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        水稻富含半胱氨酸類受體激酶家族基因?qū)y枯病菌和植物激素的響應(yīng)特征分析

        2021-09-13 23:21:12馮志明王廣達趙劍華居冉李夢臣高鵬胡珂鳴陳宗祥左示敏
        中國水稻科學(xué) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:紋枯病侵染結(jié)構(gòu)域

        馮志明 王廣達 趙劍華 居冉 李夢臣 高鵬 胡珂鳴 陳宗祥 左示敏, *

        水稻富含半胱氨酸類受體激酶家族基因?qū)y枯病菌和植物激素的響應(yīng)特征分析

        馮志明1, 2王廣達1趙劍華1居冉1李夢臣1高鵬1胡珂鳴1, 2陳宗祥1, 2左示敏1, 2, *

        (1揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點實驗室/植物功能基因組學(xué)教育部重點實驗室, 江蘇揚州225009;2揚州大學(xué)江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省作物遺傳生理重點實驗室, 江蘇揚州 225009;*通信聯(lián)系人,E-mail: smzuo@yzu.edu.cn)

        【目的】明確水稻富含半胱氨酸類受體激酶(Cysteine-rich receptor-like kinases,CRK)家族基因?qū)y枯病菌侵染和植物激素的響應(yīng)特征,是解析在水稻紋枯病抗性中的功能的重要前期工作?!痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)方法構(gòu)建了水稻45個的系統(tǒng)發(fā)育樹,并利用qPCR分析了它們對紋枯病菌和對植物激素乙烯(Ethylene,ET)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)、水楊酸(Salicylic acid,SA)和細胞分裂素(Cytokinin,CK)等的響應(yīng)特征,以及在水稻不同組織中的表達模式?!窘Y(jié)果】水稻家族可分為4個組,在染色體上成簇或緊密分布的大部分來自同一組或同一分支。41個響應(yīng)紋枯病菌侵染,其中17個響應(yīng)強烈;結(jié)合組織表達模式,發(fā)現(xiàn)這17個基因中,、、、、、、、、和等10個基因在葉鞘和葉片中表達較強,暗示這些基因可能參與了對紋枯病的抗性;大部分同一分支的兩個同源性較高的對紋枯病菌的響應(yīng)特征類似, 表明這些基因在調(diào)控紋枯病抗性上可能存在功能冗余。40個對3種或4種植物激素均有響應(yīng),它們對不同激素的響應(yīng)存在差異性,說明可能廣泛參與這些激素介導(dǎo)的防御信號途徑;對JA和SA響應(yīng)相反的有17個,對JA和SA、ET和JA、ET和SA響應(yīng)類似的分別有21、21、23個。這不僅反映了ET、JA、SA信號途徑間的協(xié)同和拮抗作用,也說明這些基因可能參與ET、JA和SA間的交互作用?!窘Y(jié)論】鑒定到一些可能參與調(diào)控水稻紋枯病抗性的基因,且它們可能在植物激素介導(dǎo)的防御途徑中起作用。這為我們進一步探索在調(diào)控水稻紋枯病抗性上的功能提供了科學(xué)線索。

        水稻;基因;紋枯??;防御相關(guān)激素;響應(yīng)特征

        植物生活在復(fù)雜的環(huán)境中,不斷受到各種病原菌的威脅,為了抵御病原菌的攻擊,植物進化出了復(fù)雜的策略,并將其轉(zhuǎn)化為有效的免疫反應(yīng)[1]。類受體激酶(Receptor-like kinase,RLK)在感知外界刺激、激活下游信號通路、調(diào)節(jié)細胞對病原菌侵染的反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[2]。富含半胱氨酸的類受體激酶(Cysteine-rich receptor-like kinases,CRK)是植物RLK的一個亞家族,具有典型的RLK結(jié)構(gòu)特征,即含有一個負責(zé)信號感知的胞外結(jié)構(gòu)域、一個單程跨膜結(jié)構(gòu)域和一個負責(zé)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)CRK在胞外區(qū)有兩個拷貝的未知功能域26(Domain of unknown function 26, DUF26)結(jié)構(gòu)域,DUF26結(jié)構(gòu)域包含三個C-X8-C-X2-C構(gòu)型的保守半胱氨酸殘基[3],這些半胱氨酸可能形成二硫醇氧化還原調(diào)節(jié)的潛在靶點[4]。DUF26結(jié)構(gòu)域具有感知細胞外配體和傳遞信號到胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的作用,具有抗真菌活性,因此也被稱為抗真菌應(yīng)激結(jié)構(gòu)域[5]。

        基因在調(diào)控植物抗病性和細胞程序性死亡(Programmed cell death, PCD)方面起著重要作用。在擬南芥中,和受到丁香假單胞菌的快速誘導(dǎo)表達,過量表達或會誘發(fā)細胞PCD,植株體內(nèi)病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins, PR)基因迅速表達,從而增強對丁香假單胞菌的抗性[6-7];與同源的、和的過表達也會導(dǎo)致PCD[6, 8-9];、和的過表達增強病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern, PAMP)觸發(fā)的免疫反應(yīng),也增強了植物對丁香假單胞菌的抗性[10];參與介導(dǎo)細胞外活性氧的產(chǎn)生[11]。小麥調(diào)控小麥對禾谷絲核菌的抗性[12];水稻中參與介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性[13];海島棉中的參與抵御大麗輪枝菌,影響棉花對黃萎病的抗性[14];小麥基因?qū)π←溔~枯病菌具有廣譜抗性[15]。這些研究表明,基因在植物抗病性調(diào)控中扮演重要角色。目前水稻中已報道了45個基因[14],然而,它們在水稻抗病防御中起何作用還不是很清楚。

        紋枯病是水稻最主要的病害之一,其致病菌是強腐生型立枯絲核菌(Kühn),主要侵染水稻葉鞘和葉片,通??稍斐?0%~30%的產(chǎn)量損失,嚴重發(fā)生時可達50%以上[16]。全國農(nóng)技推廣官網(wǎng)(http://www.natesc.gov.cn/)中的歷年數(shù)據(jù)顯示,紋枯病造成的產(chǎn)量損失一直位于水稻各病害之首。研究發(fā)現(xiàn),植物激素乙烯(ethylene,ET)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、水楊酸(salicylic acid,SA)、細胞分裂素(cytokinin,CK)和生長素信號在水稻抵御紋枯病菌侵染中起重要作用[17-18],比如,過表達轉(zhuǎn)錄因子和可通過激活JA/ET信號途徑提高水稻紋枯病抗性[19-20];過表達乙烯合成基因可顯著提高乙烯含量,增強紋枯病抗性[21];在水稻中導(dǎo)入芥菜型油菜中參與SA介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性的基因可增強紋枯病抗性[22];SA處理可以抑制紋枯病菌在侵染過程中的增殖,從而增強水稻對紋枯病抗性[23];滲調(diào)蛋白基因的超表達可明顯提高水稻對紋枯病的抗性,并證明其與JA信號激活有關(guān)[24];Zhang等[25]鑒定到27個抗紋枯病位點,結(jié)合候選基因分析認為JA和SA信號途徑與紋枯病抗性密切相關(guān)。最近,Qiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)水稻中的一個siRNA可通過影響生長素的動態(tài)平衡抑制水稻對紋枯病菌的免疫反應(yīng);我們近期的研究發(fā)現(xiàn)ET類物質(zhì)和ET合成抑制劑處理水稻可分別增強和降低紋枯病抗性,并且證明ET受體突變體相對于野生型更感紋枯病[26]。另外,我們還發(fā)現(xiàn)體外噴施CK類物質(zhì)或者提高水稻內(nèi)源性CK的含量,可增強水稻對紋枯病的抗性[27-28]。

        為了分析可能參與紋枯病抗性調(diào)控途徑的基因以及它們可能涉及的信號通路,本研究系統(tǒng)分析了水稻中45個基因在紋枯病菌接種前后的表達變化,同時分析了這些基因在植物激素ET、JA、SA和CK處理下的表達情況和不同組織中的表達特征,為進一步研究基因在水稻對

        紋枯病菌防御反應(yīng)中的功能機制提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 植物材料和菌株

        水稻材料為感紋枯病品種Dongjin,紋枯病菌菌株為本實驗室一直采用的中強致病力菌株YN-7。

        1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

        從Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)下載45個OsCRK蛋白序列,使用軟件ClustalX 2.01進行序列比對,參數(shù)設(shè)為默認值,序列比對結(jié)果經(jīng)過修正后使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建“neighbor-joining”(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap設(shè)為1000次重復(fù)。

        1.3 水稻紋枯病菌培養(yǎng)及接種方法

        水稻紋枯病菌培養(yǎng)及接種方法參照賀閩等[29]進行。首先將切成1 cm長、2 mm寬的0.8 mm厚的木片均勻平鋪在直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中,加入PDB(potato dextrose broth)培養(yǎng)液,將紋枯病菌菌塊接種于正中間,28℃下黑暗培養(yǎng)3 d,布有紋枯病菌菌絲的木片即為接種物。將水稻品種Dongjin在溫室中培養(yǎng)至分蘗末期,用鑷子將木片接種物嵌入自上而下第3葉葉枕下1 cm處葉鞘內(nèi)側(cè),相對濕度控制在85%~95%,溫度控制在25~31 ℃;接種后0、6、9、12、24 和48 h分別取接種位置上下1 cm葉鞘組織樣品。

        1.4 激素處理

        水稻在溫室中生長至4葉期時,分別噴施500 μmol/L乙烯利(ET)、100 μmol/L茉莉酸(JA)、8 mmol/L水楊酸(SA)及50 μmol/L細胞分裂素(CK),同時設(shè)置空白處理對照[30],處理后0、4、12、24 h取整株水稻樣品。

        1.5 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR分析

        采用Trizol法提取各水稻樣品總RNA。采用HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(南京諾維贊生物科技股份有限公司)逆轉(zhuǎn)錄酶合成第1鏈cDNA,合成方法按照逆轉(zhuǎn)錄酶的說明進行。qPCR體系為:ChamQ?SYBR?qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)10 μL,PCR前后引物各1 μL(10 μmol/L),cDNA模板2 μL(100 ng/μL),ddH2O 6 μL。采用熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96 TouchTM)進行qPCR:95℃下預(yù)變性3 min;95℃下變性15 s,60℃下退火延伸30 s,40個循環(huán)。表達值數(shù)據(jù)釆用2?ΔΔCt方法進行轉(zhuǎn)換分析。內(nèi)參基因()的qPCR前引物為CCTGGCTGACTACAACATC,后引物為AGTTG ACAGCCCTAGGGTG;水稻中45個基因的qPCR引物序列見表1。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 CRK蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

        我們根據(jù)CRK家族蛋白在染色體上的位置將它們命名為OsCRK1~OsCRK45(表1、圖1),它們的長度和分子量分別為163~897個氨基酸和18.63~95.79 kDa;21個CRK蛋白的理論等電點(pI)呈弱酸性(4.38~6.99),23個呈堿性(7.04~10.58),1個中性(7.00)。

        我們進一步構(gòu)建了CRK蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1-A),根據(jù)進化關(guān)系的遠近,這些蛋白可以分為兩個主要簇,第一個主要簇分為3個次要組,第二個則為1個次要組,因此,系統(tǒng)發(fā)育樹可將CRK蛋白分為4個組:組Ⅰ~組Ⅳ。有趣的是,結(jié)合CRK在染色體上的分布(圖1-B),我們發(fā)現(xiàn)在染色體上成簇或緊密分布的CRK大部分來自同一組或同一分支。例如,第7染色體上的8個成簇分布的CRK中有7個屬于組Ⅰ,且多數(shù)屬于同一分支(如CRK25和CRK28,CRK26和CRK27等);第12染色體上的4個成簇分布的CRK蛋白都屬于組Ⅲ,其中CRK44和CRK45屬于同一分支;第4染色體上緊密分布的CRK10和CRK11屬于組Ⅲ,CRK13和CRK14屬于組Ⅳ中的同一分支;第12染色體上的CRK40和CRK41屬于組Ⅱ的同一分支;第9染色體上的CRK32和CRK33屬于組Ⅲ;第11染色體上CRK38和CRK39屬于組Ⅱ。

        2.2 CRK基因在紋枯病菌侵染后的表達特征

        為了解基因?qū)y枯病菌侵染的響應(yīng)特征,選擇感病品種Dongjin進行溫室分蘗末期紋枯病菌接種,在接種后0、6、9、12、24、48 h取葉鞘組織分析各基因的轉(zhuǎn)錄水平。如圖2所示,我們將倍數(shù)變化(Fold change,)≥1.5或≤0.67(即|Log2|≥0.58)的基因定為顯著變化基因。我們發(fā)現(xiàn)45個基因中響應(yīng)紋枯病菌的基因有41個,其中受誘導(dǎo)上調(diào)表達的基因有19個,下調(diào)表達的有22個,、、和不響應(yīng)紋枯病菌;受誘導(dǎo)上調(diào)表達基因主要集中在組Ⅰ和組Ⅳ中,受誘導(dǎo)下調(diào)表達基因主要集中在組Ⅱ和組Ⅲ中。根據(jù)響應(yīng)時期,早期受誘導(dǎo)(在紋枯病菌接種后12 h之前受誘導(dǎo),包括12 h)上調(diào)的基因有、和,下調(diào)的有、、、和;晚期受誘導(dǎo)(在紋枯病菌接種后12 h之后受誘導(dǎo))上調(diào)的基因有和,下調(diào)的有、、、和;持續(xù)受誘導(dǎo)(早期和晚期都受誘導(dǎo))上調(diào)的基因有、、、、、、、、、、、、和,下調(diào)的有、、、、、、、、、、和。根據(jù)響應(yīng)強度,受誘導(dǎo)上調(diào)表達強烈(其中一個時間點上調(diào)表達4倍以上)的基因有、、、、、、、、、、和,受誘導(dǎo)下調(diào)表達強烈(其中一個時間點下調(diào)表達4倍以上)的基因有、、、和。進一步,發(fā)現(xiàn)同一分支的兩個同源性較高的基因受紋枯病菌誘導(dǎo)表達特征類似,比如,同一分支的和、和、和等受誘導(dǎo)上調(diào)表達特征類似,同一分支的和、和等受誘導(dǎo)下調(diào)表達特征類似。

        表1 水稻OsCRK基因家族及其熒光定量PCR引物

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