李 森 王慶杰 陳修德 張 蕊 李 玲 杜桂英 付喜玲

(1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 泰安 271018；2五蓮縣果樹站，山東日照 262300)

生物和非生物脅迫是限制作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素。非生物脅迫影響植物的生理和生化層面，從而影響基因和蛋白的變化[1－2]。干旱脅迫作為最嚴(yán)重的非生物脅迫之一，極大地限制了植物的分布和作物產(chǎn)量[3]。近年來，隨著設(shè)施果樹栽培的迅猛發(fā)展，桃樹已成為保護(hù)地栽培的主要樹種之一，其栽培面積不斷擴(kuò)大[4]。桃屬于薔薇科核果類果樹，在中國大部分地區(qū)都有分布。但在部分缺水地區(qū)，干旱嚴(yán)重影響桃的生長發(fā)育及產(chǎn)量[5]。植物適應(yīng)干旱脅迫依賴各種分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)錄因子在其中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在桃中miRNAs、WRKY 轉(zhuǎn)錄因子和自噬相關(guān)基因能夠響應(yīng)干旱脅迫[6－7]；在桃WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族中WRKY11、WRKY18 及WRKY70 可能在干旱脅迫過程中發(fā)揮重要作用[8－9]。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及非生物脅迫過程中起著重要作用[10]。其N 端含有WRKY 結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域由保守的WRKYGQK 氨基酸殘基組成，是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域[11]。C 端含有一個新型的C2H2 或C2HC 鋅指結(jié)構(gòu)域。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域的特征，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子一般分為三大類，其中Ⅱ類WRKY 可以分為Ⅱa-e 五個亞類[12－13]。WRKY 基因表達(dá)具有組織特異性，受到各種非生物脅迫的誘導(dǎo)。已有研究證實(shí)，擬南芥(Arabidopsis thaliana)[14－15]、 煙 草(Nicotiana benthamiona)[16]的WRKY 基因響應(yīng)干旱脅迫。AtWRKY63 參與脫落酸(abscisic acid，ABA) 信號途徑及干旱脅迫響應(yīng)。AtWRKY57 過量表達(dá)能夠增強(qiáng)擬南芥對干旱的抗性。AtWRKY18 基因受干旱誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，并且可能通過調(diào)控AtDREB2A基因來提高抗脅迫的能力。研究還表明，AtWRKY18 在病原體反應(yīng)中具有重要作用[17]。此外，AtWRKY18 還能夠響應(yīng)非生物脅迫及介導(dǎo)ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18－19]。在干旱處理下，AtWRKY18 作為ABA 信號的正調(diào)控因子起著關(guān)鍵作用[20]。肖培連等[21]通過研究葡萄的各種非生物脅迫，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能夠誘導(dǎo)VvWRKY18 基因的表達(dá)。Chen 等[9]研究桃WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在花芽休眠時期的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Prupe.1G393000 在自然休眠期起著關(guān)鍵作用。植物在冬季的自然休眠伴隨著干旱缺水環(huán)境，因此猜測桃Prupe.1G393000 轉(zhuǎn)錄因子可能在干旱脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究從桃魯蜜一號克隆出一個WRKY 轉(zhuǎn)錄因子(Prupe.1G393000)，命名為PpWRKY18，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位和誘導(dǎo)蛋白分析，利用實(shí)時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)分析其在干旱脅迫及復(fù)水下基因表達(dá)變化，旨在為進(jìn)一步明確PpWRKY18 的生物學(xué)特性及響應(yīng)干旱機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以兩年生設(shè)施栽培條件下桃魯蜜一號(Prunus persicaL. cv. Lumi 1)為試驗(yàn)材料(來源于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站)，根據(jù)Wang 等[7]葉片自然干旱處理方法，在2、4、6、8、10、11 和12 d 取樣，13 d 干旱復(fù)水，14 d 取樣，并將樣品用液氮速凍后置于－80℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 RNA 提取及qRT-PCR

按照RNA prep Pure Plant Kit[DP441，天根生化科技(北京)有限公司]試劑盒所提供的方法提取桃葉片 RNA，測定RNA的濃度及質(zhì)量。利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以UBQ作為內(nèi)參基因，采用SYBR Premix Ex Taq 進(jìn)行RT-qPCR，PCR 循環(huán)結(jié)束后，利用溶解曲線測定，采用2－ΔΔCT方法進(jìn)行相對定量表達(dá)分析。

1.3 WRKY18 基因克隆

利用桃基因登錄號( Prupe. 1G393000) 在Phytozome v12.1 網(wǎng)站查找編碼序列( Coding sequence)。利用DNAMAN 軟件設(shè)計引物(表1)，以桃cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10 μL 5×HF PhusionBuffer、1 μL 10 mmol·L－1dNTPs、2.5 μL Forward primer、 2.5 μL Reverse primer、 1 μL TemplateDNA、0.5 μL Phusion DNA Polymerase，加水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 98℃預(yù)變性30 s； 98℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min (共34 個循環(huán))；72℃終延伸10 min，10℃保存。擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]對目的片段進(jìn)行凝膠回收純化；將目的片段連接pEASY-Blunt Zero 載體，過夜轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，挑選陽性克隆單菌落，送到生工生物工程(青島)股份有限公司測序，獲得目的基因。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過GSDS(http:/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/)網(wǎng)站繪制PpWRKY18 基因結(jié)構(gòu)圖。利用 WoLF PSORT(https:/ /psort.hgc.jp/)網(wǎng)站對PpWRKY18 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用PlantTFDB(http:/ /planttfdb.cbi. pku. edu. cn/index. php) 及 TAIR (http:/ /www.arabidopsis.org)網(wǎng)站BLAST 查找不同物種的WRKY18蛋白氨基酸序列，通過DNAMAN 軟件分析其保守序列，根據(jù)Tamura 等[22]的方法利用MEGA6 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。采用STRING (https:/ /string-db.org)網(wǎng)站預(yù)測互作蛋白，利用Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.5 亞細(xì)胞定位

使用載體為帶綠色熒光蛋白的pZP211 載體，根據(jù)PpWRKY18 基因的全長序列和載體圖譜設(shè)計引物序列(表1)，將去掉終止密碼子的PpWRKY18 全長編碼序列(coding sequence，CDS)序列片段連接到pZP211載體，得到PpWRKY18-GFP 融合表達(dá)載體，然后根據(jù)Chen 等[23]的方法，將PpWRKY18-GFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101 型農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用PCR 鑒定是否為陽性克??；挑取陽性農(nóng)桿菌單菌落分別置于含卡那霉素(50 mg·L－1)和利福平(50 mg·L－1)的發(fā)根農(nóng)桿菌YEP(yeast extract peptone)液體培養(yǎng)基中，放置28℃搖床中活化2 次，當(dāng)菌液濃度為OD600值為0.8 左右，離心5 min，吸除上清收集菌體，用侵染緩沖液(10 mmol·L－1MES-KOH、10 mmol·L－1MgCl2、0.1 mmol·L－1乙酰丁香酮)重懸菌體至OD600值為0.5～0.6，室溫靜置4 h 后將重懸菌液注射到本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉片背面。培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d 后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察PpWRKY18-GFP 信號并拍照記錄，采用二脒基苯基吲哚(diamidino-phenyl-indole，DAPI)染料進(jìn)行核定位分析。

1.6 PpWRKY18 原核載體構(gòu)建及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

根據(jù)蛋白表達(dá)載體PGEX4T－1 序列設(shè)計引物(表1)，將PpWRKY18 全長CDS 序列連接到載體上，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，成功構(gòu)建表達(dá)載體GST-PpWRKY18。當(dāng)菌液濃度OD600達(dá)到0.6～0.8 后，加入1 mmol·L－1異丙基－β－D－硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)，在30℃條件下誘導(dǎo)蛋白，分別在0 h 和6 h 時取樣。6 h后離心收集菌體，用5 mL PBS 緩沖液懸浮，超聲破碎6 s，停9 s (25 個循環(huán))，分離可溶性蛋白和包涵體，4℃、10 000×g條件下離心10 min，收集上清和沉淀。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳( polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離后將蛋白轉(zhuǎn)移到考馬斯亮藍(lán)液體中染色30 min，然后進(jìn)行脫色觀察，拍照。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 PpWRKY18 基因克隆及序列分析

以桃葉片cDNA 為模板，利用GFP-WRKY18-F/R引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到Prupe.1G393000 基因(圖1)。Prupe.1G393000 基因的CDS 序列長度為984 bp，編碼327 個氨基酸。在擬南芥基因組網(wǎng)站TAIR 進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)Prupe. 1G393000與擬南芥中AtWRKY18 基因最為相似，因此命名為PpWRKY18。對PpWRKY18 基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有5 個外顯子和4 個內(nèi)含子(圖2)。

2.2 PpWRKY18 進(jìn)化樹分析

在PlantTFDB 網(wǎng)站中下載梅、梨、蘋果、葡萄和擬南芥中的WRKY18 氨基酸序列，利用MEGA6 軟件，通過鄰近算法[24]對不同物種中的WRKY18 蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，如圖3 所示。桃PpWRKY18 與梅PmWRKY18、梨PbrWRKY18 和蘋果MdWRKY18 親緣關(guān)系較近，表明薔薇科物種WRKY18 蛋白功能具有更高的相似性。進(jìn)一步通過DNAMAN 軟件進(jìn)行多序列比對，結(jié)果表明6 個物種的WRKY18 蛋白都含有保守的WRKYGQK 氨基酸七肽序列(圖4)。

2.3 PpWRKY18 蛋白的亞細(xì)胞定位

為確定PpWRKY18 蛋白在細(xì)胞的定位情況，通過WoLF PSORT 網(wǎng)站預(yù)測，PpWRKY18 蛋白可能定位在細(xì)胞核中。將GFP-PpWRKY18 融合表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌注射到本氏煙草葉片，培養(yǎng)2 d 后，通過共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)PpWRKY18－pPZP211 的融合蛋白在煙草中只有在細(xì)胞核中才能觀察到綠色熒光，進(jìn)一步使用DAPI 染色發(fā)現(xiàn)信號重疊。綜上表明PpWRKY18 蛋白定位于細(xì)胞核中。

2.4 PpWRKY18 誘導(dǎo)蛋白分析

通過GST-WRKY18 引物擴(kuò)增基因，并連接到PGEX4T－1 載體上。將PGEX-PpWRKY18 融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，利用1 mmol·L－1IPTG 在37℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，6 h 后取菌液，并進(jìn)行超聲波破碎，利用SDS-PAGE 檢測是否有蛋白的產(chǎn)生，結(jié)果如圖6 所示。在0 h 無IPTG 誘導(dǎo)時，沒有目的蛋白表達(dá)，重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)6 h 后產(chǎn)生了一條分子量大于55 kDa 的特異性條帶，由于載體中GST 表達(dá)標(biāo)簽為26 kDa 左右，PpWRKY18 蛋白大小約為65 kDa，所誘導(dǎo)蛋白的實(shí)際大小符合預(yù)期。綜上所述，1.0 mmol·L－1的IPTG 可誘導(dǎo)PpWRKY18 融合蛋白的表達(dá)，蛋白主要存在于包涵體中。

2.5 PpWRKY18 響應(yīng)干旱脅迫信號

由圖7 可知，隨著干旱脅迫時間的延長，PpWRKY18 的表達(dá)量也呈現(xiàn)逐漸上升的狀態(tài)。干旱脅迫12 d 時，PpWRKY18 的表達(dá)量較處理初期顯著增加，第13 天干旱復(fù)水，次日取樣(14 d)，定量結(jié)果顯示PpWRKY18 的表達(dá)量顯著降低，這表明PpWRKY18 受干旱脅迫所誘導(dǎo)。

2.6 PpWRKY18 相互作用蛋白預(yù)測

為進(jìn)一步研究PpWRKY與響應(yīng)干旱信號通路基因的互作關(guān)系，利用STRING 網(wǎng)站查找PpWRKY18 的相互作用蛋白，然后通過Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖8 所示。與PpWRKY18 互作的干旱通路蛋白可能有蛋白磷酸酶家族(Protein Phosphatase 2C，Prupe.6G078500，Prupe.6G254600，Prupe.3G000700)、C2H2 蛋白家族(ZAT5，Prupe.6G113100)、ERF 蛋白家族( ERF9，Prupe. 4G051400)、 BHLH蛋白家族(BHLH92，Prupe.1G030500)。

3 討論

干旱脅迫是影響農(nóng)業(yè)最不利的環(huán)境因素之一，它影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[25]。對于桃而言，干旱脅迫是限制果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素[26]。植物為了抵御不利環(huán)境的影響，在生理和分子上形成了各種不同的調(diào)控機(jī)制。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)生物及非生物脅迫，尤其在非生物脅迫過程中起到重要作用[27－29]。本研究對干旱脅迫的桃葉片進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫12 d 時，PpWRKY18 基因表達(dá)量明顯上升且達(dá)到最高，干旱復(fù)水后PpWRKY18 基因表達(dá)量明顯下調(diào)，這表明PpWRKY18 基因響應(yīng)桃干旱脅迫。

本研究預(yù)測了可能與PpWRKY18 基因互作的干旱信號通路蛋白，大量研究表明，這些蛋白與干旱脅迫密切相關(guān)。PpZAT5 基因(Prupe.6G113100)跟擬南芥C2H2 轉(zhuǎn)錄因子家族中的AtZAT5 基因相似性最高，ZAT5 基因在抗旱棉花中上調(diào)表達(dá)，表明ZAT5 基因可能在干旱中有重要的作用[30]。蛋白磷酸酶家族基因(protein phosphatase 2C)也跟干旱密切相關(guān)，在玉米中蛋白磷酸酶基因能夠響應(yīng)干旱[31]。有研究報道花生(Arachis hypogaea)AhERF9 基因在干旱脅迫下表達(dá)量上調(diào)[32]。擬南芥AtBHLH92 基因與側(cè)根形成密切相關(guān)，而側(cè)根形成與干旱適應(yīng)也十分重要[33]。因此，初步推測PpWRKY18 蛋白可能通過互作蛋白來調(diào)控桃對干旱脅迫的適應(yīng)，但具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究從桃中克隆Prupe.1G393000 基因，通過基因比對將其命名為PpWRKY18。PpWRKY18 基因CDS序列為984 bp，編碼327 個氨基酸。PpWRKY18 基因含有5 個外顯子和4 個內(nèi)含子，其氨基酸序列含有保守的WRKY 功能結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，桃PpWRKY18 蛋白與梅PmWRKY18 蛋白最為相似。通過侵染煙草亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證實(shí)PpWRKY18 基因定位于細(xì)胞核中。本試驗(yàn)分析了PpWRKY18 的互作蛋白與干旱脅迫密切相關(guān)，為深入探索PpWRKY18 基因調(diào)控干旱分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過在干旱脅迫下對PpWRKY18 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化和生物信息學(xué)分析，證實(shí)PpWRKY18 響應(yīng)干旱脅迫信號。在干旱脅迫12 d 時，PpWRKY18 的表達(dá)量明顯增加，復(fù)水后，PpWRKY18 的表達(dá)量明顯降低。通過農(nóng)桿菌瞬時注射煙草葉片進(jìn)行亞細(xì)胞定位證實(shí)PpWRKY18 定位于細(xì)胞核。利用SDS-PAGE 檢測發(fā)現(xiàn)PpWRKY18 融合蛋白在沉淀中表達(dá)。預(yù)測與PpWRKY18 相互作用的蛋白包括蛋白磷酸酶蛋白家族( Protein Phosphatase 2C)、 C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF 蛋白家族(PpERF9)、BHLH 蛋白家族(PpBHLH92)。