晏曉君，邱 鵬，查文良，余 薇，周 云**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種因胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足而導(dǎo)致的以長(zhǎng)期血糖水平增高為特征的代謝性疾病。根據(jù)調(diào)查顯示，目前全球有4億多DM患者，中國(guó)已成為僅次于美國(guó)DM有關(guān)的保健支出總額最多的國(guó)家，DM經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)嚴(yán)重[1]。DM的危害主要來自并發(fā)癥，且會(huì)導(dǎo)致高致死率和高致殘率。而DM中常見的特征為胰島素抵抗、高胰島素血癥、β細(xì)胞功能障礙及衰竭等。目前對(duì)DM的治療以調(diào)控血糖為主，但隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，耐藥性的出現(xiàn)，降糖效果不佳，引發(fā)組織損傷并導(dǎo)致功能改變。因此，在DM環(huán)境中開展藥物治療作用的研究，為新的治療方法提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)尤為重要。

海藻糖(trehalose，TLS)為非還原性二糖，廣泛存在于各種生物體中，對(duì)生物活性物質(zhì)具有非特異性的保護(hù)作用[2]。TLS可通過抑制炎癥和蛋白水解因子的表達(dá)，恢復(fù)眼表完整性以及干燥環(huán)境下的眼睛角化[3]。TLS還可通過抑制線粒體功能障礙和激活Bcl-2家族中關(guān)鍵的促凋亡成員而阻斷高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。有研究報(bào)道[5]，TLS在很大程度上可使小鼠脂質(zhì)代謝正?；p輕胰腺炎反應(yīng)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在引起DM心肌病的因素中，心肌細(xì)胞凋亡是重要發(fā)病環(huán)節(jié)[6]?；诖?，本研究以小鼠腹腔注射STZ誘導(dǎo)DM模型，探討TLS對(duì)胰腺功能的影響，以及改善高糖小鼠凋亡和焦亡的作用機(jī)制，為預(yù)防和治療DM誘導(dǎo)的胰腺損傷提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6J小鼠60只，5～6周齡，體質(zhì)量20～25g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。確保飼養(yǎng)房溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度為(40±5)%，通風(fēng)，進(jìn)行光照晝夜循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料和飲用水喂養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周后，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑

TLS購(gòu)于武漢漢宇飛揚(yáng)科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)購(gòu)自Sigma公司；Bax、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology公司，NALP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β抗體購(gòu)于北京博奧森公司。其余均為進(jìn)口或者國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

多功能酶標(biāo)儀(瑞士TecanSpark)，電子天平，3-18K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma)，電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Chemi-Doc)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方法

60只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con組，n=15)、DM模型組(DM組，n=15)、TLS對(duì)照組(TLS組，n=15)和TLS治療組(DM+TLS組，n=15)。DM組和DM+TLS組連續(xù)5d腹腔注射由檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.4)配制而成的0.5% STZ溶液(50mg/kg)，分別在STZ注射后3d和7d進(jìn)行尾靜脈血糖測(cè)定，分別測(cè)得血糖值≥16.7mmol/L則視為DM小鼠造模成功。而Con組和TLS組用相同方法給予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。Con組和DM組進(jìn)行接連2d等量生理鹽水腹腔注射，間隔4周。而TLS組和DM+TLS組進(jìn)行連續(xù)2d TLS[1mg/(g·d)]腹腔注射，間隔4周，同時(shí)再采用飲水給藥2%TLS，共飼養(yǎng)24周[7]。

1.2.2 Western blotting法檢測(cè)蛋白

取小鼠胰腺組織，裂解液充分裂解后，離心取上清液測(cè)定蛋白濃度，電泳轉(zhuǎn)膜及封閉后根據(jù)不同抗體的效價(jià)，置于一抗4℃孵育過夜，二抗室溫1h孵育后用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行底物顯色，應(yīng)用image lab軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠胰腺組織凋亡蛋白表達(dá)情況

DM組Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)水平相比Con組明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)率明顯降低(P<0.05)；DM+TLS組Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)水平與DM組相比顯著降低(P<0.05)；TLS組凋亡蛋白相比Con組無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

2.2 各組小鼠胰腺組織焦亡蛋白表達(dá)情況

DM組NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)水平與Con組相比顯著升高(P<0.05)；DM+TLS組顯著逆轉(zhuǎn)了上述改變(P<0.05)；TLS組焦亡蛋白水平相比Con組差異不明顯(P>0.05)，見圖2。

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

3 討 論

DM的發(fā)生發(fā)展均伴隨著胰腺功能的進(jìn)行性減退，高糖狀態(tài)會(huì)造成自噬水平異常，導(dǎo)致胰島細(xì)胞凋亡[8]。胰島是胰腺的內(nèi)分泌部分，胰島素是胰島β細(xì)胞分泌的蛋白類激素。胰島素的作用是降低血糖，其能否正常發(fā)揮功效在DM的發(fā)病機(jī)制中占有重要的作用。DM的發(fā)生可導(dǎo)致胰腺中半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(caspase-3)和焦亡蛋白IL-1β增加，以及β細(xì)胞功能障礙引起的胰島素分泌受損和胰島素抵抗增加[9]。STZ誘導(dǎo)的DM是以β細(xì)胞受損和胰島素分泌減少為特征，在β細(xì)胞功能障礙的起始過程中，細(xì)胞炎癥小體激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1(caspase-1)并促進(jìn)促炎細(xì)胞因子(如IL-1β，IL-6和MCP-1)的表達(dá)，這些細(xì)胞因子可以進(jìn)一步誘導(dǎo)局部炎癥并阻礙胰島β細(xì)胞的正常功能[10]。有研究報(bào)道，炎性體不僅誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[11]。因此，抑制細(xì)胞凋亡和焦亡可以被認(rèn)為是治療DM的潛在策略。

凋亡是基因調(diào)控的有序的細(xì)胞自發(fā)死亡方式，DM中胰島β細(xì)胞的凋亡可能是胰島素相對(duì)缺乏的主要機(jī)制。在DM的早期會(huì)出現(xiàn)高血糖胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞肥大，隨著病情的發(fā)展，在T1DM和T2DM中都會(huì)出現(xiàn)胰腺功能障礙和胰島β細(xì)胞丟失，胰島β細(xì)胞的凋亡是T1DM發(fā)展的最后一步，致使胰島β細(xì)胞大量減少，并導(dǎo)致高血糖癥的發(fā)作[12]。高血糖癥中胰島細(xì)胞數(shù)量減小，其功能受損也逐漸加劇，而胰島細(xì)胞凋亡是其數(shù)量減小和功能受損加劇的基礎(chǔ)。因此，抑制胰島細(xì)胞凋亡來保護(hù)胰島細(xì)胞成為防止DM胰腺損傷的關(guān)鍵因素。而細(xì)胞凋亡主要由凋亡誘導(dǎo)基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2共同調(diào)控，Bax/Bcl-2相對(duì)表達(dá)失調(diào)促使下游 caspase信號(hào)通路激活，隨即引發(fā)凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能受損。所以，抑制凋亡誘導(dǎo)基因Bax蛋白和caspase家族蛋白表達(dá)，以及促進(jìn)凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達(dá)可為防治DM胰腺損傷發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖尿病胰腺中凋亡蛋白Cleaved-Caspase3表達(dá)水平明顯升高，Bax/Bcl-2比例顯著升高，驗(yàn)證高糖提升凋亡水平，而TLS治療可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，說明TLS可以通過抑制凋亡對(duì)DM胰腺發(fā)揮保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是生理性的死亡方式，而細(xì)胞焦亡有別于凋亡但在特征上又具有一定相似性，細(xì)胞焦亡是新型促炎的細(xì)胞程序性死亡方式。焦亡反應(yīng)中Caspase-1可被上游炎性小體激活，并參與pro-IL-18/1β的活化和成熟，導(dǎo)致炎癥并誘導(dǎo)焦亡細(xì)胞膜孔形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。進(jìn)一步研究表明，DM和肥胖會(huì)加重胰腺炎的發(fā)展[13]，而胰腺炎與炎癥因子NALP3、TNF-α、IL-1β、IL-18等有關(guān)。NALP3炎性小體，通過與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)相互作用來引發(fā)炎性小體的形成，ASC會(huì)募集并激活pro-caspase-1以產(chǎn)生活性的caspase-1，使pro-IL-1β/18分別轉(zhuǎn)化為成熟和具有生物活性的IL-1β/18，活性IL-1β/18將觸發(fā)一系列非細(xì)菌性炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TLS治療可以有效降低DM小鼠胰腺中NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)，以改善焦亡水平，說明TLS還可以通過抑制焦亡對(duì)DM胰腺發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，DM可導(dǎo)致小鼠胰腺引發(fā)焦亡及凋亡水平增加，進(jìn)而加重胰腺損傷。TLS可降低DM導(dǎo)致的胰腺組織焦亡水平，減少凋亡細(xì)胞的生成，為TLS在DM胰腺組織中產(chǎn)生保護(hù)作用提供新的研究視野及理論基礎(chǔ)。