高景利，崔俊偉，石卓林，高 遠(yuǎn)，賈睿岐

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)，河南 衛(wèi)輝 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸重癥監(jiān)護(hù)室，河南 衛(wèi)輝 453100)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的慢性免疫性、傳染性疾病，中國(guó)結(jié)核病發(fā)病率約為58.83/10萬[1]。結(jié)核性胸膜炎是臨床上常見的結(jié)核桿菌感染性疾病，結(jié)核性胸膜炎所導(dǎo)致的胸腔積液與其他惡性胸腔積液在臨床上難以區(qū)分[2-3]，因此，積極尋找鑒別2種胸腔積液的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)至關(guān)重要。微RNA(microRNA，miRNA)屬于非編碼RNA，在機(jī)體血清、體液中穩(wěn)定性較高，易于檢測(cè)[4]。miR-29a屬于較早發(fā)現(xiàn)的且與腫瘤相關(guān)的miRNA之一，在不同腫瘤中表達(dá)異常上調(diào)或下調(diào)[5-7]，但關(guān)于miR-29a在結(jié)核性胸腔積液(tuberculous pleural effusion，TPE)和惡性胸腔積液(malignant pleural effusion,MPE)中表達(dá)水平的研究報(bào)道較少。腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)在機(jī)體免疫反應(yīng)的調(diào)控過程中作用顯著，TPE中ADA表達(dá)水平顯著升高，但ADA診斷TPE的敏感度仍較低，尚不足75%[8]?；诖?，本研究探討miR-29a聯(lián)合ADA檢測(cè)在鑒別TPE和MPE中的臨床效能，為TPE臨床早期診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年1月至2019年6月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核科、呼吸科及腫瘤科收治的胸腔積液患者142例為研究對(duì)象，其中男80例，女62例；年齡49～61(54.26±10.23)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)TPE患者具有低熱、盜汗、乏力等結(jié)核中毒癥狀，依據(jù)“WS288-2017肺結(jié)核診斷”中的標(biāo)準(zhǔn)[9]以及胸水病理細(xì)胞學(xué)、胸膜活檢可見典型的上皮干酪樣肉芽腫、抗結(jié)核治療后胸水消失等確診；(2)MPE患者X線或者胸部CT檢查后發(fā)現(xiàn)肺部有腫塊，胸水為滲出性，且抗酸染色陰性，胸水中可查到腫瘤細(xì)胞，肺部組織病理學(xué)確診為肺癌；(3)首次發(fā)??；(4)年齡>18歲；(5)肝腎功能及心臟功能指標(biāo)均正常；(6)同意進(jìn)行胸腔穿刺胸水檢查；(7)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)胸水量較少，不足以進(jìn)行穿刺并完善相關(guān)檢查；(2)免疫缺陷者；(3)合并其他部位腫瘤。依據(jù)患者原發(fā)病最終確診情況分為TPE組和MPE組。TPE組63例，其中男37例，女26例；年齡49～60(53.14±8.69)歲。MPE組79例，其中男43例，女36例；年齡49～61(55.38±11.14)歲。2組患者性別分布及年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 酶速率法檢測(cè)患者胸腔積液中ADA水平2組患者入院后進(jìn)行胸腔穿刺，收集胸腔積液10 mL，無菌濾網(wǎng)去除胸腔積液中的凝塊和絮狀沉淀物，將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r·min-1(離心半徑 4 cm)離心10 min，使用加樣槍吸取3 mL上清液后轉(zhuǎn)移至新的離心管中，采用酶速率法檢測(cè)ADA水平，試劑購自科華生物科技股份有限公司，嚴(yán)格按試劑盒說明步驟操作。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量收集胸腔積液100 mL，按上述上清液采集方法采集胸腔積液上清液50 mL，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)miR-29a表達(dá)水平，RT-PCR試劑盒購買自北京天根生化科技有限公司，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，參考文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)引物，miR-29a上游引物序列為5′-CGCGTAGCACCATCTGAAAT-3′，下游引物序列為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′，下游引物序列為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。反應(yīng)體系10 μL：正向和反向引物(濃度為10 μmol·L-1)各0.4 μL，cDNA(質(zhì)量濃度為50 mg·L-1)模板1.0 μL，雙蒸水3.0 μL，SYBR GREENⅠ熒光染料5.2 μL。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)加熱10 min， 94 ℃變性5 s，55 ℃ 退火30 s， 70 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參，應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算miR-29a相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 TPE患者治療及預(yù)后不良情況分析對(duì)TPE患者給予標(biāo)準(zhǔn)化抗結(jié)核治療方案，同時(shí)抽取胸腔積液，每周1次，每次不超過1 000 mL，當(dāng)?shù)陀? 000 mL時(shí)可一次性抽完，直至患者住院期間不再產(chǎn)生新的胸腔積液。治療結(jié)束后采用彩色超聲檢測(cè)胸腔內(nèi)胸膜最厚處，當(dāng)胸膜厚度超過3 mm時(shí)，定義為胸膜增厚，將出現(xiàn)胸膜增厚定義為預(yù)后不良。根據(jù)治療后預(yù)后將TPE患者分為預(yù)后不良組(n=14)和預(yù)后良好組(n=49例)，比較2組患者治療前胸腔積液中miR-29a 相對(duì)表達(dá)量及ADA水平。

2 結(jié)果

2.1 2組患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量和ADA表達(dá)水平比較結(jié)果見表1。TPE組患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量和ADA表達(dá)水平高于MPE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量和ADA表達(dá)水平比較

2.2 2組患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量與ADA水平相關(guān)性結(jié)果見圖1和圖2。TPE組患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量與ADA水平呈顯著正相關(guān)性(r=0.314，P>0.05)。MPE組患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量與ADA表達(dá)水平無相關(guān)性(r=0.234，P>0.05)。

圖1 TPE患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量與ADA水平相關(guān)性

圖2 MPE組患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量與ADA水平相關(guān)性分析

2.4 miR-29a和ADA單獨(dú)及聯(lián)合診斷TPE的臨床效能結(jié)果見圖3和表2。ROC曲線顯示，miR-29a診斷TPE的曲線下面積(area under the curve，AUC)為 0.903，95%置信區(qū)間(95% confidence interval，95%CI)為0.853～0.954，當(dāng)截?cái)嘀禐?.46時(shí)，敏感度和特異度分別為90.50%和79.70%；ADA診斷TPE的AUC為0.840(95%CI：0.767～0.913)，當(dāng)截?cái)嘀禐?18.63 U·L-1時(shí)，敏感度和特異度分別為 84.10%和74.70%；miR-29a聯(lián)合ADA診斷TPE的AUC為 0.943，敏感度和特異度分別為94.90%和92.40%。

圖3 胸腔積液中miR-29a、ADA水平單獨(dú)及聯(lián)合診斷TPE的ROC曲線

表2 胸腔積液中miR-29a、ADA單項(xiàng)及聯(lián)合診斷TPE的效能

2.5 TPE患者治療前胸腔積液中miR-29a和ADA表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系預(yù)后不良組和預(yù)后良好組TPE患者治療前胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量分別為0.67±0.13、0.51±0.12，ADA水平分別為(23.98±5.26)、(24.13±6.21)U·L-1；預(yù)后不良組患者治療前胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量顯著高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.321，P<0.05)；2組患者胸腔積液中ADA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.082，P>0.05)。ROC曲線顯示，miR-29a診斷TPE患者治療后出現(xiàn)胸膜增厚的AUC為0.832(95%CI：0.727～0.939)，當(dāng)截?cái)嘀禐?.615時(shí)，敏感度和特異度分別為 73.50%和78.60%；ADA診斷TPE患者治療后出現(xiàn)胸膜增厚的AUC為 0.614(95%CI：0.432～0.795)，當(dāng)截?cái)嘀禐?22.59 U·L-1時(shí)，敏感度和特異度分別為46.28%和52.56%，見圖4。

圖4 TPE患者治療前胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量和ADA水平診斷治療后發(fā)生胸膜增厚的ROC曲線

3 討論

結(jié)核性胸膜炎是常見的肺外結(jié)核之一，主要是結(jié)核分枝桿菌感染胸膜后導(dǎo)致的慢性炎癥反應(yīng)所致，在疾病的不同發(fā)展階段，以滲出性結(jié)核性胸膜炎即胸腔積液最為常見；惡性腫瘤如肺癌所導(dǎo)致的MPE在臨床上也較為常見，二者在臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查上無明顯差異，對(duì)于腫瘤原發(fā)灶不明確的MPE和肺內(nèi)結(jié)核不典型的TPE鑒別較為困難[11]。盡管胸腔積液病原學(xué)檢查如胸水凃片尋找抗酸桿菌及腫瘤細(xì)胞、胸水中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)對(duì)于二者的鑒別具有一定價(jià)值，但也存在陽性率較低和耗時(shí)過長(zhǎng)等缺陷[12-13]。因此，積極尋找一種敏感度和特異度均較高、操作性強(qiáng)、可用于快速診斷結(jié)核性胸膜炎的新方法尤為重要。

miRNA不僅存在于細(xì)胞中，還存在于機(jī)體各種血液及體液中，不同種類的miRNA均可在TPE[14]和MPE[15-16]中呈高表達(dá)或低表達(dá)。MiR-29家族主要包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，miR-29a在肺癌和肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制中均起重要作用。MiR-29a能通過多種信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖與遷移，發(fā)揮顯著的抑癌作用[5,17]；有研究報(bào)道，結(jié)核分枝桿菌感染人巨噬細(xì)胞后可上調(diào)miR-29a的表達(dá)水平[18]，活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血白細(xì)胞中miR-29a相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，且與干擾素-α(interferon-α,IFN-α)存在顯著負(fù)相關(guān)性，miR-29a能通過靶向結(jié)合IFN-α mRNA從而負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答[19]。劉永明等[20]研究結(jié)果顯示，外周血白細(xì)胞中miR-29a相對(duì)表達(dá)水平在健康對(duì)照組、肺結(jié)核組和肺癌組中依次顯著升高。焦昕等[10]研究證實(shí)，與MPE患者相比，TPE患者胸腔積液中miR-29a表達(dá)水平顯著升高，且經(jīng)過抗結(jié)核治療后胸腔積液中miR-29a表達(dá)水平顯著降低。本研究結(jié)果顯示，TPE組患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量顯著高于MPE組，與焦昕等[10]研究結(jié)果基本一致，提示miR-29a可能參與了結(jié)核分枝桿菌感染胸膜的病理生理過程。ADA廣泛存在于胸腺、淋巴細(xì)胞和淋巴組織中，TPE和MPE患者胸腔積液中ADA水平均顯著升高，且胸腔積液中ADA水平鑒別TPE和MPE的臨床效能顯著[8,21]。本研究結(jié)果顯示，TPE患者中miR-29a與ADA呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性，而MPE患者胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量與ADA表達(dá)水平無相關(guān)性，推測(cè)miR-29a在一定程度上也可作為鑒別TPE和MPE的標(biāo)志物之一。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-29a診斷TPE的AUC為 0.903(95%CI：0.853～0.954)，敏感度和特異度分別為90.50%和79.70%，miR-29a聯(lián)合ADA診斷TPE的AUC高達(dá)0.943，敏感度和特異度分別為94.90%和92.40%，說明miR-29a聯(lián)合ADA診斷TPE的效能顯著增高。TPE患者經(jīng)過抗結(jié)核治療后，部分患者可出現(xiàn)胸膜增厚現(xiàn)象，本研究中14例患者出現(xiàn)胸膜增厚，該14例患者治療前胸腔積液中miR-29a相對(duì)表達(dá)量顯著高于治療后無胸膜增厚患者，但ADA水平在胸膜增厚和無胸膜增厚患者間無明顯差異，提示TPE患者治療前胸腔積液中miR-29a高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，治療前胸腔積液中miR-29a表達(dá)水平診斷TPE患者治療后出現(xiàn)胸膜增厚的AUC為0.832(95%CI：0.727～0.939)，當(dāng)截?cái)嘀禐?.615時(shí)，敏感度和特異度分別為 73.50%和78.60%，證實(shí)治療前胸腔積液中miR-29a高表達(dá)可作為TPE患者預(yù)后不良的一項(xiàng)標(biāo)志物。

綜上所述，miR-29a在TPE患者胸腔積液中高表達(dá)，有望成為鑒別TPE和MPE的一項(xiàng)新指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)ADA能進(jìn)一步提高診斷效能；胸腔積液中miR-29a可作為TPE患者預(yù)后不良預(yù)測(cè)的一項(xiàng)標(biāo)志物。