潘可萌，陳 松，高向東，姚文兵

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室，南京211198）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種主要發(fā)生在老年人中的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進行性認知能力喪失，晚期出現(xiàn)老年性癡呆［1］。主要病理特征表現(xiàn)為β-淀粉樣蛋白（βamyloid protein，Aβ）組成的老年斑（senile plaques，SPs），以及過度磷酸化的tau蛋白構(gòu)成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）［2］。AD發(fā)病機制尚不清楚，目前治療AD的藥物都只能在一定程度上緩解AD的癥狀，對于AD的神經(jīng)元損傷無法有效地清除和阻斷，并不能完全治愈AD［3］。隨著人口老齡化加劇，AD患病人數(shù)逐年增長，至2020年，全球AD患病人數(shù)將近5 000萬，給社會和家庭帶來巨大負擔［4］。因此，關(guān)于AD發(fā)病機制研究和藥物研發(fā)刻不容緩。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一種高度保守的小片段非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達［5］。miRNAs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，對神經(jīng)發(fā)育、分化、成熟發(fā)揮重要作用［6-8］。microRNA-23b（miR-23b）位于人類9號染色體長臂9q22.32，在該位點上以基因簇形式表達［9］，呈現(xiàn)高度保守，參與細胞增殖、生長、凋亡、分化、細胞黏附以及細胞遷移等多種生命活動［10-12］。已有研究顯示在AD患者的額葉皮層中miR-23b的表達水平下調(diào)，并且可以作為評估AD的生物標志物［13-14］，但其在AD中的具體作用及機制需要進一步研究。

本研究采用Aβ25-35建立AD樣損傷細胞模型，探究在該模型下miR-23b對神經(jīng)細胞凋亡情況的影響，并進一步研究凋亡相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達水平的變化，從而在細胞水平上探討miR-23b對Aβ25-35導致AD樣神經(jīng)細胞凋亡的保護作用及機制。

1 材料

1.1試劑

miR-23b（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Aβ25-35（中國吉爾生化有限公司）；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、蛋白酶和磷酸酶抑制劑、蛋白預染Marker（美國Thermo公司）；RIPA細胞裂解液、一抗稀釋液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、ECL試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；氨芐青霉素、鏈霉素、牛血清白蛋白（中國Biosharp公司）；胰蛋白酶、MTT（美國Sigma公司）；Bax抗體、Bcl-2抗體、β-actin抗體（中國Abclonal公司）；LC3B抗體、Beclin-1抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG（美國Cell Signaling Technology公司）；p62抗體（中國Proteintech公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機、全波長酶標儀（美國Thermo公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；多功能凝膠成像系統(tǒng)（中國Tanon公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3細胞

神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞株購自美國菌種保藏中心（ATCC）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中貼壁生長，放置于37℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待匯合度達到80%左右進行實驗。

2.2 Aβ25-35寡聚體的制備

稱量Aβ25-35粉末5 mg，加至雙蒸水5 mL中充分溶解，超凈臺中進行過濾除菌，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)老化4 d，BCA法測定Aβ25-35寡聚體濃度，-20℃保存。

2.3 Aβ25-35致SH-SY5Y細胞損傷模型的建立

待細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞匯合度達到80%左右時，進行胰酶消化，收集密度為每毫升5×104個的SH-SY5Y細胞懸浮液，充分混勻后以每孔100μL鋪在96孔細胞培養(yǎng)板中，放置于37℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后以梯度濃度8，4，2，1，0.5，0.25μmol/L的Aβ25-35孵育SH-SY5Y細胞24 h，進行MTT法檢測細胞活性。MTT法具體步驟：每孔加入MTT 10μL，放置于37℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μL后置于搖床上振搖使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標儀檢測：570 nm為檢測波長，630 nm為參比波長，檢測各孔內(nèi)吸收度。

2.4 細胞轉(zhuǎn)染

實驗分為空白對照組、Aβ25-35+miR-23b NC組和Aβ25-35+mi R-23b轉(zhuǎn)染組。收集狀態(tài)良好的SHSY5Y細胞，以每毫升5×104個細胞的密度接種于6孔板中，放置于37℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待每孔細胞匯合度達到80%左右進行實驗。棄去每孔培養(yǎng)基，加入無血清opti-MEM培養(yǎng)基，2~3 h后開始轉(zhuǎn)染。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：使用opti-MEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 3000與mi R-23b，Lipofectamine 3000 3.75μL用opti-MEM 125μL稀釋，使用opti-MEM培養(yǎng)基稀釋miR-23b至50 nmol/L，將miR-23b與稀釋的Lipofectamine 3000等體積混合，室溫靜置10 min，棄去孔內(nèi)opti-MEM培養(yǎng)基，加入混合物，每孔總體積2 mL，孵育6 h后更換為含有1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，孵育24 h后，采用濃度為0.5μmol/L的Aβ25-35損傷SH-SY5Y細胞；繼續(xù)培養(yǎng)24 h進行后續(xù)實驗。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測miR-23b及Aβ25-35對SH-SY5Y細胞凋亡的影響[15]

細胞分組及轉(zhuǎn)染具體實驗步驟見“2.4”項。收集每孔細胞培養(yǎng)液，預冷PBS洗滌細胞3次后棄去，使用不含EDTA的胰酶消化貼壁細胞，終止消化后收集細胞，預冷PBS洗滌細胞2次后棄去；加入1×結(jié)合緩沖液100μL，輕輕吹勻至單細胞懸液；分別加入Annexin V-FITC染色液5μL和PI染色液5μL，輕輕吹勻，避光，室溫孵育10 min，加入1×結(jié)合緩沖液400μL，輕輕混勻，過篩網(wǎng)，置于冰浴中，流式細胞儀檢測各組細胞熒光強度。

2.6 JC-1探針法檢測miR-23b及Aβ25-35對SHSY5Y細胞線粒體膜電位的影響

細胞分組及轉(zhuǎn)染具體實驗步驟見“2.4”項。取適量JC-1（200×）探針，按照每50μL探針加入8 mL超純水的比例進行稀釋，劇烈渦旋使之充分混勻，再加入JC-1染色緩沖液（5×）2 mL充分混勻；棄去細胞培養(yǎng)液，使用預冷的PBS洗滌1次，每孔加入細胞培養(yǎng)基1 mL，再加入JC-1染色工作液1 mL，充分混勻，放置于37℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，棄去JC-1染色工作液，使用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次，每孔加入無血清培養(yǎng)基2 mL，全程避光，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.7 Western blot檢測mi R-23b及Aβ25-35對SHSY5Y細胞Bax、Bcl-2、p62、LC3B、Beclin-1蛋白表達量的影響

細胞分組及轉(zhuǎn)染具體實驗步驟見“2.4”項。提取各組細胞內(nèi)總蛋白，具體步驟為：細胞板置于冰上，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，預冷PBS洗滌細胞3次，每孔加入RIPA細胞裂解液（按1∶100的比例加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液）100μL；細胞刮刀刮取細胞收集于EP管中，每5分鐘充分渦旋1次，共6次；置于高速冷凍離心機中，4℃，12 000 r/min離心20 min后收集上清液即為細胞總蛋白。蛋白制樣后進行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V恒壓電泳，濕轉(zhuǎn)恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，4℃孵育一抗過夜；TBST洗膜5次，每次5 min，室溫孵育二抗2 h后，TBST洗膜5次，每次5 min，ECL顯色成像，檢測目的蛋白水平。

2.8 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0分析軟件進行處理，各項指標以xˉ±s表示，來源于至少3次獨立實驗，以One-Way ANOVA檢驗進行組間比較，以P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 Aβ25-35致SH-SY5Y細胞損傷模型的建立

Aβ25-35作為毒性片段，使用濃度梯度為8，4，2，1，0.5，0.25μmol/L的Aβ25-35損傷SH-SY5Y細胞24 h后，MTT法檢測細胞活性。結(jié)果如圖1所示，Aβ25-35可損傷SH-SY5Y細胞活性，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。當0.5μmol/L Aβ25-35作用于SH-SY5Y細胞24 h時，與對照組相比，細胞損傷率約為30%，選取該濃度為Aβ25-35的造模濃度。

Figure 1 Effects of different concentrations of Aβ25-35 on SH-SY5Y cell viability(xˉ±s,n=6)**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group

3.2 miR-23b對Aβ25-35致SH-SY5Y細胞凋亡情況的干預作用

采用Aβ25-35對SH-SY5Y細胞進行損傷并轉(zhuǎn)染miR-23b，收集細胞進行Annexin V-FITC/PI染色，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡水平的變化。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比較，Aβ25-35損傷SH-SY5Y細胞后，凋亡細胞數(shù)量明顯增多，而轉(zhuǎn)染miR-23b后凋亡細胞數(shù)量顯著減少，說明miR-23b能夠改善Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡水平。

Figure 2 Effects of miR-23b and Aβ25-35 on apoptosis in SH-SY5Y cells(xˉ±s,n=3)A:Analysis of the apoptosis level of SH-SY5Y cells by flow cytometry;B:Quantification of the apoptosis level###P＜0.001 vs control group;***P＜0.001 vs Aβ25-35+miR-23b NC groupNC:Negative control

3.3 miR-23b對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

采用Aβ25-35對SH-SY5Y細胞進行損傷并轉(zhuǎn)染miR-23b，JC-1檢測試劑盒檢測各組細胞線粒體膜電位情況。線粒體膜電位的下降說明細胞進入早期凋亡。當線粒體膜電位高時，JC-1形成聚合物，呈現(xiàn)紅色熒光；線粒體膜電位低時，JC-1為單體形式，呈現(xiàn)綠色熒光。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比較，Aβ25-35損傷SH-SY5Y細胞后，細胞內(nèi)綠色熒光較強，紅色熒光減弱，說明Aβ25-35損傷神經(jīng)細胞后線粒體膜電位降低；而轉(zhuǎn)染miR-23b后細胞內(nèi)出現(xiàn)較強的紅色熒光，綠色熒光減弱，說明miR-23b能夠緩解Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞內(nèi)線粒體膜電位異常。

Figure 3 Effects of miR-23b and Aβ25-35 on the mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells（Scale bar:50μm）A:Fluorescence of mitochondrial membrane potential of SH-SY5Y cells;B:Quantification of the red/green fluorescence ratio(xˉ±s,n=3)###P＜0.001 vs control group;***P＜0.001 vs Aβ25-35+miR-23b NC group

3.4 mi R-23b對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響

采用Aβ25-35對SH-SY5Y細胞進行損傷并轉(zhuǎn)染miR-23b，Western blot檢測各組細胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達水平。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比較，Aβ25-35損傷SH-SY5Y細胞后，SH-SY5Y細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達量和抑凋亡蛋白Bcl-2表達量的比值顯著上升，而轉(zhuǎn)染miR-23b后促凋亡蛋白Bax表達量和抑凋亡蛋白Bcl-2表達量的比值明顯下降，說明miR-23b可能通過調(diào)節(jié)Aβ25-35誘導SHSY5Y細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達水平，進而緩解神經(jīng)細胞的凋亡。

3.5 miR-23b對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞內(nèi)p62、LC3B、Beclin-1蛋白表達量的影響

采用Aβ25-35對SH-SY5Y細胞進行損傷并轉(zhuǎn)染miR-23b，Western blot檢測各組細胞內(nèi)p62、LC3B、Beclin-1蛋白表達量的變化。結(jié)果如圖5所示，與對照組相比較，Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞損傷后，SH-SY5Y細胞內(nèi)p62蛋白水平上升，LC3B-II/LC3B-I比值下降，Beclin-1蛋白水平下降，而轉(zhuǎn)染miR-23b后能在一定程度上緩解Aβ25-35誘導SHSY5Y細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白水平表達的異常，說明miR-23b可能同時影響自噬相關(guān)蛋白的表達量，最終緩解神經(jīng)細胞的凋亡。

Figure 5 Effects of miR-23b and Aβ25-35 on the protein levels of p62,LC3B and Beclin-1 in SH-SY5Y cells(xˉ±s,n=3)A:Detection of protein levels of p62,LC3B and Beclin-1 by Western blot;B,C,D:Quantitative analysis of protein levels of p62,LC3B-II/LC3B-I and Beclin-1##P＜0.01,###P＜0.001 vs control group;***P＜0.001 vs Aβ25-35+miR-23b NC group

4 討 論

AD主要發(fā)生在老年人群中，中國作為老年人口數(shù)量增長較快的國家，目前AD患病人數(shù)已經(jīng)達到950萬，60歲以上老人的平均患病率為5.4%［16］。然而AD發(fā)病機制復雜，目前尚未研究出針對AD的有效治療藥物［17］。miRNAs作為一種內(nèi)源性小片段非編碼RNA，能夠與特定mRNA的3′UTR非編碼翻譯區(qū)靶向結(jié)合從而導致mRNA的降解或抑制翻譯過程，最終調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后翻譯表達［18］。miR-23b定位于9號染色體上，屬于miR-23b/27b/24-1家族，其可靶向不同的蛋白從而在多種疾病中發(fā)揮作用［19-21］。已有研究顯示在AD患者的額葉皮層中miR-23b的表達水平下調(diào)，并且可以作為評估AD的生物標志物［13-14］。然而，miR-23b在AD中的具體作用以及分子機制還有待進一步研究。在近幾十年的研究中普遍認為Aβ的異常積累可能是導致AD的發(fā)病機制之一［22-23］，Aβ聚集形成纖維化沉積，進而形成β淀粉樣斑塊最終引發(fā)突觸損傷、tau蛋白異常磷酸化、膽堿能丟失、氧化應激和神經(jīng)炎癥等細胞損傷［24］。Aβ25-35因其能夠迅速聚集，產(chǎn)生較強的神經(jīng)毒性［25］，諸多研究使用Aβ25-35建立AD模型［26］。同時SH-SY5Y細胞作為人類神經(jīng)母細胞瘤細胞，其形態(tài)、神經(jīng)化學和電生理特性與神經(jīng)元相似［27］，因此本研究采用Aβ25-35誘導SH-SY5Y神經(jīng)細胞建立AD細胞損傷模型，探索miR-23b對SH-SY5Y神經(jīng)細胞活性的影響。結(jié)果表明在24 h內(nèi)，Aβ25-35對SH-SY5Y細胞活性損傷呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，以濃度為0.5μmol/L的Aβ25-35誘導SH-SY5Y神經(jīng)細胞建立AD樣細胞損傷模型，給予miR-23b后能夠緩解Aβ25-35所致神經(jīng)細胞凋亡。說明miR-23b對AD樣細胞模型發(fā)揮一定的保護作用。

凋亡作為生物體內(nèi)細胞自主消亡的過程，對機體組織發(fā)育和體內(nèi)環(huán)境平衡至關(guān)重要［28］。諸多研究顯示凋亡參與多種主要的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，包括AD、肌萎縮側(cè)索硬化癥、帕金森病和亨廷頓病等［29］。自噬作為一種選擇性降解途徑，通過降解細胞內(nèi)受損的細胞器、蛋白質(zhì)，提高細胞應對各種應激挑戰(zhàn)的能力［30］。正常情況下細胞凋亡與自噬過程相互平衡，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中凋亡與自噬平衡被打破［31-32］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-23b可以緩解Aβ25-35導致的神經(jīng)細胞內(nèi)異常的線粒體膜電位，同時miR-23b顯著改善Aβ25-35引起的異常的凋亡相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白水平，說明miR-23b可能同時影響凋亡相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白從而緩解神經(jīng)細胞的凋亡，最終對Aβ25-35損傷的SH-SY5Y細胞發(fā)揮保護作用。本研究為防治AD提供了新的潛在靶點，為AD藥物研發(fā)提供了新思路。