馮志明 王廣達 趙劍華 居冉 李夢臣 高鵬 胡珂鳴 陳宗祥 左示敏, *

水稻富含半胱氨酸類受體激酶家族基因?qū)y枯病菌和植物激素的響應(yīng)特征分析

馮志明1, 2王廣達1趙劍華1居冉1李夢臣1高鵬1胡珂鳴1, 2陳宗祥1, 2左示敏1, 2, *

(1揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點實驗室/植物功能基因組學(xué)教育部重點實驗室, 江蘇揚州225009;2揚州大學(xué)江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省作物遺傳生理重點實驗室, 江蘇揚州 225009;*通信聯(lián)系人，E-mail: smzuo@yzu.edu.cn)

【目的】明確水稻富含半胱氨酸類受體激酶（Cysteine-rich receptor-like kinases，CRK）家族基因?qū)y枯病菌侵染和植物激素的響應(yīng)特征，是解析在水稻紋枯病抗性中的功能的重要前期工作?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)方法構(gòu)建了水稻45個的系統(tǒng)發(fā)育樹，并利用qPCR分析了它們對紋枯病菌和對植物激素乙烯（Ethylene，ET）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）和細胞分裂素（Cytokinin，CK）等的響應(yīng)特征，以及在水稻不同組織中的表達模式?！窘Y(jié)果】水稻家族可分為4個組，在染色體上成簇或緊密分布的大部分來自同一組或同一分支。41個響應(yīng)紋枯病菌侵染，其中17個響應(yīng)強烈；結(jié)合組織表達模式，發(fā)現(xiàn)這17個基因中，、、、、、、、、和等10個基因在葉鞘和葉片中表達較強，暗示這些基因可能參與了對紋枯病的抗性；大部分同一分支的兩個同源性較高的對紋枯病菌的響應(yīng)特征類似, 表明這些基因在調(diào)控紋枯病抗性上可能存在功能冗余。40個對3種或4種植物激素均有響應(yīng)，它們對不同激素的響應(yīng)存在差異性，說明可能廣泛參與這些激素介導(dǎo)的防御信號途徑；對JA和SA響應(yīng)相反的有17個，對JA和SA、ET和JA、ET和SA響應(yīng)類似的分別有21、21、23個。這不僅反映了ET、JA、SA信號途徑間的協(xié)同和拮抗作用，也說明這些基因可能參與ET、JA和SA間的交互作用?！窘Y(jié)論】鑒定到一些可能參與調(diào)控水稻紋枯病抗性的基因，且它們可能在植物激素介導(dǎo)的防御途徑中起作用。這為我們進一步探索在調(diào)控水稻紋枯病抗性上的功能提供了科學(xué)線索。

水稻；基因；紋枯??；防御相關(guān)激素；響應(yīng)特征

植物生活在復(fù)雜的環(huán)境中，不斷受到各種病原菌的威脅，為了抵御病原菌的攻擊，植物進化出了復(fù)雜的策略，并將其轉(zhuǎn)化為有效的免疫反應(yīng)[1]。類受體激酶（Receptor-like kinase，RLK）在感知外界刺激、激活下游信號通路、調(diào)節(jié)細胞對病原菌侵染的反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[2]。富含半胱氨酸的類受體激酶(Cysteine-rich receptor-like kinases，CRK）是植物RLK的一個亞家族，具有典型的RLK結(jié)構(gòu)特征，即含有一個負責(zé)信號感知的胞外結(jié)構(gòu)域、一個單程跨膜結(jié)構(gòu)域和一個負責(zé)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)CRK在胞外區(qū)有兩個拷貝的未知功能域26(Domain of unknown function 26, DUF26)結(jié)構(gòu)域，DUF26結(jié)構(gòu)域包含三個C-X8-C-X2-C構(gòu)型的保守半胱氨酸殘基[3]，這些半胱氨酸可能形成二硫醇氧化還原調(diào)節(jié)的潛在靶點[4]。DUF26結(jié)構(gòu)域具有感知細胞外配體和傳遞信號到胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的作用，具有抗真菌活性，因此也被稱為抗真菌應(yīng)激結(jié)構(gòu)域[5]。

基因在調(diào)控植物抗病性和細胞程序性死亡(Programmed cell death, PCD)方面起著重要作用。在擬南芥中，和受到丁香假單胞菌的快速誘導(dǎo)表達，過量表達或會誘發(fā)細胞PCD，植株體內(nèi)病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins, PR)基因迅速表達，從而增強對丁香假單胞菌的抗性[6-7]；與同源的、和的過表達也會導(dǎo)致PCD[6, 8-9]；、和的過表達增強病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern, PAMP)觸發(fā)的免疫反應(yīng)，也增強了植物對丁香假單胞菌的抗性[10]；參與介導(dǎo)細胞外活性氧的產(chǎn)生[11]。小麥調(diào)控小麥對禾谷絲核菌的抗性[12]；水稻中參與介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性[13]；海島棉中的參與抵御大麗輪枝菌，影響棉花對黃萎病的抗性[14]；小麥基因?qū)π←溔~枯病菌具有廣譜抗性[15]。這些研究表明，基因在植物抗病性調(diào)控中扮演重要角色。目前水稻中已報道了45個基因[14]，然而，它們在水稻抗病防御中起何作用還不是很清楚。

紋枯病是水稻最主要的病害之一，其致病菌是強腐生型立枯絲核菌(Kühn)，主要侵染水稻葉鞘和葉片，通?？稍斐?0％～30％的產(chǎn)量損失，嚴重發(fā)生時可達50％以上[16]。全國農(nóng)技推廣官網(wǎng)（http://www.natesc.gov.cn/）中的歷年數(shù)據(jù)顯示，紋枯病造成的產(chǎn)量損失一直位于水稻各病害之首。研究發(fā)現(xiàn)，植物激素乙烯(ethylene，ET)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、細胞分裂素(cytokinin，CK)和生長素信號在水稻抵御紋枯病菌侵染中起重要作用[17-18]，比如，過表達轉(zhuǎn)錄因子和可通過激活JA/ET信號途徑提高水稻紋枯病抗性[19-20]；過表達乙烯合成基因可顯著提高乙烯含量，增強紋枯病抗性[21]；在水稻中導(dǎo)入芥菜型油菜中參與SA介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性的基因可增強紋枯病抗性[22]；SA處理可以抑制紋枯病菌在侵染過程中的增殖，從而增強水稻對紋枯病抗性[23]；滲調(diào)蛋白基因的超表達可明顯提高水稻對紋枯病的抗性，并證明其與JA信號激活有關(guān)[24]；Zhang等[25]鑒定到27個抗紋枯病位點，結(jié)合候選基因分析認為JA和SA信號途徑與紋枯病抗性密切相關(guān)。最近，Qiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)水稻中的一個siRNA可通過影響生長素的動態(tài)平衡抑制水稻對紋枯病菌的免疫反應(yīng)；我們近期的研究發(fā)現(xiàn)ET類物質(zhì)和ET合成抑制劑處理水稻可分別增強和降低紋枯病抗性，并且證明ET受體突變體相對于野生型更感紋枯病[26]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)體外噴施CK類物質(zhì)或者提高水稻內(nèi)源性CK的含量，可增強水稻對紋枯病的抗性[27-28]。

為了分析可能參與紋枯病抗性調(diào)控途徑的基因以及它們可能涉及的信號通路，本研究系統(tǒng)分析了水稻中45個基因在紋枯病菌接種前后的表達變化，同時分析了這些基因在植物激素ET、JA、SA和CK處理下的表達情況和不同組織中的表達特征，為進一步研究基因在水稻對

紋枯病菌防御反應(yīng)中的功能機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌株

水稻材料為感紋枯病品種Dongjin，紋枯病菌菌株為本實驗室一直采用的中強致病力菌株YN-7。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從Gramene網(wǎng)站（http://www.gramene.org/）下載45個OsCRK蛋白序列，使用軟件ClustalX 2.01進行序列比對，參數(shù)設(shè)為默認值，序列比對結(jié)果經(jīng)過修正后使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建“neighbor-joining”（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設(shè)為1000次重復(fù)。

1.3 水稻紋枯病菌培養(yǎng)及接種方法

水稻紋枯病菌培養(yǎng)及接種方法參照賀閩等[29]進行。首先將切成1 cm長、2 mm寬的0.8 mm厚的木片均勻平鋪在直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，加入PDB（potato dextrose broth）培養(yǎng)液，將紋枯病菌菌塊接種于正中間，28℃下黑暗培養(yǎng)3 d，布有紋枯病菌菌絲的木片即為接種物。將水稻品種Dongjin在溫室中培養(yǎng)至分蘗末期，用鑷子將木片接種物嵌入自上而下第3葉葉枕下1 cm處葉鞘內(nèi)側(cè)，相對濕度控制在85%～95%，溫度控制在25～31 ℃；接種后0、6、9、12、24 和48 h分別取接種位置上下1 cm葉鞘組織樣品。

1.4 激素處理

水稻在溫室中生長至4葉期時，分別噴施500 μmol/L乙烯利（ET）、100 μmol/L茉莉酸（JA）、8 mmol/L水楊酸（SA）及50 μmol/L細胞分裂素（CK），同時設(shè)置空白處理對照[30]，處理后0、4、12、24 h取整株水稻樣品。

1.5 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR分析

采用Trizol法提取各水稻樣品總RNA。采用HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR（南京諾維贊生物科技股份有限公司）逆轉(zhuǎn)錄酶合成第1鏈cDNA，合成方法按照逆轉(zhuǎn)錄酶的說明進行。qPCR體系為：ChamQ?SYBR?qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10 μL，PCR前后引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA模板2 μL（100 ng/μL），ddH2O 6 μL。采用熒光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96 TouchTM）進行qPCR：95℃下預(yù)變性3 min；95℃下變性15 s，60℃下退火延伸30 s，40個循環(huán)。表達值數(shù)據(jù)釆用2?ΔΔCt方法進行轉(zhuǎn)換分析。內(nèi)參基因（）的qPCR前引物為CCTGGCTGACTACAACATC，后引物為AGTTG ACAGCCCTAGGGTG；水稻中45個基因的qPCR引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRK蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

我們根據(jù)CRK家族蛋白在染色體上的位置將它們命名為OsCRK1～OsCRK45(表1、圖1)，它們的長度和分子量分別為163～897個氨基酸和18.63～95.79 kDa；21個CRK蛋白的理論等電點(pI)呈弱酸性(4.38～6.99)，23個呈堿性(7.04～10.58)，1個中性(7.00)。

我們進一步構(gòu)建了CRK蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1-A），根據(jù)進化關(guān)系的遠近，這些蛋白可以分為兩個主要簇，第一個主要簇分為3個次要組，第二個則為1個次要組，因此，系統(tǒng)發(fā)育樹可將CRK蛋白分為4個組：組Ⅰ～組Ⅳ。有趣的是，結(jié)合CRK在染色體上的分布（圖1-B），我們發(fā)現(xiàn)在染色體上成簇或緊密分布的CRK大部分來自同一組或同一分支。例如，第7染色體上的8個成簇分布的CRK中有7個屬于組Ⅰ，且多數(shù)屬于同一分支（如CRK25和CRK28，CRK26和CRK27等）；第12染色體上的4個成簇分布的CRK蛋白都屬于組Ⅲ，其中CRK44和CRK45屬于同一分支；第4染色體上緊密分布的CRK10和CRK11屬于組Ⅲ，CRK13和CRK14屬于組Ⅳ中的同一分支；第12染色體上的CRK40和CRK41屬于組Ⅱ的同一分支；第9染色體上的CRK32和CRK33屬于組Ⅲ；第11染色體上CRK38和CRK39屬于組Ⅱ。

2.2 CRK基因在紋枯病菌侵染后的表達特征

為了解基因?qū)y枯病菌侵染的響應(yīng)特征，選擇感病品種Dongjin進行溫室分蘗末期紋枯病菌接種，在接種后0、6、9、12、24、48 h取葉鞘組織分析各基因的轉(zhuǎn)錄水平。如圖2所示，我們將倍數(shù)變化（Fold change，）≥1.5或≤0.67（即|Log2|≥0.58）的基因定為顯著變化基因。我們發(fā)現(xiàn)45個基因中響應(yīng)紋枯病菌的基因有41個，其中受誘導(dǎo)上調(diào)表達的基因有19個，下調(diào)表達的有22個，、、和不響應(yīng)紋枯病菌；受誘導(dǎo)上調(diào)表達基因主要集中在組Ⅰ和組Ⅳ中，受誘導(dǎo)下調(diào)表達基因主要集中在組Ⅱ和組Ⅲ中。根據(jù)響應(yīng)時期，早期受誘導(dǎo)（在紋枯病菌接種后12 h之前受誘導(dǎo)，包括12 h）上調(diào)的基因有、和，下調(diào)的有、、、和；晚期受誘導(dǎo)（在紋枯病菌接種后12 h之后受誘導(dǎo)）上調(diào)的基因有和，下調(diào)的有、、、和；持續(xù)受誘導(dǎo)（早期和晚期都受誘導(dǎo)）上調(diào)的基因有、、、、、、、、、、、、和，下調(diào)的有、、、、、、、、、、和。根據(jù)響應(yīng)強度，受誘導(dǎo)上調(diào)表達強烈（其中一個時間點上調(diào)表達4倍以上）的基因有、、、、、、、、、、和，受誘導(dǎo)下調(diào)表達強烈（其中一個時間點下調(diào)表達4倍以上）的基因有、、、和。進一步，發(fā)現(xiàn)同一分支的兩個同源性較高的基因受紋枯病菌誘導(dǎo)表達特征類似，比如，同一分支的和、和、和等受誘導(dǎo)上調(diào)表達特征類似，同一分支的和、和等受誘導(dǎo)下調(diào)表達特征類似。

表1 水稻OsCRK基因家族及其熒光定量PCR引物