杜建雄,任尉香,張淑卿,李劍峰,周丕飛

(1.貴州財經(jīng)大學(xué) 管理科學(xué)學(xué)院, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州師范大學(xué) 外國語學(xué)院 貴州 貴陽 550025； 3.貴州師范學(xué)院 喀斯特生境土壤與環(huán)境生物修復(fù)研究所, 貴州 貴陽 550018)

0 引言

【研究意義】土壤是人類及其他生物賴以生存必不可少的環(huán)境要素，其能承擔(dān)環(huán)境中大約90%的污染物。Hg是土壤中主要的重金屬污染物之一，污染環(huán)境的同時也嚴(yán)重威脅人類健康，Hg對人體的傷害大多是農(nóng)作物從土壤吸收經(jīng)食物鏈傳遞導(dǎo)致[1-5]。因此，進(jìn)行土壤汞污染治理修復(fù)研究對土壤的可持續(xù)發(fā)展能力和我國的糧食安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】世界上治理修復(fù)土壤汞污染主要采用農(nóng)業(yè)工程技術(shù)[6]、植物修復(fù)技術(shù)[7]和物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)[8]。農(nóng)業(yè)工程技術(shù)和物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)受一定的技術(shù)條件限制，適合局部區(qū)域治理，植物修復(fù)技術(shù)是通過植物將土壤中Hg2+固定、轉(zhuǎn)移、提取達(dá)到減輕污染的目的[9]，植物修復(fù)技術(shù)已逐漸成熟，具有效率高、低成本、操作簡單，不易造成二次污染的特點(diǎn)，在治理土壤污染的同時還具有美化環(huán)境、凈化空氣的作用，成為重金屬污染土壤修復(fù)的研究熱點(diǎn)。大多數(shù)草本植物有一定的抗Hg能力，可以在一定程度重金屬污染的土壤環(huán)境中生存[10-11]。已有研究表明，一些草本植物對Hg有較高的富集能力，而且能通過不斷刈割這些草本植物最終將將土壤中的Hg2+富集后再轉(zhuǎn)移出土壤，達(dá)到既能修復(fù)土壤、又能減少農(nóng)產(chǎn)品污染和重金屬在食物鏈中擴(kuò)散的目的[12-13]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于草坪草、牧草對土壤汞污染修復(fù)的相關(guān)研究比較少，因此，選取前期耐汞發(fā)芽試驗中篩選出的一年生黑麥草(LoliummultiflorumLam.)盛宴(cv.Feast)、紫羊茅(FestucarubraL.)派尼(cv.Pernille)和傳奇(cv.Legend)以及紫花苜蓿(MedicagosativaL.)金皇后(cv.Golden empress)4個草坪草、牧草品種進(jìn)行不同濃度汞脅迫土培試驗，探究汞脅迫處理下4個草坪草、牧草品種幼苗的生理反應(yīng)特性及養(yǎng)分積累情況。【擬解決的關(guān)鍵問題】探明4個草坪草、牧草品種的抗汞脅迫能力，為土壤汞污染的治理提供植物修復(fù)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試草種 一年生黑麥草盛宴、紫羊茅派尼和傳奇的種子均于2016年購自百綠集團(tuán)，紫花苜蓿金皇后種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實驗室提供。所有供試種子凈度均>98%。

1.1.2 試驗土壤 試驗土壤采集于貴州省銅仁市萬山區(qū)的萬山汞礦區(qū)。1號土壤采集地距礦區(qū)約650 m，土壤為栽種玉米3a的黃壤土；2號土壤采集地距礦區(qū)約500 m，為種植玉米約2 a的黃壤復(fù)耕地；3號土壤采集地距排礦口20 m，土壤以礦渣為主，混合荒地土，栽種玉米約2 a； 4號土壤采集地距排礦口30 m，荒地，以汞礦渣為主，生長少量雜草；非汞礦區(qū)土壤(CK)采集于貴州師范學(xué)院印山林地。采集各土樣均為表層0～20 cm的非根際土壤，去雜質(zhì)后120℃烘干1.5 h，碾碎過1 mm篩備用，其初始理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)

1.2 方法

采用土培盆栽試驗，每個土樣為1個處理，共5個處理，5次重復(fù)。將采回的5個土壤樣本分別按150 g/盆土裝入直徑6 cm、高8 cm的小花盆中，每個花盆均勻散播100粒種子，覆0.5 cm土壤，澆透水。第15天統(tǒng)計其成活數(shù)，觀察外傷癥狀。30 d后取樣測定各項生長指標(biāo)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 葉綠素含量 用分光光度計法測定[14]。稱取0.20 g新鮮葉片剪碎，加10 mL95%的乙醇避光浸泡至葉片呈白色。以95%乙醇作空白對照，分別在波長665 nm、649 nm處測定葉片的吸光度，計算葉片葉綠素含量。

Ca=13.95×A665-6.88×A649

Cb=24.96×A649-7.32×A665

CT=Ca+Cb

式中，Ca、Cb、CT分別為葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素濃度，A665、A649分別為色素提取液在波長665 nm、649 nm處的吸光值。

1.3.2 葉綠素?zé)晒?植株葉片暗適應(yīng)20 min后，用(MINI-PAM-II)型便攜式調(diào)制熒光分析儀測定植物葉片PSII的原初光化學(xué)效率(Fv/Fm)。

1.3.3 丙二醛和可溶性糖含量 以硫代巴比妥酸法[15]測定葉片MDA含量和可溶性糖含量。取植物葉片1.0 g，加10%三氯乙酸(TCA) 2 mL和少量石英砂研磨，繼續(xù)加入8 mL TCA充分研磨，勻漿液4 000 r/min離心10 min，取上清液低溫保存待測。吸取2 mL提取液(對照加2 mL蒸餾水)，加入2 mL 0.6%TBA液混勻，試管加塞并沸水浴15 min，冷卻后以4 000 r/min離心15 min，取上清液測定532 nm和450 nm處的吸光值。根據(jù)Lambert-Beer定律計算MDA和可溶性糖含量。

C1(μmol/L)=6.45×A532-0.56×A450

C2(μmol/L)=11.71×A450

式中，C1為MDA的濃度，C2為可溶性糖的濃度，A450、A532分別為450 nm、532 nm波長下的吸光值。

1.3.4 根際土壤銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量 用毛刷將植株根系附著的根際土刷下并于80℃烘干至恒重，稱取2 g待測土，用HM-TYA型(山東恒美)土壤養(yǎng)分檢測儀測定銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量。

1.3.5 植株速效氮、速效磷及速效鉀含量 取新鮮植株樣品1.0 g，洗凈擦干，加石英砂研磨后用提取液稀釋，用HM-TYA型土壤植株養(yǎng)分檢測儀測定植株的速效氮、速效磷及速效鉀含量。

1.3.6 根系活力 用TTC法測定根系活力[16]。TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取0.4% TTC溶液0.2 mL放入10 mL量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻顯色后再用乙酸乙酯定容至刻度搖勻后，分別取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL和2.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度即得到反應(yīng)產(chǎn)物25 μg、50 μg、100 μg、150 μg、200 μg的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，對照空白，在485 nm波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取根尖樣品0.5 g放入10 mL燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒在溶液內(nèi)，在37℃下暗保溫13 h后，加入1 mol/L硫酸2 mL停止反應(yīng)；同時作空白對照，先加硫酸，再加根樣，其他操作同上。

把根取出吸干水分后與乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂于研缽內(nèi)磨碎，以提出三苯基甲臜(TTF)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及制圖，用SPSS 13.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量

由圖1可見，隨著Hg2+濃度升高，各品種的葉綠素含量變化各異。處理1盛宴的葉綠素含量較對照無顯著變化，金皇后和派尼顯著上升，傳奇顯著下降。處理2傳奇的葉綠素含量較對照無顯著變化，盛宴、金皇后和派尼均呈顯著升高，增幅分別為36.66%、12.05%和15.68%。處理3除派尼的葉綠素含量較對照顯著降低外，其他品種變化不大。處理4盛宴、傳奇和派尼的葉綠素含量較對照均顯著下降，降幅分別為19.60%、22.59%和27.17%；金皇后則顯著升高，增幅為14.52%。4種土壤中，金皇后的葉綠素含量變化較平緩。

圖1 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的葉綠素含量

2.2 PS II原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)

由圖2可見，隨著Hg2+濃度升高，盛宴、金皇后和傳奇的PS II原初光能轉(zhuǎn)化效率無顯著變化，派尼則顯著升高；其中，盛宴和傳奇均呈先升后降再升趨勢，金皇后呈先降后升再降趨勢。

2.3 丙二醛(MDA)含量

由圖3可見，隨著Hg2+濃度升高，盛宴的MDA含量呈先降后升再降趨勢，與對照相比，處理1、處理3和處理4降幅分別為17.01%、39.46%和27.56%。金皇后的MDA含量隨Hg2+濃度升高呈明顯升高后下降的趨勢，與對照相比，處理1的MDA含量增幅為29.59%，處理2、處理3和處理4降幅分別為23.43%、15.76%和19.89%。傳奇的MDA含量隨Hg2+濃度升高呈先降后升再降趨勢，處理1、處理2、處理3和處理4降幅分別達(dá)66.27%、79.37%、65.31%和88.68%。派尼的MDA含量隨Hg2+濃度升高而明顯升高，處理1、處理3和處理4的MDA含量較對照增幅分別達(dá)29.76%、40.42%和87.24%，處理2變化不大。

圖3 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的丙二醛含量

圖2 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的PS II原初光能轉(zhuǎn)化效率

2.4 可溶性糖含量

由圖4可見，盛宴的可溶性糖含量隨Hg2+濃度升高整體呈降低趨勢；金皇后呈先顯著上升再顯著下降后基本穩(wěn)定的趨勢，在Hg2+濃度最高的處理4可溶性糖含量與對照接近；傳奇呈先降后升再降趨勢，處理1和處理2土壤的可溶性糖含量降幅較大，分別為47.05%和47.31%；派尼呈顯著下降后略升趨勢，處理1～4均顯著低于對照。

圖4 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的可溶性糖含量

2.5 根系活力

由圖5可見，隨著土壤Hg2+濃度升高，盛宴和金皇后的根系活力均呈先下降再緩慢上升趨勢，處理1～4顯著低于對照，金皇后的根系活力較對照降幅為34.41%～75.49%。傳奇的根系活力處理1和處理2與對照間無顯著變化，處理3顯著上升，處理4顯著降低，處理1～4均低于對照。派尼的根系活力隨Hg2+濃度升高呈先降后升趨勢，含汞土壤中的根系活力顯著低于無汞土壤，降幅為30.46%～88.21%。

圖5 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的根系活力

2.6 速效氮含量

由圖6可見，盛宴植株速效氮含量隨Hg2+濃度升高呈先下降再快速升高趨勢，處理1、處理2和處理3的速效氮含量較對照的降幅分別為25.56%、13.37%和11.38%，處理4的增幅則達(dá)26.81%。金皇后的速效氮含量隨Hg2+濃度升高呈先升后降趨勢，增幅分別為46.92%、92.34%、58.67%、70.65%，差異顯著。傳奇的速效氮含量隨Hg2+濃度升高呈先升后降趨勢。派尼的速效氮含量隨Hg2+濃度升高呈先升后降再升趨勢，處理1、處理2、處理4較對照的增幅分別為49.45%、36.05%和12.27%，5個處理間差異均達(dá)顯著水平。

圖6 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的速效氮含量

2.7 速效磷含量

由圖7可見，盛宴的速效磷含量隨Hg2+濃度升高呈先降后升趨勢，各處理間速效磷含量差異均達(dá)顯著水平，處理1、處理2的速效磷含量較對照的降幅分別為23.71%和12.64%，處理3、處理4的速效磷含量較對照的增幅分別為23.63%和17.60%。金皇后的速效磷含量隨Hg2+濃度升高呈持續(xù)升高的趨勢，除處理1和處理3間的速效磷含量差異不顯著外，其余各處理間差異均達(dá)顯著水平，處理1、處理2、處理3、處理4的速效磷含量較對照的增幅分別達(dá)191.36%、84.67%、178.90%和156.84%。傳奇的速效磷含量隨Hg2+濃度的升高呈先降后升再降的趨勢，對照和3號土壤的速效磷含量與其他其他處理的差異均達(dá)顯著水平，處理1、處理2、處理4的速效磷含量較對照的降幅分別為66.98%、70.74%和63.36%。派尼的速效磷含量各處理間差異不顯著。

圖7 不同濃度Hg2+脅迫下4個草品種的速效氮含量

2.8 速效鉀含量

由圖8可見，盛宴的速效鉀含量隨Hg2+濃度升高呈先降后升趨勢，對照和處理1間差異不顯著，與其他處理間差異均顯著，處理1、處理2和處理3的速效鉀含量較對照的降幅分別為3.72%、48.37%和23.91%，處理4較對照增加3.66%。金皇后的速效鉀含量隨Hg2+濃度升高呈持續(xù)升高的趨勢，除處理3和處理4間差異不顯著外，其他處理間差異均達(dá)顯著水平，處理1、處理2、處理3和處理4的速效鉀含量較對照的增幅分別為28.93%、10.65%、176.27%和171.13%。傳奇的速效鉀含量隨Hg2+濃度的升高呈先降后升再降的趨勢，各處理間差異均達(dá)顯著水平。派尼的速效鉀含量隨著Hg2+濃度升高僅處理2升高外，其余處理均明顯下降，處理3、處理4的速效鉀含量較對照的降幅分別為38.22%和71.39%。

圖8 不同濃度Hg2+脅迫下4個品種的速效鉀含量

3 討論

葉綠素?zé)晒鈪?shù)中的Fv/Fm值常用于衡量植物在逆境脅迫下葉片光合系統(tǒng)II原初光能轉(zhuǎn)化效率[17-18]，Hg脅迫對不同草坪草、牧草的Fv/Fm值影響可能并不一致。低濃度Hg能促進(jìn)盛宴、傳奇、派尼的葉片光合系統(tǒng)II原初光能轉(zhuǎn)化效率。而金皇后在不同Hg處理下的葉片F(xiàn)v/Fm值顯著低于非汞礦區(qū)土壤，可能是Hg脅迫使金皇后光系統(tǒng)PS II反應(yīng)中心受損，光合作用的原初反應(yīng)產(chǎn)生抑制，使光合電子傳遞受阻，不利于金皇后葉片把捕獲的光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能[17-18]。其次，光合作用與葉綠素含量也有密切關(guān)系，金皇后在各處理中的葉綠素值基本高于CK，盛宴與CK無明顯差異，傳奇和派尼則低于CK。說明葉綠素含量受Hg脅迫影響程度依次為金皇后<盛宴<傳奇<派尼。

植物器官在逆境下或衰老時，常會發(fā)生膜脂過氧化作用，從而產(chǎn)生MDA，因此常將MDA含量作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，用以表示細(xì)胞膜過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱[19-20]。盛宴、金皇后、傳奇的MDA含量在非汞礦區(qū)土壤達(dá)到最大值，可能是由于土質(zhì)問題，CK的土壤取自貴州師范學(xué)院寶珠山上松樹林周邊，取土周圍無太多草本植物生長，由此推斷，土壤中可能含有某種松樹分泌的化感物質(zhì)，致使試驗草植株體的MDA含量升高。而派尼的MDA含量在Hg濃度最高的土壤中最高，說明Hg2+比松樹分泌的化感物質(zhì)對派尼的細(xì)胞膜影響程度更大，即盛宴、金皇后、傳奇比派尼更耐受Hg2+的脅迫。可溶性糖含量的升高是植物面對脅迫環(huán)境時的應(yīng)激反應(yīng)[21]，派尼和傳奇隨著Hg濃度的升高，其可溶性糖含量下降明顯，盛宴的可溶性糖含量則與非汞礦區(qū)土壤無明顯區(qū)別，金皇后的可溶性糖含量在最低濃度處理下呈升高現(xiàn)象，后趨平緩狀態(tài)，說明面對脅迫環(huán)境，金皇后比其他3種草的應(yīng)激反應(yīng)能力更強(qiáng)，其余依次是盛宴、傳奇和派尼。

根系活力(四氮唑還原強(qiáng)度)是根的重要生理指標(biāo)，活力越高吸收水分和營養(yǎng)的能力越強(qiáng)，當(dāng)受逆境如重金屬、鹽堿、干旱等脅迫時植物根系活力降低[22-23]。盛宴、金皇后、傳奇的根系活力隨著Hg脅迫濃度升高而先下降后上升，但根系活力均明顯低于對照，特別是中低濃度Hg脅迫下根系活力下降，而高濃度脅迫下反而升高，說明經(jīng)過低濃度抗汞脅迫鍛煉，根系產(chǎn)生一定耐抗能力，根系活力有所提高，以抵抗更嚴(yán)苛的脅迫。而派尼的根系活力較CK下降明顯，同時也說明其抗汞脅迫能力較弱。

氮、磷、鉀 為植物必須的三大營養(yǎng)元素，對植物的生長發(fā)育具有非常重要的作用，Hg2+通過與養(yǎng)分競爭植物根系的吸收部位，干擾植物對養(yǎng)分的吸收和利用[24-26]。研究表明，Hg2+對4個草品種N、P、K的積累影響較大，盛宴、金皇后的氮、磷、鉀積累量均隨Hg2+濃度的升高先降后升，且品種間存在差異，2品種的氮、磷、鉀積累量在高濃度Hg脅迫下反而升高，其原因可能是基質(zhì)中高濃度的Hg2+提高了氮、磷、鉀的有效態(tài)含量，導(dǎo)致植物對氮、磷、鉀的吸收含量增加。而傳奇和派尼的氮、磷、鉀積累量持續(xù)下降，原因可能是Hg2+降低了氮、磷、鉀的有效態(tài)含量。金皇后和盛宴在高濃度Hg脅迫下氮、磷、鉀積累量的升高進(jìn)一步印證了其較強(qiáng)的抗汞脅迫能力。

4 結(jié)論

在Hg2+0～181 mg/kg處理范圍內(nèi)，金皇后和盛宴的耐Hg脅迫能力較好，更適宜在低Hg污染地區(qū)推廣種植；傳奇耐汞能力次之，派尼最弱，不適宜在汞污染區(qū)推廣種植。由于試驗草種僅為4種，只能為耐Hg脅迫草坪草、牧草品種的選育、栽培策略優(yōu)化和Hg污染土壤生物修復(fù)等研究提供一定的參考。對選育出高富集Hg能力的草品種還需進(jìn)行大量的試驗。