石 達(dá)，雷崎方，陶 濤，馬文龍，葉水仙，李廣志，孫海燕，吳 松*

（1安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，淮南232000；2深圳大學(xué)附屬第三醫(yī)院，深圳518000；3深圳市眾循精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院，深圳518000）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO最新報(bào)道，全球膀胱癌每年新增病例約為74 000例，占所有新發(fā)腫瘤總數(shù)量的7%，病死率也在不斷上升，占所有惡性腫瘤病死率的4%，其發(fā)病率和病死率在中國也呈逐年上升趨勢［1-2］。手術(shù)切除及輔助化療是當(dāng)前膀胱癌普遍采用的治療手段［3］。膀胱癌診治指南中，推薦的一線治療手段主要為基于順鉑（cisplatin）的化療，但腫瘤的復(fù)發(fā)、治療中的不良反應(yīng)以及耐藥的產(chǎn)生使膀胱癌患者5年生存率未見顯著增長［4］。增強(qiáng)化療敏感性，降低患者耐藥以及改善化療不良反應(yīng)是當(dāng)前膀胱癌治療研究的熱點(diǎn)，對提升膀胱癌患者的生存率及改善預(yù)后具有重要意義。

當(dāng)前，已從中草藥中發(fā)現(xiàn)大量對腫瘤有直接或間接抑制作用的天然產(chǎn)物，以此為先導(dǎo)開發(fā)新型化療藥物或治療方式，極具潛力。血根堿（San‐guinarine）廣泛存在于罌粟科（Papaveraceae）白屈菜族（Chelidoniaceae）植物中，是中藥白屈菜（Cheli?donium majus）、博落回（Macleaya cordata）、血水草（Eomecon chionantha）等的主要活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和抗菌等作用［5-6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)血根堿可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡（凋亡、自噬），抑制侵襲、血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，抑制乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［7］。然而，血根堿對膀胱癌的作用及機(jī)制研究鮮有報(bào)道，其作為新型化療藥物開發(fā)的潛力值得進(jìn)一步挖掘。

本研究以人膀胱癌EJ細(xì)胞為研究對象，分別從細(xì)胞和動(dòng)物水平，探討血根堿及與順鉑聯(lián)用促進(jìn)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，為血根堿作為新型輔助化療藥物的開發(fā)以及膀胱癌的臨床治療提供參考和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 藥品與試劑

血根堿（純度≥98%，美國Chemfaces公司）；順鉑（純度≥99%，美國Sigma公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素混合液（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒、Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京全式金生物科技公司）；細(xì)胞周期檢測試劑盒（美國英杰公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；GAPDH抗體（中國Abclonal公司）；Bcl-2抗體（美國Santa公司）；羊抗鼠IgG（美國Thermo公司）；TUNEL試劑盒（瑞士Roche公司）。

1.2儀器

X3R臺式高速大容量離心機(jī)、Multiskan Go1510全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；Ckx41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司）。

1.3 細(xì)胞及動(dòng)物

人膀胱癌EJ細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，并由本實(shí)驗(yàn)室長期保存。

SPF級BALB/c裸鼠，雌性，4~5周齡，40只，體重（15±3）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2016-0006，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

EJ細(xì)胞中加入完全培養(yǎng)基（RPMI 1640培養(yǎng)基中加入10%FBS和1%雙抗），于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2天換一次液，細(xì)胞貼壁生長融合至80%左右時(shí)傳代。細(xì)胞生長至對數(shù)期且狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將細(xì)胞按每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，設(shè)立8組不同濃度血根堿，依次為0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4，12.8μmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，處理細(xì)胞24 h和48 h，更換為含有10%CCK-8的培養(yǎng)基。孵育1.5 h后用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸收度，計(jì)算各組EJ細(xì)胞活力和IC50。

2.3 Annexin V FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡

采用血根堿（3.0μmol/L）、順鉑（0.5μg/mL）和血根堿（1.5μmol/L）+順鉑（0.25μg/mL）以及PBS空白對照組分別處理膀胱癌EJ細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞并用預(yù)冷PBS洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于Annexin V緩沖液100μL中，設(shè)立單染和雙染管分別加入PI及FITC（5μL），在室溫下孵育30 min，再加入Annexin V緩沖液400μL，30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件用于結(jié)果分析。

2.4 流式儀檢測細(xì)胞周期

藥物處理細(xì)胞方法同“2.3”項(xiàng)部分。收集藥物處理過的細(xì)胞，采用細(xì)胞周期檢測試劑盒處理樣本，流式細(xì)胞儀檢測分析，F(xiàn)lowJo軟件用于結(jié)果分析。

2.5 血根堿聯(lián)合順鉑對膀胱癌EJ細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量的影響

處理細(xì)胞方法同“2.3”項(xiàng)部分。提取細(xì)胞總蛋白，制備蛋白樣本，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，TBST洗滌4次，每次5 min，一抗（Bcl-2抗體、GAPDH抗體）（所有抗體以1∶1 000稀釋度使用）孵育4℃過夜，TBST洗滌后，使用相對應(yīng)的二抗辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG（所有抗體以1∶1 000稀釋度使用）孵育2 h，洗滌，化學(xué)發(fā)光顯色成像，檢測目的蛋白變化。

2.6 建模、分組、給藥、藥效和藥物安全性評價(jià)

SPF級雌性BALB/c裸鼠40只，5只1籠，飼養(yǎng)與SPF實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飼料和滅菌水隨機(jī)取食。裸鼠隨機(jī)分成4組，分為空白對照（生理鹽水）組，血根堿（20 mg/kg）組，順鉑（5 mg/kg）組，血根堿（10 mg/kg）聯(lián)合順鉑（2.5 mg/kg）組。每組10只，構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型，在小鼠右側(cè)腋下接種EJ細(xì)胞懸液125μL（每只1×107個(gè)細(xì)胞）。隔天1次測量腫瘤體積，V=（A×B2）/2，其中A為長，B為寬。待腫瘤長至50 mm3開始給藥［8］。各組尾靜脈注射相應(yīng)藥物200μL，每隔3天1次，共給藥5次，末次給藥后觀察1周。（1）小鼠一般狀態(tài)觀察：實(shí)驗(yàn)過程中，隔日觀察裸鼠的生存狀態(tài)、精神、活動(dòng)、進(jìn)食、皮膚等一般情況。（2）抑瘤率檢測：觀察結(jié)束后（實(shí)驗(yàn)第33天）稱量各組小鼠體重后，頸間離斷法處死小鼠，剝離瘤塊并稱取瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。（3）稱重：分離脾臟和肝臟并稱取質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。（4）HE病理學(xué)檢測：取新鮮腫瘤標(biāo)本組織，以4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察切片組織形態(tài)學(xué)改變。（5）腫瘤組織凋亡檢測：收集新鮮腫瘤樣品進(jìn)行處理制成切片，使用TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測，判定組織凋亡情況。（6）標(biāo)本制備：取新鮮心肝脾肺腎等重要臟器標(biāo)本組織，以4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察切片組織形態(tài)學(xué)改變，用于評估血根堿生物安全性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件和GraphPad Prism7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 血根堿對膀胱癌EJ細(xì)胞增殖的抑制作用

采用不同濃度的血根堿處理EJ細(xì)胞24和48 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，血根堿組處理EJ細(xì)胞后，能顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），且呈時(shí)間與劑量依賴關(guān)系（圖1）。通過Graphpad軟件計(jì)算得到血根堿組處理EJ細(xì)胞24和48 h的IC50分別為3.0和1.6μmol/L，并以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度的參考。

Figure 1 Sanguinarine（Sang）inhibits the cell viability of EJ bladder cancer cells(xˉ±s,n=3)

3.2 血根堿聯(lián)合順鉑促進(jìn)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡

Annexin V FITC/PI結(jié)果如圖2-A和2-B所示，空白對照組凋亡細(xì)胞占比為（2.17±0.87）%，血根堿組凋亡細(xì)胞占比（16.83±4.62）%，順鉑組凋亡細(xì)胞占比（26.34±1.03）%，聯(lián)合用藥組凋亡細(xì)胞占比（37.07±4.02）%。與空白對照組相比，血根堿組凋亡細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.001），聯(lián)合用藥組和順鉑組凋亡比例具有顯著差異（P＜0.001）。

Figure 2 Apoptosis rates of EJ cells in control,Sang,cisplatin(Cis)and combination group in 24 h(xˉ±s,n=3)A:Cell apoptosis of EJ cells in control(DMSO),Sang(3.0μmol/L),Cis(0.5μg/mL),and combination group were analyzed by flow cytometry.The dose of Sang and Cis was halved in the combination group;B:Apoptosis rates of control,Sang,Cis,and combination group***P＜0.001

3.3 血根堿聯(lián)合順鉑對膀胱癌EJ細(xì)胞周期阻滯作用

流式儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果（圖3）表明，在藥物處理下EJ細(xì)胞周期發(fā)生顯著變化。血根堿和順鉑可引起S和G2/M期阻滯，且聯(lián)合用藥組的G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，說明聯(lián)合用藥組讓細(xì)胞阻滯于G2/M期。

3.4 血根堿聯(lián)合順鉑對膀胱癌EJ細(xì)胞Bcl-2表達(dá)量的影響

Western blot檢測空白對照組、血根堿組、順鉑組及聯(lián)合用藥組的Bcl-2表達(dá)量。結(jié)果（圖4）表明，與空白對照組相比，血根堿組Bcl-2表達(dá)量降低（P＜0.01），聯(lián)合用藥組的Bcl-2表達(dá)量顯著降低（P＜0.001），說明聯(lián)合用藥組可經(jīng)Bcl-2介導(dǎo)從而促進(jìn)膀胱癌EJ細(xì)胞的凋亡。

3.5 血根堿聯(lián)合順鉑用藥對荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用

實(shí)驗(yàn)前，全部裸鼠狀態(tài)良好，體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，皮膚呈健康粉色，反應(yīng)靈敏，飲食正常。腫瘤接種成功后，腫瘤體積逐漸增大，外觀呈球狀，首次給藥體重各組間無差異。與空白對照組比較，順鉑組小鼠在實(shí)驗(yàn)第20天出現(xiàn)不良反應(yīng)，表現(xiàn)為普遍精神萎靡不振、活動(dòng)量減少、喜蜷臥聚集一團(tuán)、皮膚偏白且粗糙少光澤、背部弓起、體重明顯下降，個(gè)別出現(xiàn)眼皮腫脹等癥狀。在實(shí)驗(yàn)第28天血根堿組和聯(lián)合用藥組出現(xiàn)類似癥狀，但程度較輕，精神狀態(tài)及活動(dòng)力尚可，體重呈上漲趨勢。給藥期間，腫瘤體積生長曲線如圖5-A所示，空白對照組、血根堿組、順鉑組與聯(lián)合用藥組腫瘤體積整體呈上漲趨勢，血根堿組、聯(lián)合用藥組腫瘤體積與空白對照組相比有顯著差異（P＜0.001）；順鉑組與聯(lián)合用藥組P=0.53，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5次給藥后，血根堿組、順鉑組和聯(lián)合用藥組腫瘤體積和重量較空白對照組均減?。▓D5-B，5-C），空白對照組、血根堿組、順鉑組與聯(lián)合用藥組腫瘤質(zhì)量分別為：（1.7±0.2）g，（1.1±0.2）g，（0.8±0.1）g，（0.5±0.2）g，其中血根堿組與空白對照組相比腫瘤質(zhì)量有顯著差異（P＜0.001）；聯(lián)合用藥組和順鉑組相比，腫瘤質(zhì)量具有顯著差異（P＜0.001）。各組抑瘤率分別為32.23%，54.82%和73.32%；聯(lián)合用藥組抑瘤率與順鉑組相比，具有顯著差異（P＜0.001）（圖5-D）。從腫瘤體積的生長變化曲線到腫瘤質(zhì)量和抑瘤率可知，單獨(dú)給藥組和聯(lián)合用藥組對腫瘤有抑制作用，聯(lián)合給藥組抗腫瘤效果最顯著。

Figure 3 Cell cycle of EJ cells in control（A）,Sang（B）,Cis（C）,and combination group（D）in 24 h analyzed by flow cytometry(xˉ±s,n=3)

Figure 4 Effects of control,Sang,Cis,and combination group on the protein levels of Bcl-2 in EJ cells(xˉ±s,n=10)A:Detection of protein level of Bcl-2 by Western blot;B:Quantitative analysis of protein levels of Bcl-2**P＜0.01,***P＜0.001

3.6 血根堿聯(lián)合順鉑對腫瘤組織凋亡的影響

腫瘤組織經(jīng)HE染色的病理結(jié)果如圖6所示，空白對照組腫瘤細(xì)胞排列密集，細(xì)胞核明顯，腫瘤細(xì)胞體積較大。聯(lián)合用藥組和空白對照組相比，腫瘤細(xì)胞密度降低，細(xì)胞核發(fā)生皺縮，細(xì)胞體積明顯縮小。在TUNEL凋亡檢測中，與空白對照組相比，聯(lián)合用藥組代表凋亡的綠色熒光信號增加，表明聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)了更多的細(xì)胞凋亡。

3.7 血根堿聯(lián)合順鉑對裸鼠皮下成瘤體內(nèi)生物安全性評價(jià)

通過對小鼠主要臟器HE染色來評價(jià)血根堿組、順鉑組、聯(lián)合給藥組體內(nèi)毒性變化（圖7）。血根堿組、聯(lián)合用藥組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟沒有明顯的組織學(xué)損害。順鉑組小鼠肝臟和腎臟相比較于其他組有一定程度的損害。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血根堿組治療膀胱癌裸鼠皮下成瘤小鼠具有良好的生物安全性。聯(lián)合用藥組能夠緩解單獨(dú)使用順鉑組帶來的肝臟和腎臟的損傷，聯(lián)合用藥組能夠降低單獨(dú)使用順鉑組的不良反應(yīng)，發(fā)揮減毒效果。

Figure 5 Effects of drug combination therapy on antitumor and synergia of tumor-bearing mice(xˉ±s,n=10)A:Alterations of tumor volume in control,Sang,Cis and combination group;B:Anti-tumor effects of control,Sang,Cis,and combination group;C:Tumor weight of control,Sang,Cis,and combination group of mice;D:Tumor inhibition rates***P＜0.001

Figure 6 HE staining and TUNEL assay in tumor tissues of different treatment groups

3.8 血根堿聯(lián)合順鉑用藥對荷瘤小鼠的減毒作用

Figure 7 HE staining of major organs(heart,liver,spleen,lung,kidney)treated with different drug groups(black arrow pointed to the damaged area)

Figure 8 Effects of drug combination therapy on antitumor and attenuation toxicity effects of EJ tumor-bearing mice(xˉ±s,n=10)A:Alterations of mice body weight;B:Mice body weights;C:Mice spleen weights;D:Mice liver weightsns:not significant.*P＜0.05,***P＜0.001

如圖8及表1所示，給藥期間，血根堿組體重與空白對照組相比無顯著差異，順鉑組體重與空白對照組相比，顯著下降（P＜0.001），聯(lián)合用藥組體重與順鉑組相比具有顯著差異（P＜0.001）。聯(lián)合用藥組對于順鉑組小鼠的體重降低情況有改善作用。如表2所示，血根堿組脾臟質(zhì)量與空白對照組存在差異（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組和順鉑組荷瘤小鼠脾臟質(zhì)量差異顯著（P＜0.001），血根堿組肝臟質(zhì)量與空白對照組無顯著差異，聯(lián)合用藥組肝臟質(zhì)量與順鉑組相比具有顯著差異（P＜0.001）。根據(jù)臟器系數(shù)公式分別計(jì)算出各組小鼠的脾臟系數(shù)和肝臟系數(shù)，聯(lián)合用藥組同順鉑組相比，脾臟系數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其他組和空白對照組相比脾臟系數(shù)差異不顯著，用藥組和空白對照組的肝臟系數(shù)相比無顯著差異。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組對荷瘤小鼠脾臟具有一定的保護(hù)作用，對小鼠體重下降及生存狀態(tài)具有改善作用。

Table 1 Effects of medication on EJ bladder cancer cells of tumor-bearing mice(xˉ±s,n=10)

Table 2 Organ coefficient of tumor-bearing mice(xˉ±s,n=10)

4 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，順鉑通過進(jìn)入細(xì)胞核作用于DNA分子，干擾DNA修復(fù)，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)改變，發(fā)揮抗腫瘤作用［9］。血根堿可通過刺激氧化應(yīng)激的產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，插入雙鏈DNA抑制腫瘤細(xì)胞微管聚合等發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑與血根堿聯(lián)合用藥后膀胱癌EJ細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例顯著下降，S期和G2/M期細(xì)胞比例增加。由于G2/M期的周期檢查點(diǎn)是細(xì)胞有絲分裂中的重要環(huán)節(jié)，只有沒有受到損傷的DNA才能通過該點(diǎn)進(jìn)入M期，否則可觸發(fā)G2期阻滯，從而退出細(xì)胞周期，進(jìn)入凋亡程序［11］。這提示，順鉑和血根堿的聯(lián)合使用，可能通過對膀胱癌EJ細(xì)胞的DNA產(chǎn)生雙重?fù)p害作用，讓DNA損傷的腫瘤細(xì)胞更多阻滯于G2/M期從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

Bcl-2基因是一種原癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。已有報(bào)道表明，Bcl-2在多種化療藥物的耐藥細(xì)胞株中呈高表達(dá)［12］，通過降低Bcl-2基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對于克服化療耐藥具有重要價(jià)值。順鉑的耐藥和不良反應(yīng)是限制其臨床應(yīng)用的重要因素，本研究發(fā)現(xiàn)相對于單獨(dú)使用順鉑組，順鉑與血根堿聯(lián)合用藥，膀胱癌EJ細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)量呈顯著下降，且對于荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制顯著，重要臟器無明顯病理損傷，這提示血根堿聯(lián)合用藥后，通過抑制原癌基因Bcl-2的表達(dá)，緩解順鉑耐藥的發(fā)生。

同時(shí)，隨著聯(lián)合用藥方案中，順鉑給藥劑量的減少，可有效減輕順鉑不良反應(yīng)對生存質(zhì)量的影響。本研究中，對于荷瘤小鼠，聯(lián)合用藥組的生存質(zhì)量較單獨(dú)使用順鉑組有較為顯著的改善，主要體現(xiàn)在體重的保持以及主要臟器損傷的保護(hù)，其中對荷瘤小鼠脾臟損傷的保護(hù)作用尤為明顯。由于脾臟是免疫功能調(diào)節(jié)的重要器官，這提示本研究可以通過免疫功能及代謝功能評估進(jìn)一步探索聯(lián)合用藥對順鉑不良反應(yīng)減毒效果的可能作用機(jī)制，有望為膀胱癌臨床化療的改善提供參考。