胡玲玲， 烏雪燕

(安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院， 陜西 安康 725000)

0 引言

【研究意義】枸杞屬茄科植物，主要產(chǎn)于寧夏、甘肅及新疆等地，其成熟的漿果干燥后稱為枸杞子，是一種較名貴且歷史悠久的藥食同源中藥材。中醫(yī)認(rèn)為，枸杞具滋補(bǔ)肝腎、保健明目的功效[1-2]。藥理研究表明，枸杞含有多糖、生物堿及類胡蘿卜素、黃酮多酚等多種復(fù)雜的生物成分[3]。其中，枸杞多糖是枸杞中最主要的生物活性物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、調(diào)節(jié)血糖血脂等生理功效，因而倍受關(guān)注，也是評(píng)價(jià)枸杞質(zhì)量的重要依據(jù)之一[4-5]。開展枸杞多糖等活性物質(zhì)提取方面的研究，對(duì)擴(kuò)大其在食品加工、生物制藥等方面的開發(fā)利用具有現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】提取植物多糖的方法主要有傳統(tǒng)的水提醇沉提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法和超臨界流體萃取法等[6-12]。郭錦濤等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)53%vol白酒浸泡20 d后枸杞浸提酒的黃酮含量和多糖含量分別為0.031 mg/mL和5.83 mg/mL，浸提效果最佳。許英瑞等[11]研究得到超聲提取黑枸杞(LyciumruthenicumMurray)多糖的最佳工藝條件：液料比(mL∶g)41.50∶1，提取時(shí)間16 min，超聲功率418 W，此時(shí)黑枸杞多糖的提取率達(dá)14.13%。吳佳欣等[12]對(duì)枸杞多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，提出其最佳提取工藝：液料比(mL∶g)36.6∶1，溫度93.2℃，時(shí)間3.9 h，此時(shí)多糖提取率為4.28%?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】每種方法各有特點(diǎn)，酶法除考慮影響酶活性的各種因素外，還要考慮酶濃度、底物濃度等因素對(duì)提取物的影響，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高；微波法一般對(duì)水的穿透深度為2～3 cm，穿透深度有限；超臨界流體萃取法需要有高溫高壓的技術(shù)條件，均不利于工廠化生產(chǎn)。傳統(tǒng)的水提醇沉法提取時(shí)間長(zhǎng)，溫度高，對(duì)多糖的生物活性有不利影響，而超聲波空化效應(yīng)可以縮短提取時(shí)間，避免長(zhǎng)時(shí)間的高溫提取操作對(duì)有效成分的破壞?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合，以枸杞多糖的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過超聲波輔助優(yōu)化傳統(tǒng)水提醇沉法提取工藝，以期為枸杞多糖的提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枸杞 中藥材枸杞，產(chǎn)于寧夏中寧縣，購(gòu)于安康。

1.1.2 儀器 主要儀器包括Uv-6100PC紫外可見分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)，F(xiàn)W177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，HH-2型電熱恒溫水浴鍋(上?？苽ビ琅d儀器有限公司)，KH-100E超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司)，F(xiàn)D-1A-80臺(tái)式冷凍干燥機(jī)(上海予騰生物科技有限公司)，AE224電子分析天平(上海舜宇恒平儀器有限公司)，DZF-6020真空干燥箱(蘇州江東精密儀器有限公司)。

1.1.3 試劑 無(wú)水乙醇(AR)(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，苯酚(AR)(天津市東麗區(qū)新中村)，無(wú)水葡萄糖(AR)(西王藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 取中藥材枸杞50 g于真空干燥箱中60℃干燥12 h，碾碎過篩(24目)，用100 mL有機(jī)溶劑(V氯仿∶V甲醇=2∶1)60℃下回流2 h，抽濾，濾渣用相同的方法再重復(fù)處理1次，充分除去枸杞中的色素、脂類及低聚糖[13]。濾餅冷凍干燥制成枸杞樣品并稱重(ms)，備用。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 無(wú)水葡萄糖粉末干燥至恒重，準(zhǔn)確稱量25 mg，去離子水溶解后，轉(zhuǎn)移至250 mL的容量瓶并定容，配制成濃度為100 mg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于6個(gè)10 mL具塞比色管中，補(bǔ)去離子水至2.00 mL。再分別加入 6%苯酚溶液1.00 mL、濃硫酸6 mL，充分搖勻后，90℃水浴15 min，迅速冷卻至室溫，然后采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)(λ)300～800 nm掃描，λ=490 nm處有最大吸光度。因此，可在此處測(cè)定枸杞多糖的吸光度[14-15]。以吸光度值為縱坐標(biāo)(y)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 不同因素對(duì)枸杞多糖得率的影響 用精度0.01 g的電子秤準(zhǔn)確稱取枸杞樣品2.00 g置于100 mL圓底燒瓶，按照超聲提取→濃縮→冷凍干燥→測(cè)定吸光度并計(jì)算得率的流程進(jìn)行單因素提取試驗(yàn)，分別考察液料比(mL∶g)、超聲提取時(shí)長(zhǎng)(min)、超聲溫度(℃)及提取次數(shù)等因素對(duì)提取得率的影響。

1) 提取時(shí)間。分別設(shè)定為10 min、15 min、20 min、25 min和30 min；試驗(yàn)條件：液料比為20∶1，提取溫度設(shè)定為50℃。

2) 提取溫度。分別設(shè)定為30℃、40℃、50℃、60℃和70℃；試驗(yàn)條件：液料比為20∶1，超聲提取時(shí)長(zhǎng)設(shè)定為25 min。

3) 液料比(mL∶g)。分別設(shè)定為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1；試驗(yàn)條件：超聲提取溫度和提取時(shí)長(zhǎng)固定為50℃和25 min。各處理2次重復(fù)提取，合并濾液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL，加入40 mL 95%乙醇，4℃下靜置沉淀24 h，抽濾，濾渣分別用少量乙醇、丙酮各洗滌1次，得枸杞多糖粗產(chǎn)品。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝 根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，對(duì)枸杞多糖水提醇沉法提取工藝中主要影響因素液料比，超聲提取時(shí)長(zhǎng)和提取溫度進(jìn)行優(yōu)化，篩選最佳提取工藝。

表1 枸杞多糖提取試驗(yàn)因素及水平

1.2.5 測(cè)定枸杞多糖含量 枸杞粗多糖凍干品，用去離子水溶解配置成250 mL多糖溶液，吸量管移取1.00 mL多糖溶液于10 mL容量瓶中，去離子水定容。再?gòu)闹腥〕?.00 mL溶液于比色管中補(bǔ)去離子水至2.00 mL。然后加入6%苯酚溶液1.00 mL、濃硫酸6.00 mL，充分搖勻，沸水浴15 min，迅速冷卻至室溫，測(cè)量其吸光度并計(jì)算枸杞多糖的提取率。

式中，C由回歸方程所得枸杞粗多糖的濃度(mg/L)，n為稀釋倍數(shù)，D為換算系數(shù)(ms/50)；m為枸杞供試品的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度值為縱坐標(biāo)(y)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。經(jīng)擬合得回歸方程：

圖1 枸杞多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

y=4.0657x+0.096 9(R2=0.999 3)

說明，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在10～60 mg/L，吸光度與葡萄糖濃度存在良好的線性關(guān)系。

2.2 不同提取因素處理枸杞多糖的提取率

從圖2看出，不同提取時(shí)間、溫度和液料比處理枸杞多糖的提取率存在差異。

圖2 不同提取時(shí)間、溫度和液料比處理枸杞多糖的提取率

2.2.1 提取時(shí)間 不同處理枸杞多糖的提取率為8.68%～10.51%，其中，提取時(shí)長(zhǎng)為20 min時(shí)多糖提取率最高，25 min時(shí)其次，10 min時(shí)最低，依次為20 min>25 min>30 min>15 min>10 min。枸杞多糖提取率隨提取時(shí)間的增加呈先升后降趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)長(zhǎng)為20 min時(shí)達(dá)最大，之后下降，可能是隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，多糖在溶劑中不斷溶出；隨時(shí)間延長(zhǎng)，其他雜質(zhì)在溶劑中溶出也快速增多，使得多糖提取率下降。表明，20 min是較為合適的提取時(shí)長(zhǎng)。因此，選取提取時(shí)間15 min、20 min和25 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 提取溫度 不同處理枸杞多糖的提取率為8.67%～10.66%，其中，提取溫度為60℃時(shí)多糖提取率最高，50℃時(shí)其次，30℃時(shí)最低，依次為60℃>50℃>70℃>40℃>30℃。隨溶劑溫度升高，多糖提取率呈先升后降趨勢(shì)，在提取溫度為60℃時(shí)達(dá)最大，之后下降，可能是枸杞多糖在低溫時(shí)溶出較少，隨溫度升高，多糖溶出逐漸增大；溫度較高時(shí)多糖易降解，從而使多糖提取率下降。表明，最佳提取溫度以60℃較為適宜。因而，選取提取溫度50℃、60℃和70℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 液料比 不同處理枸杞多糖的提取率為8.61%～10.71%，其中，液料比(mL∶g)為20∶1時(shí)多糖提取率最高，25∶1時(shí)其次，10∶1時(shí)最低，依次為20∶1>25∶1>30∶1>15∶1>10∶1。隨液料比增大，多糖提取率呈先升后降趨勢(shì)，當(dāng)液料比大于20∶1之后，提取率又略有下降。原因可能是液料比太小時(shí)，溶劑不能完全浸潤(rùn)藥材，多糖提取不完全。為提高效率，節(jié)省能耗，選擇20∶1的液料比較為適宜。因而，選取液料比15∶1、20∶1和25∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 枸杞多糖提取條件優(yōu)化

從表2看出，9個(gè)處理枸杞多糖提取率為8.79%～10.66%，其中，處理5(A2B2C3)，即液料比20∶1，提取溫度60℃，提取時(shí)長(zhǎng)25 min時(shí)枸杞多糖提取率達(dá)最高，為10.66%；處理4(A2B1C2)和處理9(A3B3C2)，即液料比20∶1，提取溫度50℃，提取時(shí)長(zhǎng)20 min時(shí)和液料比25∶1，提取溫度70℃，提取時(shí)長(zhǎng)20 min時(shí)枸杞多糖提取率其次，分別為10.34%和10.32%。從表3和表4可知，各因素對(duì)枸杞多糖提取率的影響為A因素(液料比)>C因素(提取時(shí)間)>B因素(提取溫度)；液料比和超聲提取時(shí)間對(duì)提取率影響顯著，而提取溫度對(duì)提取率無(wú)顯著影響。由K值可知：枸杞多糖提取最佳操作方案為A2B2C2，即超聲輔助提取枸杞多糖的最優(yōu)方案為加入所稱量的枸杞供試品質(zhì)量20倍的蒸餾水，在60℃條件下超聲提取20 min。

表2 枸杞多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 枸杞多糖提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析結(jié)果

2.4 方案驗(yàn)證

由于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中缺少A2B2C2的試驗(yàn)方案，需進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)優(yōu)選出的A2B2C2處理進(jìn)行可信性檢驗(yàn)。從表4看出，在此最佳方案下提取枸杞多糖的平均提取率為10.61%，與正交設(shè)計(jì)中方案5的提取率接近，且RSD僅為1.13%，說明，優(yōu)選出的提取方案(A2B2C2)，即加入稱量的枸杞供試品質(zhì)量20倍的蒸餾水，在60℃條件下超聲提取20 min合理、可行。

表4 枸杞多糖正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表5 枸杞多糖提取的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

水提醇沉法在中藥材的提取分離中應(yīng)用較廣，該研究利用枸杞多糖溶于水的性質(zhì)進(jìn)行水提，隨提取溫度的升高，提取時(shí)間的增長(zhǎng)，枸杞多糖在提取液中溶解度提高的同時(shí)，多糖的水解率也會(huì)提高，使得枸杞多糖的提取率較低。超聲波能夠在植物組織內(nèi)部形成空化作用，以及本身的振動(dòng)作用大大促進(jìn)了多糖的溶解、擴(kuò)散，不僅縮短了提取時(shí)間，也不需要太高的提取溫度。在提高提取率的同時(shí)，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞較小。將超聲法與傳統(tǒng)的水提法結(jié)合，保留了水提的優(yōu)點(diǎn)，縮短了提取時(shí)間長(zhǎng)，提高了提取率，且提取過程簡(jiǎn)單、易操作。該研究經(jīng)優(yōu)化得到提取枸杞多糖的最佳方案為液料比(mL∶g)20∶1，超聲提取溫度60℃，超聲提取時(shí)間20 min。較之吳佳欣等[12]的研究，該研究既減少了液料比，降低了提取溫度，縮短了提出時(shí)間，還提高了多糖提取率。

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的水提醇沉結(jié)合超聲波法提取枸杞多糖，選擇液料比、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素，結(jié)合L9(34)正交表優(yōu)選枸杞多糖的提取方案。提取枸杞多糖的最佳方案為液料比(mL∶g)20∶1，超聲提取溫度60℃，超聲提取時(shí)間20 min。在此方案下，枸杞粗多糖的提取率較高，均值達(dá)10.61%。提取線路簡(jiǎn)單、易操作，多糖提取率較高，為枸杞粗多糖進(jìn)一步純化研究奠定了基礎(chǔ)。