田 鳳，龍夢暉，寧志豐，佘同輝**

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院基礎醫(yī)學院)

前列腺癌(prostatic cancer，PCa)是一種常見實體腫瘤，也是男性癌癥相關發(fā)病率的主要原因[1]。目前，晚期前列腺癌仍然是最常見和致命的癌癥之一，嚴重威脅著我國人民的生命健康。橄欖苦苷(oleuropein)是一種存在于橄欖科植物中的天然酚類化合物，無論單獨還是聯(lián)合使用，它在惡性腫瘤中均顯示出重要的抗癌潛力[2]。因此，本研究以人前列腺癌細胞株PC-3為研究對象，通過體外細胞實驗來探討不同濃度的橄欖苦苷對人前列腺癌的抑制作用，以期為橄欖苦苷在臨床上的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

橄欖苦苷購自SIGMA公司，先用DMSO配成10mmol/L的橄欖苦苷原液，然后按實驗要求用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成0、20、40、80、160、320μmol/L；Bad、Bcl-2購自中國碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人前列腺癌細胞株PC-3購自中國典藏物培養(yǎng)中心，液氮保存。將PC-3細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細胞狀態(tài)良好的細胞進行實驗，所有實驗重復6次。

1.2.2 細胞增殖

采用MTT實驗。調整培養(yǎng)的PC-3細胞密度為1.0×106/mL，以5000個/孔細胞接種于96孔板，于給藥后24h加MTT溶液，并用酶標儀于490 nm處測出每孔的吸光度(A)值。

1.2.3 細胞遷移

采用劃痕實驗。取對數(shù)生長期的PC-3細胞，以1.0×105個/孔接種于6孔板，過夜培養(yǎng)后劃痕，PBS潤洗，加入2mL含藥物的無血清培養(yǎng)基，于培養(yǎng)0、24h后拍取相應時間點的照片。

1.2.4 細胞侵襲

采用Transwell實驗。上室鋪Matrigel膠待其凝固后，PC-3細胞以1.0×105個/孔接種于上室，下室加含藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，用棉簽輕輕擦去未穿膜的細胞，0.1%結晶紫染色后，顯微鏡下拍照并計數(shù)。

1.2.5 蛋白檢測

采用Western blot實驗檢測。取經(jīng)不同濃度橄欖苦苷處理24h的PC-3細胞，經(jīng)細胞收集、蛋白提取、上樣，電泳、轉膜、抗體孵育后，于成像系統(tǒng)中曝光，以β-action為內參計算目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 橄欖苦苷對PC-3細胞增殖的影響

MTT實驗結果顯示(圖1)，給藥24h后，與空白對照組相比，橄欖苦苷處理組(20、40、80、160、320μmol/L)細胞活力均受到不同程度的抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨橄欖苦苷藥物濃度的增加而降低。

與空白對照組比較，*P<0.05(n=6)

2.2 橄欖苦苷對PC-3細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果如圖2(封二)，數(shù)據(jù)分析顯示：在橄欖苦苷作用24h后，空白對照組的細胞遷移抑制率為(78.17±7.81)%；與空白對照組相比，20、80、320μmol/L橄欖苦苷處理組的劃痕寬度明顯增加，其遷移抑制率明顯降低(P<0.05)，分別為(64.52±4.23)%、(51.28±3.26)%及(30.81±2.01)%，且呈濃度依賴性。

2.3 橄欖苦苷對PC-3細胞侵襲的影響

Transwell侵襲實驗結果如圖3(封二)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示：橄欖苦苷作用于PC-3細胞24h后，空白對照組單視野下侵襲細胞數(shù)目為(269.00±21.21)；與空白對照組相比，20、80、320μmol/L橄欖苦苷處理組單視野下侵襲細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)，分別為(214.00±19.56)、(134.00±13.32)及(69.00±11.23)，且呈濃度依賴性。

2.4 橄欖苦苷對PC-3細胞凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot結果及統(tǒng)計分析顯示：與空白對照組比較，20、80、320μmol/L橄欖苦苷處理組PC-3細胞中Bcl-2表達呈下調趨勢，且有統(tǒng)計差異(P<0.05)；Bad的表達與橄欖苦苷濃度相關并呈上調趨勢，且320μM橄欖苦苷處理組與空白對照組有顯著差異(P<0.05)。

與空白組比較，*P<0.05(n=6)

3 討 論

前列腺癌是現(xiàn)階段困擾中老年男性健康的常見疾病之一，每年因患前列腺癌而死亡的人數(shù)多達25萬人[3]。目前，針對前列腺癌的治療方法包括雄激素受體阻斷療法、前列腺根治切除術及放射治療等，由于前列腺癌發(fā)病隱匿、潛伏期長，以及居民健康意識的匱乏，大多數(shù)癌癥患者在疾病進程的晚期才被診斷出來，并且這些晚期癌癥患者并不適合手術切除治療；同時，放療和化療對這些晚期癌癥患者的療效也非常有限[4]。因此，尋求一種療效佳、毒副作用小的抗癌藥物顯得尤為重要。

橄欖苦苷是一種源于天然橄欖油或橄欖葉中的酚類化合物，是油橄欖葉中起活性作用的主要成分[5]。研究發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷對肝癌、神經(jīng)母細胞瘤等多種惡性腫瘤均有抗癌作用[6-7]。目前，橄欖苦苷在前列腺癌中的研究報道較少。Aktas等[8]研究發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷可通過阻斷電壓門控鈉通道來抑制前列腺癌細胞運動和轉移，進而抑制前列腺癌的生長。本研究觀察了不同濃度的橄欖苦苷作用于PC-3細胞后細胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)細胞活力隨著橄欖苦苷藥物濃度的升高而降低；同時顯示，PC-3細胞經(jīng)橄欖苦苷處理后，劃痕閉合率顯著降低，侵襲細胞數(shù)目明顯減少。

Bcl-2是一種凋亡抑制因子，而Bad是凋亡蛋白，Bad可與Bcl-2結合形成異源二聚體，共同參與腫瘤細胞的凋亡過程，因此，誘導Bad蛋白表達及抑制Bcl-2蛋白表達均能夠有效促進癌細胞凋亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷作用于PC-3細胞后，細胞中Bcl-2蛋白表達有下降趨勢、Bad蛋白表達有上升趨勢；因此，推測橄欖苦苷可能通過調節(jié)上述凋亡相關蛋白的表達來促進PC-3細胞凋亡。

綜上所述，橄欖苦苷可抑制PC-3細胞的生長、遷移及侵襲，且通過與“線粒體通路”中Bcl-2蛋白表達降低以及Bad蛋白表達升高來誘導PC-3細胞凋亡，從而為橄欖苦苷作為潛在的抗前列腺癌藥物提供了一定的實驗依據(jù)。