)這兩種啟動子也能在酵母細胞中調(diào)控潮霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄和表達，說明它們在原核生物和真核生物中均具有啟動活性，提示這兩種啟動子可用于不同宿主異源表達單端孢霉烯的高效生物合成。本研究為后期通過對P. roridum A553中單端孢霉烯毒素生物合成基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控和異源表達奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究對植物內(nèi)生真菌Paramrothecium roridum A553中tri5和tri2兩個基因的啟動子序列進行克隆，采用原核和真核表達系統(tǒng)以及熒光素酶表達系統(tǒng)對tri5和tri2啟動子的核心區(qū)域進行分析，發(fā)現(xiàn)tri5和tri2啟動子具有較強的啟動基因表達的能力且能夠在酵母細胞中調(diào)控潮霉素基因的異源表達。最后利用軟件分析預(yù)測了啟動子中的關(guān)鍵功能組件。