牛華鋒，張成東，楊雪嬌，任戰(zhàn)軍，王淑輝，趙永攀(.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動物工程分院，陜西 楊凌，700；. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌，7000； . 陜西省畜牧產(chǎn)業(yè)試驗(yàn)示范中心，陜西 涇陽770)

兔毛生長發(fā)育過程與毛囊(毛乳頭)關(guān)系密切[1]。成纖維細(xì)胞生長因子5(Fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5)是唯一通過影響毛囊生長期的長短而影響被毛長度的調(diào)控因子[2]。因此，研究該基因的序列結(jié)構(gòu)和遺傳分布對家兔被毛性狀的選育具有重要意義。FGF廣泛存在于各組織中，迄今為止共鑒定包括FGF5在內(nèi)的23種FGFs。Hebert等[3]1994年利用基因打靶技術(shù)，通過胚胎干細(xì)胞基因敲除證實(shí)go基因就是FGF5基因。Sundberg等[4]進(jìn)一步揭示，F(xiàn)GF5基因大約2 kb核苷酸的缺失導(dǎo)致安哥拉鼠軀干被毛過度增長。Mulsant等[5]于2003年擴(kuò)增出兔FGF5外顯子Ⅰ和Ⅲ，發(fā)現(xiàn)外顯子Ⅰ存在一個TCT插入突變，外顯子Ⅲ存在T-C錯義突變。夏勝榮等[6]采用PCR-RFLP法 對5個家兔群體FGF5基因部分外顯子1的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)外顯子1的220～222位點(diǎn)存在TCT缺失。馮凱等[7]分析了5個家兔品種FGF5 CDS區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)外顯子Ⅰ285～287位點(diǎn)存在TCT缺失，外顯子Ⅲ存在T-C突變，但是沒有得到外顯子Ⅲ的基因型條帶。李春笑等[8]采用PCR產(chǎn)物直接測序法檢測滎經(jīng)長毛兔、天府黑兔以及加利福尼亞兔，發(fā)現(xiàn)FGF5外顯子Ⅰ的217位點(diǎn)存在TCT插入突變，檢測出2種基因型，F(xiàn)GF5外顯子Ⅲ的59位點(diǎn)和3位點(diǎn)存在T-C錯義突變和T-C同義突變。由此可見，對家兔FGF5基因的多態(tài)性研究還不盡完善，不同兔品種間FGF5基因多態(tài)性存在差異，有必要對更多的兔品種進(jìn)行多態(tài)性研究，為家兔分子育種提供更多的理論依據(jù)。

伊拉肉兔是法國歐洲兔業(yè)公司在20世紀(jì)70年代末由9個原始品種經(jīng)不同雜交組合選育而成，具有生長發(fā)育快、出肉率高、肉質(zhì)鮮嫩，但被毛品質(zhì)差。美系獺兔是從美國引進(jìn)，被毛品質(zhì)好，粗毛率低，被毛密度大，制裘價值很高。本試驗(yàn)旨在研究伊拉肉兔和美系獺兔FGF5基因外顯子Ⅰ、外顯子Ⅱ和外顯子Ⅲ的單核苷酸多態(tài)性，尋找有價值的多態(tài)位點(diǎn)以及突變位點(diǎn)，探索與毛質(zhì)性狀有關(guān)的遺傳標(biāo)記，為家兔分子選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

在陜西天鑫食品有限公司選擇伊拉肉兔和美系獺兔各70只(公母各35只)，心臟采血10 mL放入已添加2.5 mL滅菌ACD抗凝劑的離心管中，用冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存。采用酚-氯仿法提取基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考http://asia.ensembl.org/ 基因庫中兔FGF5基因外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ序列，用oligo 6設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 FGF5基因外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的引物序列信息Table 1 Primer sequence information of FGF5 ExonⅠ, Ⅱ and Ⅲ

1.2.2 PCR擴(kuò)增條件 PCR體系為50 μL ： 2×Taq Master Mix來自康威世紀(jì)，由Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、藍(lán)色染料以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成，共25 μL；上游和下游引物各2 μL(濃度為10 pmol/μL)，DNA模板1μL(濃度為100 ng/μL)，dd H2O 20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，F(xiàn)GF5基因 ExonⅠ、Ⅱ和Ⅲ的退火分別為60 ℃、56.5 ℃、 55 ℃，均為40 s，72 ℃延伸40 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測序 各樣本均取30 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和20 μL上下游引物，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化、反向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用MegAlign、Chromas Application 2.3.0.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析，通過序列比對和序列峰值校正，篩選出SNP位點(diǎn)，判斷突變位點(diǎn)的基因型。用PopGene32軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、有效等位基因數(shù)等遺傳參數(shù)，用PIC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

FGF5外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，產(chǎn)物特異性良好，片段長度符合預(yù)期。

圖1 FGF5 外顯子Ⅰ(A)、Ⅱ(B)和Ⅲ(C) PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果 M. D2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～5. FGF5外顯子ⅠPCR產(chǎn)物；6～10. FGF5外顯子ⅡPCR產(chǎn)物；11～15. FGF5外顯子ⅢPCR產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis results of FGF5 Exon Ⅰ (A) ,Ⅱ (B) and Ⅲ (C) PCR amplification products M. D2000 DNA ladder；1～5. products of FGF5 Exon Ⅰ; 6～10. products of FGF5 Exon Ⅱ;11～15. products of FGF5 Exon Ⅲ

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

將家兔FGF5外顯子Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化、雙向測序。結(jié)果顯示FGF5外顯子Ⅰ和Ⅲ均存在多態(tài)性，F(xiàn)GF5外顯子Ⅱ不存在多態(tài)性。

2.2.1FGF5外顯子Ⅰ 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在FGF5外顯子Ⅰ的168～169位點(diǎn)間(記作FGF5外顯子ⅠA位點(diǎn))存在AGA 3堿基插入突變，將該位點(diǎn)存在AGA插入的等位基因命名為A1,不存在AGA插入的等位基因命名為A2，共發(fā)現(xiàn)3種基因型：基因型A1A1(突變型)為引物169～171位點(diǎn)存在AGA 3堿基插入(反向)；基因型A2A2(野生型)為 169位點(diǎn)不存在AGA 3堿基插入(反向)；基因型A1A2(雜合子)為 169位點(diǎn)等位基因存在AGA 3堿基插入造成測序結(jié)果產(chǎn)生移碼突變(反向)(見圖2)。

圖2 FGF5外顯子Ⅰ的3種基因型Fig.2 Three genotypes of FGF5 Exon I

2.2.2FGF5外顯子ⅡFGF5外顯子Ⅱ的測序結(jié)果顯示，外顯子Ⅱ全部序列(104 bp)以及內(nèi)含子Ⅰ的7 686～7 852 bp和內(nèi)含子Ⅱ的1～218 bp片段未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)(圖3)。

圖3 外顯子Ⅱ基因序列(反向)Fig.3 Exon II gene sequence(Reverse)

2.2.3FGF5外顯子ⅢFGF5外顯子Ⅲ的135位點(diǎn)(記作FGF5外顯子ⅢB位點(diǎn))存在C-G 單堿基突變，將含C堿基的等位基因命名為B1，含G堿基的等位基因命名為B2，共檢測出2種基因型，分別為B1B1和B1B2，見圖4。

圖4 FGF5外顯子Ⅲ 兩種基因型Fig.4 Two genotypes of FGF5 Exon Ⅲ

2.3 遺傳多態(tài)性分析

由表2可知，在所檢測的伊拉肉兔和美系獺兔群體中，F(xiàn)GF5外顯子ⅠA位點(diǎn)均存在3種基因型，在伊拉肉兔中A2A2基因型頻率明顯高于A1A1和A1A2基因型頻率，A2A2基因型為優(yōu)勢基因型；A2等位基因頻率明顯高于A1等位基因頻率，等位基因A2為優(yōu)勢等位基因。在美系獺兔中A1A1基因型頻率明顯高于A1A2和A2A2基因型頻率，A1A1基因型為優(yōu)勢基因型；A1等位基因頻率明顯高于A2等位基因頻率，等位基因A1為優(yōu)勢等位基因。FGF5外顯子ⅠA位點(diǎn)基因型頻率在伊拉肉兔群體中分布不符合hardy-weinberg平衡定律(P<0.05)，在美系獺兔群體中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表2 FGF5外顯子Ⅰ不同基因型在伊拉肉兔和美系獺兔中的遺傳分布Table 2 Genetic distribution of FGF5 Exon I genotypes in Ira meat rabbit and American Rex rabbit

由表3可知，在所檢測的伊拉肉兔和美系獺兔群體中，F(xiàn)GF5外顯子ⅢB位點(diǎn)都只存在B1B1和B1B2兩種基因型，且基因型B1B1的頻率分別為0.6429和0.8857均明顯高于B1B2基因型頻率，基因型B1B1為優(yōu)勢基因型；B1等位基因頻率明顯高于B2等位基因頻率，等位基因B1為優(yōu)勢基因。FGF5外顯子ⅢB位點(diǎn)基因型頻率在伊拉肉兔和美系獺兔群體中分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表3 FGF5外顯子Ⅲ不同基因型在伊拉肉兔和美系獺兔中的遺傳分布Table 3 Genetic distribution of FGF5 exon Ⅲ genotypes in Ira meat rabbit and Amercian Rex rabbit

雜合度和多態(tài)信息含量是衡量群體等位基因片段多態(tài)性的重要參數(shù)，雜合度和多態(tài)信息含量越低，表明基因突變變異程度越低，遺傳一致性越高。由表4可知，伊拉肉兔和美系獺兔FGF5外顯子Ⅲ的B位點(diǎn)觀測雜合度，期望雜合度和有效基因數(shù)均較低，而它們FGF5外顯子Ⅰ的A位點(diǎn)這些指標(biāo)相對較高。在伊拉肉兔和美系獺兔FGF5外顯子Ⅰ的A位點(diǎn)以及伊拉肉兔FGF5外顯子Ⅲ的B位點(diǎn)均存在中度多態(tài)(0.25

表4 伊拉肉兔和美系獺兔FGF5基因各多態(tài)位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Table 4 Genetic parameters of FGF5 gene polymorphisms in Ira meat rabbit and American Rex rabbit

3 討 論

本試驗(yàn)采用PCR產(chǎn)物直接測序法，對伊拉肉兔和美系獺兔兩個品種進(jìn)行基因多態(tài)性分析，與PCR-SSCP法和PCR-RFLP法相比，不僅簡化了試驗(yàn)操作，而且提高了對PCR產(chǎn)物突變位點(diǎn)的檢測精度，PCR產(chǎn)物直接測序法尋找突變位點(diǎn)的準(zhǔn)確率達(dá)到了100%。

伊拉肉兔和美系獺兔是目前我國飼養(yǎng)量較多的家兔品種，美系獺兔毛絨品質(zhì)優(yōu)良，被毛品質(zhì)好，粗毛率低，被毛密度較大，皮板富有彈性；伊拉肉兔被毛品質(zhì)與美系獺兔差異較大，因此，本研究選擇這2個品種分析研究其毛絨品質(zhì)相關(guān)分子遺傳標(biāo)記。本研究發(fā)現(xiàn)在伊拉肉兔和美系獺兔2群體中FGF5基因外顯子Ⅰ和Ⅲ均存在多態(tài)性，F(xiàn)GF5外顯子Ⅱ不存在多態(tài)性。在FGF5外顯子Ⅰ中存在1個TCT插入突變，與Mulsant等[5]和李春笑等[8]的研究結(jié)果一致，但是各基因型在不同兔品種間的分布有所不同，本研究結(jié)果顯示A1等位基因?yàn)槊老但H兔的優(yōu)勢基因，A2等位基因?yàn)橐晾馔玫膬?yōu)勢基因，而馮凱等[7]發(fā)現(xiàn)A1等位基因?yàn)殚}西南兔、海貍色獺兔、白色獺兔、九疑山兔和皖江長毛兔的優(yōu)勢基因，皖系長毛兔群體中未發(fā)現(xiàn)A2等位基因；李春笑等[8]研究顯示A1等位基因在滎經(jīng)長毛兔中占絕對優(yōu)勢，A2等位基因在天府黑、加利福尼亞兔中占絕對優(yōu)勢。劉琳玲等[9]研究發(fā)現(xiàn)FGF5基因T376C位點(diǎn)為水貂毛長性狀的主控位點(diǎn)。FGF5在哺乳動物毛發(fā)生長過程中具備關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)GF5基因外顯子Ⅰ發(fā)現(xiàn)的A1等位基因和A2等位基因在伊拉肉兔和美系獺兔的差異性與品種選育有關(guān)，美系獺兔在培育的過程中絨毛品質(zhì)是關(guān)鍵性狀，以皮用為主，伊拉肉兔在培育過程中肉用性能為關(guān)鍵性狀，兼顧絨毛品質(zhì)。由此可以證明FGF5外顯子ⅠA位點(diǎn)A1等位基因決定了家兔的長毛的表型，是影響被毛生長的重要因子，對家兔品種培育及絨毛資源利用都具有極高的應(yīng)用價值。

FGF5基因是多態(tài)信息含量是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)，是衡量基因突變變異程度高低的指標(biāo)[10]， 本研究伊拉肉兔和美系獺兔FGF5外顯子Ⅰ的A位點(diǎn)以及伊拉肉兔外顯子Ⅲ的B位點(diǎn)多態(tài)信息含量0.25

FGF5外顯子ⅢB位點(diǎn)基因型頻率在伊拉肉兔和美系獺兔群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。FGF5外顯子ⅠA位點(diǎn)基因型頻率在美系獺兔群體中也處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，而在在伊拉肉兔群體中處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)(P<0.05)。高愛琴[11]研究發(fā)現(xiàn)FGF5外顯子SNP位點(diǎn) 在 內(nèi) 蒙古絨山羊、遼寧絨山羊品的基因頻率處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，而在文登奶山羊群體處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。李新海等[12]研究內(nèi)蒙古絨山羊在該位點(diǎn)基因頻率均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。美系獺兔在FGF5外顯子ⅠA位點(diǎn)和外顯子ⅢB位點(diǎn)基因頻率處于平衡狀態(tài)的原因說明其群體在品種選育、遺傳漂變等作用下，這些位點(diǎn)基因均處于動態(tài)平衡中。造成伊拉肉兔FGF5外顯子ⅠA位點(diǎn)基因頻率不平衡的原因可能與其對經(jīng)濟(jì)性狀的選擇、樣本數(shù)量等因素有關(guān)，其對毛絨品質(zhì)的調(diào)控還需進(jìn)一步的研究和探索。

本研究發(fā)現(xiàn)FGF5外顯子Ⅲ引物的135位點(diǎn)存在G-C的突變，但未發(fā)現(xiàn)馮凱等[7]、李春笑等[8]、Mulsant等[5]所發(fā)現(xiàn)的T-C錯義突變。對于突變是否影響以及如何影響家兔的產(chǎn)毛性能還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

家兔作為一種重要的皮用經(jīng)濟(jì)動物，毛絨品質(zhì)至關(guān)重要，為了提高其生產(chǎn)性能，本研究對伊拉肉兔和美系獺兔2品種FGF5基因外顯子及部分內(nèi)含子多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)在伊拉肉兔和美系獺兔2群體中FGF5基因外顯子Ⅰ和Ⅲ均存在多態(tài)性，F(xiàn)GF5外顯子Ⅱ不存在多態(tài)性；FGF5外顯子ⅠA位點(diǎn)A1等位基因?yàn)槊老但H兔的優(yōu)勢基因，A2等位基因?yàn)橐晾馔玫膬?yōu)勢基因。由此推斷FGF5可以作為調(diào)控家兔毛絨品質(zhì)的候選基因，F(xiàn)GF5外顯子ⅠA位點(diǎn)A1等位基因是影響被毛生長的重要因子，對家兔品種培育及絨毛資源利用都具有極高的應(yīng)用價值。