張士凱 王 敏 程欣欣 張啟月 吳 澎

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018)

黃精(Polygonatum sibiricum)是百合科黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物，為中華名藥之一，多生于山坡背陽處、灌木叢中及樹蔭下，其莖柔長，葉呈線針狀，略卷曲，五枚輪生，花開夏季，為白色或淡黃色，成熟時(shí)呈紫黑色，根莖橫生，可藥食兩用。其中多糖是黃精中主要的活性成分之一，具有降血壓、降血脂、延緩衰老、改善心腦血管功能和預(yù)防腫瘤等功效[1－3]。

目前提取黃精多糖常用的方法有熱水浸提法、酸堿提取法、酶法提取等[4]。傳統(tǒng)的提取方式耗能高、周期長、工序復(fù)雜，會(huì)破壞小分子活性成分。超高壓提取技術(shù)為非熱技術(shù)，具有快速、短時(shí)、節(jié)能、操作簡單、高效等優(yōu)勢，不會(huì)對熱敏性及小分子活性物質(zhì)造成破壞[5]，為食品領(lǐng)域科學(xué)研究、天然物質(zhì)提取及工藝革新提供了新的思路。

機(jī)體在進(jìn)行高強(qiáng)度或長時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)，會(huì)引起身體疲勞與不適，影響機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力，導(dǎo)致工作效率低下[6]。研究表明，黃精具有抗氧化、緩解運(yùn)動(dòng)疲勞等功效，楊華杰等[7]比較了不同炮制黃精提取液的抗疲勞作用，結(jié)果表明，黃精各炮制品提取液均具備顯著的抗疲勞作用；馬懷芬等[8]以人參皂苷為陽性對照，通過小鼠游泳時(shí)間及肝糖原含量驗(yàn)證了黃精提取液的抗疲勞能力；陳靚雯等[9]通過對比灌胃黃精粗提物前后小鼠游泳時(shí)間、血清尿素氮、肝糖原、血乳酸水平的變化，發(fā)現(xiàn)黃精粗提物具有一定抗疲勞功效。關(guān)于黃精抗疲勞功效的研究并不缺少[10]，但是缺乏對其機(jī)制的深入了解與全面分析。

本試驗(yàn)采用超高壓技術(shù)提取炮制黃精多糖(processing of polygonatum polysaccharide，PPP)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并以優(yōu)化提取的PPP 為原料，通過小鼠力竭游泳時(shí)間及血清、肝臟、腓腸肌中相關(guān)酶指標(biāo)變化驗(yàn)證PPP 提高運(yùn)動(dòng)耐力的能力，并對其機(jī)制進(jìn)行推測，以期為PPP 提高運(yùn)動(dòng)耐力的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精，取樣于山東泰安徂徠山地區(qū)；SPF 級昆明(KM) 種雄性小鼠[許可證編號: SYXK (魯)20170023]，四周齡，體重19～26 g，購于山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司；乳酸(lactic acid，Lac)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、血清尿素氮(serum urea nitrogen，SUN)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、ATP 酶、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)等試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M5 多功能酶標(biāo)儀，丹麥BioPorto 公司；HPP600MPA/3－5L 超高壓設(shè)備，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；5810/5810R 高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；UV-VIS-NIR 紫外－可見分光光度計(jì)，美國Varian 公司。

1.3 黃精炮制

采用張偉娜等[11]描述的九蒸九曬方法對黃精進(jìn)行炮制。

1.4 黃精多糖提取與優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn) 采用水提醇沉法提取粗多糖[12]。將炮制黃精烘干制粉過60 目篩后備用。取黃精粉1.0 g，分別按液料比5、10、15、20、30 mL·g－1，保壓時(shí)間5 min，壓強(qiáng)200 MPa 進(jìn)行提?。蝗↑S精粉1.0 g，分別設(shè)保壓時(shí)間1、4、7、10、13 min，液料比20 mL·g－1，壓強(qiáng)200 MPa 進(jìn)行提??；取黃精粉1.0 g，分別設(shè)壓強(qiáng)100、200、300、400、500 MPa，液料比20 mL·g－1，保壓時(shí)間7 min 進(jìn)行提取，然后將浸提液于6 500 r·min－1離心10 min，取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以減小溶液體積，加入4 倍體積96%(v/v)乙醇醇沉過夜，離心棄上清，依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌沉淀各3 次，得PPP，按公式(1)計(jì)算PPP 得率[13]，得最佳單因素。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝6.823 6x－0.042 3(R2＝0.999 3)，用以計(jì)算多糖濃度。

1.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以PPP 得率為響應(yīng)值，探究液料比、壓強(qiáng)、保壓時(shí)間3個(gè)因素對PPP 得率的影響，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[14]，得最佳提取工藝，同時(shí)以相同工藝對生黃精進(jìn)行處理用作對照進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)。

1.5 PPP 提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力試驗(yàn)

1.5.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取50 只SPF 級KM 雄性小鼠，先適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，然后隨機(jī)分為5 組:PPP 高劑量組(1 600 mg·kg－1BW)、中劑量組(800 mg·kg－1BW)、 低劑量組(400 mg·kg－1BW)、空白對照組(0.9%生理鹽水)及生黃精提取物組(1 600 mg·kg－1BW)，連續(xù)灌胃19 d，灌胃量為每只0.5 mL·d－1，灌胃期間隔日對小鼠進(jìn)行稱重，統(tǒng)計(jì)進(jìn)食量，試驗(yàn)期間自由飲水[15]。

1.5.2 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn) 灌胃期間進(jìn)行4 次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，前3 次分別無負(fù)重游泳10、20 和30 min，第4 次負(fù)重(體重量1%鉛絲)游泳30 min，末次灌胃30 min 后，使小鼠尾部負(fù)重(體重量2%鉛絲)于水深30 cm 游泳箱中進(jìn)行力竭試驗(yàn)，水溫保持在25±1℃，記錄力竭游泳時(shí)間(頭部沉入水中6 s 不能浮上水面[16])。

1.6 PPP 提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力機(jī)制初探

1.6.1 動(dòng)物分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取30 只SPF 級KM 雄性小鼠，分為3 組:空白對照組(0.9%生理鹽水)、空白游泳 組(0.9%生理鹽水)、 PPP游泳組(800 mg·kg－1BW，最優(yōu)劑量)，連續(xù)灌胃19 d，灌胃量為每只0.5 mL·d－1，灌胃期間進(jìn)行3 次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練(同1.5.2)，末次灌胃30 min 后，將空白游泳組與PPP 游泳組于水深30 cm 游泳箱中負(fù)重(體重量2%鉛絲)游泳40 min，水溫保持在25±1℃，游泳結(jié)束后，立即對3組小鼠斷頭取血，解剖取肝臟、左腿腓腸肌，立即于－80℃冰箱保存[17]。

1.6.2 血清、肝臟和肌肉組織勻漿、線粒體制備 血清制備:小鼠斷頭取血后立即于3 500 r·min－1、4℃離心15 min，取上清即為血清，4℃保存[18]。

組織勻漿制備:取組織塊(0.2～1 g)用冰冷生理鹽水漂洗除去血液，然后加入10 倍生理鹽水，用眼科剪將組織剪碎，倒入玻璃勻漿管中進(jìn)行勻漿，充分研碎，使其組織勻漿化[19]。

線粒體提取:取10%組織勻漿于2 000 r·min－1離心10 min，取上清，9 500 r·min－1離心15 min，沉淀即為線粒體[20]。

1.6.3 疲勞相關(guān)指標(biāo)的測定 分別測定3 組小鼠血清SUN、Lac 含量和LDH、T-SOD 活性，肝臟MDA 含量，左腿腓腸肌線粒體CK、ATP 酶活性等指標(biāo)，按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行各指標(biāo)測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS statistics 24 軟件與Design-Expert.V8.0.6.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 9.1 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓提取PPP 工藝優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果 通過試驗(yàn)確定其在每一個(gè)單因素條件下的最佳參數(shù)，分別為液料比20 mL·g－1，壓強(qiáng)300 MPa，保壓時(shí)間7 min。

采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件，在最佳單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以PPP 得率為指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，共計(jì)17 組(表1)

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Box-Behnken test design and results

2.1.2 模型方程的建立分析及驗(yàn)證 采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析，將數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到PPP 得率(R)與壓強(qiáng)(C)、保壓時(shí)間(B)、液料比(A)的二次響應(yīng)面回歸方程為:R＝13.42＋0.36A－0.26B－0.25C＋0.10AB＋0.075BC－1.71A2－1.51B2－1.79C2，式中各項(xiàng)系數(shù)的絕對值表示單因素對水解度參數(shù)的影響程度，正負(fù)反映影響方向[21]。對模型進(jìn)行方差分析可知(表2)，此模型P<0.000 1，表明回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著，表明此模型擬合度良好，能較好解釋響應(yīng)中的變異；模型回歸系數(shù)R2＝0.985 4，＝0.966 7，說明此模型對試驗(yàn)擬合度好，誤差小，能解釋96.67%響應(yīng)值的變化，可以較好地預(yù)測超高壓提取PPP 的工藝參數(shù)，可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測[22]。

表2 回歸方程模型方差分析Table 2 Analysis of Variance of Regression Equation Model

圖1 可直觀反映各因素之間的交互作用，PPP 得率隨著液料比、保壓時(shí)間、壓強(qiáng)的增加呈先上升后下降趨勢，具有極大值。根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，得到最佳PPP 得率為13.46%，對應(yīng)的各最佳因素條件分別為:液料比23 mL·g－1、保壓時(shí)間6.73 min、壓強(qiáng)293 MPa。

為檢驗(yàn)預(yù)測模型的有效性，在最佳工藝條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，PPP 的提取率為13.12%，與模型預(yù)測值(13.46%)無顯著差異，證實(shí)擬合的響應(yīng)面模型具有良好的預(yù)測性，可用來預(yù)測黃精多糖提取率。在此工藝條件下提取的多糖濃度為58.19%，此外，未經(jīng)炮制的生黃精提取的多糖濃度為61.12%。

2.2 PPP 抗疲勞功能研究

2.2.1 試驗(yàn)期間小鼠體重及攝食量變化 在試驗(yàn)期間，小鼠生長正常，個(gè)別小鼠灌胃后反應(yīng)遲鈍，腹部脹氣，可能是一次性灌胃量過大引起，無死亡情況發(fā)生，灌胃30 min 后均活動(dòng)靈敏。每隔1 d 記錄小鼠體重與攝食量變化，發(fā)現(xiàn)各組小鼠體重變化情況無顯著差異(P>0.05)(圖2)，19 d 攝食量也相近，無顯著差異(P>0.05)(表3)，說明灌胃PPP 對小鼠體重增長和攝食量無明顯影響。

表3 小鼠進(jìn)食量變化Table 3 Changes in mouse food intake

2.2.2 小鼠力竭試驗(yàn)結(jié)果 疲勞最直接的表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)耐力下降。本試驗(yàn)通過測定小鼠力竭游泳時(shí)間判斷PPP 抗疲勞的功效，并比較不同濃度PPP 對游泳小鼠耐力提升表現(xiàn)。由圖3 可知，PPP 中劑量(163.57 min)和高劑量組(157.86 min)小鼠力竭游泳時(shí)間顯著高于空白對照組(114.43 min)；與空白對照組相比，低劑量組(127.17 min)與生黃精提取物組(119.91 min)小鼠力竭游泳時(shí)間略有提高，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明PPP 可提高小鼠運(yùn)動(dòng)耐力，具有一定抗疲勞功效。且PPP 抗疲勞效果比生黃精多糖效果更好，可能是在炮制過程中多糖內(nèi)部結(jié)構(gòu)或組成發(fā)生了微妙變化，從而賦予其更多的生物活性功能。

2.3 PPP 提高運(yùn)動(dòng)耐力機(jī)制初探

2.3.1 小鼠血清生化指標(biāo)變化 機(jī)體在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量Lac，使機(jī)體內(nèi)pH 值降低，Lac 的大量聚集會(huì)破壞機(jī)體酸堿平衡，進(jìn)而引起疲勞。SUN 是與疲勞相關(guān)的血液生化指標(biāo)之一，是蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物，也是衡量機(jī)體承受體力負(fù)荷時(shí)的靈敏指標(biāo)，機(jī)體對運(yùn)動(dòng)耐力的適應(yīng)能力越差，SUN 的增加就越明顯[23－24]。由表4 可知，與空白對照相比，小鼠游泳后，其血清Lac 含量、 LDH活性與SUN 含量顯著升高(P<0.05)，T-SOD活性略有上升，但無顯著差異(P>0.05)；PPP 游泳組與空白游泳組相比，小鼠血清Lac、SUN 含量顯著降低(P<0.05)，表明PPP 可有效減少小鼠體內(nèi)Lac、SUN 的產(chǎn)生。推測PPP 是通過增加糖原貯備，減少運(yùn)動(dòng)過程中Lac 的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)的分解，提高機(jī)體抗氧化、減輕運(yùn)動(dòng)應(yīng)激損傷等途徑達(dá)到提高運(yùn)動(dòng)耐力的功效。

表4 小鼠血清生化指標(biāo)Table 4 Determination of serum biochemical indicators in mice

2.3.2 小鼠肝臟MDA 含量變化 MDA 是一種膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量可間接反映機(jī)體的損傷程度[25]。由圖4 可知，相比于空白對照組(4.80 nmol·mL－1)，空白游泳組(6.69 nmol·mL－1)與PPP 游泳組小鼠肝臟MDA 含量均顯著升高(P<0.05)；PPP 游泳組小鼠肝臟MDA 含量低于空白游泳組。表明小鼠經(jīng)劇烈運(yùn)動(dòng)后，體內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激加強(qiáng)，出現(xiàn)一定損傷，推測PPP 是通過減輕機(jī)體運(yùn)動(dòng)過程中的氧化應(yīng)激損傷，降低脂質(zhì)過氧化程度從而達(dá)到提高運(yùn)動(dòng)耐力的效果。

2.3.3 小鼠腓腸肌線粒體生化指標(biāo)變化 機(jī)體的運(yùn)動(dòng)離不開ATP 酶。ATP 酶能將ATP 催化水解，釋放能量。肌肉活動(dòng)中起主要作用的ATP 酶有3 種:Na＋K＋-ATP、Ca2＋Mg2＋-ATP 與肌球蛋白ATP 酶。ATP酶活性可以反映機(jī)體能量代謝水平。CK 主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，可通過催化ATP 釋放能量參與機(jī)體活動(dòng)。機(jī)體強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，細(xì)胞膜在牽拉、震蕩、自由基攻擊等作用下膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致CK 外滲至血液[26－27]。由表5 可知，與空白對照組相比，空白游泳組腓腸肌線粒體CK 活性顯著降低(P<0.05)，而PPP 游泳組小鼠腓腸肌線粒體CK 活性較空白游泳組顯著提高；游泳組小鼠腓腸肌線粒體Na＋K＋-ATP 與Ca2＋Mg2＋-ATP 活性下降，其中PPP 游泳組Na＋K＋-ATP與Ca2＋Mg2＋-ATP 活性較空白游泳組稍有上升，但均不顯著(P>0.05)。推測PPP 可通過防止細(xì)胞膜受損而保護(hù)腓腸肌線粒體功能，減少線粒體的應(yīng)激損傷，對腓腸肌能量代謝產(chǎn)生一定的改善，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)過程中能量供給，有利于機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的保持與加強(qiáng)，通過改善線粒體代謝功能增加機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力，可能是PPP 具有緩解運(yùn)動(dòng)疲勞的重要機(jī)制。

表5 小鼠腓腸肌線粒體生化指標(biāo)Table 5 Determination of mitochondrial biochemical markers in mouse skeletal muscle

3 討論

傳統(tǒng)的多糖提取方法一般采用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的條件，所得廢液易對環(huán)境造成破壞。超高壓提取技術(shù)避免了強(qiáng)酸/堿溶液的使用，具有低溫、低耗等優(yōu)勢，對樣品活性成分影響小，為黃精功能性成分的分離及開發(fā)提供了新思路。本研究通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到PPP 最佳提取工藝為:液料比23 mL·g－1、保壓時(shí)間6.73 min，壓強(qiáng)293 MPa，在此條件下PPP 得率為13.46%。李麗等[28]利用水提醇沉工藝所得黃精多糖最佳得率為8.295%；魏煒等[29]采用超高壓提取黃精多糖，得到其最佳得率為19.83%。不同研究中黃精多糖提取率存在一定的差異，這可能與黃精品種和提取工藝的不同以及是否炮制有關(guān)。已有研究表明，2種提取技術(shù)的協(xié)同使用會(huì)提高產(chǎn)品得率與品質(zhì)[30]。建議后續(xù)開展超高壓與酶、超聲波、微波輔助等技術(shù)協(xié)同提取PPP 的研究。

機(jī)體高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后會(huì)產(chǎn)生過多自由基，從而影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)功能。本研究通過小鼠力竭游泳試驗(yàn)證實(shí)PPP 具有提高運(yùn)動(dòng)耐力的功效，這與楊華杰等[7]和馬懷芬等[8]對黃精和黃精提取液的抗疲勞研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，與空白游泳組相比，PPP 游泳組小鼠血清Lac 和SUN 含量顯著降低，T-SOD 活性上升，肝臟MDA 活性下降，腓腸肌線粒體中CK 和Ca2＋Mg2＋-ATP 活性上升，Na＋K＋-ATP 活性不變。推測其功能機(jī)制為，PPP 可提高小鼠抗氧化能力，增加糖原儲(chǔ)存，減少蛋白質(zhì)分解，使機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過程中減少Lac、SUN 等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時(shí)提高腓腸肌能量代謝能力，降低運(yùn)動(dòng)過程中線粒體的應(yīng)激損傷，進(jìn)而達(dá)到提高運(yùn)動(dòng)耐力的能力。這與陳靚雯等[9]通過小鼠力竭游泳時(shí)間及游泳前后其血清SUN 和Lac 水平對比研究黃精提取液抗疲勞機(jī)制的結(jié)果相一致。但本研究并沒有確定是哪種成分起作用，也未進(jìn)一步綜合分析抗疲勞機(jī)制研究，因此，可結(jié)合生物醫(yī)學(xué)、生物分子學(xué)等多領(lǐng)域?qū)W科深入分析PPP 抗疲勞的機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究對超高壓提取PPP 工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳工藝條件:液料比23 mL·g－1、保壓時(shí)間6.73 min，壓強(qiáng)293 MPa。此外，超高壓提取的PPP 能夠顯著延長小鼠力竭游泳時(shí)長，具有較好的提高運(yùn)動(dòng)耐力的效果，其可能是通過提高機(jī)體代謝與抗氧化能力，減少腓腸肌線粒體應(yīng)激損傷實(shí)現(xiàn)的。