王帆 朱哿瑞 劉成海 陶艷艷

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)是目前最常見以及最嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)之一，重者可致肝衰竭甚至是死亡；據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每100 000病人至少有10～15例DILI[1]。作為臨床常用藥物，對(duì)乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)仍是許多國(guó)家引起DILI和急性肝衰竭的常見原因[2]。通常APAP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在DILI的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用[3]，近年來，APAP肝毒性有了更深入的研究，涉及APAP和/或其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)激活、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變(mitochondrial membrane permeability transition,MPT)、Keap1-Nrf2-ARE激活等多種信號(hào)分子傳導(dǎo)途徑，本文旨在綜述APAP肝損傷的分子機(jī)制，為其臨床治療拓展思路。

一、APAP在肝臟中的代謝

通常情況下，治療劑量的APAP進(jìn)入肝臟后，大部分(約90%)的APAP在II相代謝反應(yīng)結(jié)合酶的作用下轉(zhuǎn)化成無毒的化合物，并通過腎臟與尿液一同排出體外，參與此反應(yīng)的結(jié)合酶主要是UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronyltransferase,UGTs)和磺酸轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase,SULTs)。剩余的APAP(約有10%)被細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)代謝，從而形成反應(yīng)性代謝產(chǎn)物N-乙?；?P-苯醌亞胺(NAPQI)，高反應(yīng)性的NAPQI可快速與肝谷胱甘肽(Glutathione,GSH)結(jié)合并排入膽汁[4]。但當(dāng)APAP達(dá)到毒性劑量時(shí)，過量的APAP將會(huì)導(dǎo)致II期代謝葡萄糖醛酸或硫酸化途徑飽和，從而使大量的APAP進(jìn)入到CYP途徑中，繼而增加了NAPQI的產(chǎn)生[5]。NAPQI的聚集會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致還原型谷胱甘肽(GSH)的嚴(yán)重耗竭；在GSH耗盡后，過量的NAPQI將與替代目標(biāo)(如蛋白質(zhì)、DNA、不飽和脂質(zhì)等)反應(yīng)并產(chǎn)生一系列反應(yīng)，如氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化等，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的死亡。同時(shí)，作為一種抗氧化酶，GSH的降低會(huì)加重肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可形成大量的副產(chǎn)物ROS，通過改變DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子引起肝細(xì)胞的損傷。

總的來說，無論是NAPQI與蛋白質(zhì)結(jié)合所形成的APAP蛋白質(zhì)加合物(APAP Protein Adducts)，抑或是GSH的耗竭都會(huì)引起氧化應(yīng)激并最終發(fā)揮細(xì)胞毒作用。目前發(fā)現(xiàn)與氧化應(yīng)激相關(guān)的分子通路主要有JNK/ASK-1[6]以及Nrf2[7]、TRPM2激活，且針對(duì)上述幾種信號(hào)通路的抑制劑均可保護(hù)APAP肝損傷。另外，線粒體通透性改變(mitochondrial permeability transition,MPT)在APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷以及壞死中也有著不可忽略的作用，MPT已經(jīng)被證明是APAP毒性機(jī)制中的重要一環(huán)[8]。

UGTs:葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶；SULTs:磺酸轉(zhuǎn)移酶；CYP450:細(xì)胞色素P450酶；GSH:谷胱甘肽；NAPQI:N-乙?；?P-苯醌亞胺；APAP-AD:APAP蛋白質(zhì)加合物圖1 APAP在肝臟中的代謝

二、JNK信號(hào)通路激活

JNK(c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶)又稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)，屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族。JNK亞型——JNK1、JNK2、JNK3蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中[9]，多種信號(hào)如紫外線照射、毒性劑等均可激活JNK信號(hào)通路，且JNK持續(xù)激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的損傷以及死亡。

毒性劑量APAP作用下，JNK信號(hào)通路的激活主要與氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS相關(guān)。其中，早期(1～2 h)階段由糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)以及下游混合譜系激酶3(mixed-lineage kinase-3，MLK3)參與激活。有研究表明，在APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷的早期，使用反義寡核苷酸沉默GSK-3β，可以起到保護(hù)APAP肝損傷的作用[10]。晚期(2～4 h)階段則受到肝臟中凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase-1,ASK-1)的調(diào)節(jié)，ASK-1為MAPK激酶激酶(MAPK kinase kinases,MAPKKKs)[11]，其激活對(duì)JNK信號(hào)通路磷酸化起著主要作用。ASK-1與GSK-3β均可使MKK4/7磷酸化，從而激活JNK信號(hào)通路[12]。JNK信號(hào)通路激活后易位至線粒體并與Sab蛋白結(jié)合。研究表明，當(dāng)Sab與JNK結(jié)合時(shí)，其位于線粒體外膜內(nèi)側(cè)的非受體型6 蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1)將會(huì)被磷酸化生成 p-SHP1并轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)膜，進(jìn)而通過內(nèi)膜對(duì)接蛋白使 p-Src去磷酸化失活并形成具有破壞電子傳遞作用的Src，在線粒體呼吸鏈的作用下加劇氧化應(yīng)激ROS的產(chǎn)生[13]，從而進(jìn)一步維持JNK活性，誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變，從而導(dǎo)致線粒體腫脹壞死[12]。

目前最常用的JNK抑制劑為SP600125，當(dāng)SP600125的濃度為20 μmol/L時(shí)可以有效保護(hù)APAP致原代肝細(xì)胞壞死[14]。Saito等[15]發(fā)現(xiàn)，SP600125可在促進(jìn)肝臟GSH(還原型谷胱甘肽)恢復(fù)的同時(shí)降低肝臟線粒體GSSG(氧化型谷胱甘肽)水平，從而證明了SP600125對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用主要由于其對(duì)線粒體氧化應(yīng)激抑制。來氟米特(Leflunomide,LEF)是臨床常用的抗風(fēng)濕類藥物，同樣對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)APAP肝損傷作用。有研究表明，來氟米特可抑制JNK1、JNK2磷酸化，阻止線粒體通透性的改變及促細(xì)胞凋亡因子的釋放，從而保護(hù)肝細(xì)胞損傷[16]。

三、Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)激活

當(dāng)氧化應(yīng)激產(chǎn)生自由基時(shí)，機(jī)體中維持細(xì)胞氧化還原平衡的抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)被激活。常見的抗氧化信號(hào)通路——Keap1-Nrf2-ARE通路，由Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)、核因子類紅細(xì)胞2-相關(guān)因子2(Nrf2)以及抗氧化反應(yīng)元件(ARE)組成[17]。Nrf2是一種可與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族[18]，其抗氧化作用的激活與Keap1相關(guān)。ARE作為一種順式增強(qiáng)子序列，對(duì)下游靶基因表達(dá)的調(diào)控有重要作用[19]。氧化應(yīng)激時(shí)，正常狀態(tài)下的Keap1-Nrf2聚合物將會(huì)因?yàn)镵eap1半胱氨酸殘基的氧化而解離，致使Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與ARE結(jié)合，從而激活下游抗氧化酶(如血紅素氧合酶-1、谷氨酸半胱氨酸連接酶)的轉(zhuǎn)錄[18]。Keap1-Nrf2-ARE對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有著重要作用[20]。已有研究證明，檸檬苦素(Limonin)可通過激活Nrf2抗氧化途徑來減輕APAP誘導(dǎo)的肝毒性[21]。另外，yan等[22]發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)可通過激活Nrf2并增加其下游基因表達(dá)來減輕APAP引起的肝損傷。

四、TRPM2通道激活

瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族M成員2(transient receptor potential cation channel subfamily M member 2,TRPM2)是位于細(xì)胞膜上的非選擇性陽離子通道，具有二磷酸腺苷核糖(adenosine diphosphoribose,ADPR)水解酶活性。氧化應(yīng)激時(shí)，活性氧激活聚ADPR聚合酶(PARP)，進(jìn)而誘導(dǎo)ADPR的產(chǎn)生和TRPM2通道激活，使Ca2+內(nèi)流增加；采用SiRNA阻斷TPMP2表達(dá)可保護(hù)APAP誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷；同樣，與野生型小鼠相比，TRMP2-/-小鼠APAP肝毒性明顯減輕，這表明TRMP2通道在APAP所致肝損傷中起著重要作用[23]。姜黃素(Curcumin)是一種新型的TRPM2通道抑制劑，可用于APAP肝損傷的治療[24]。另一方面，活性氧激活CaMKII蛋白(Ca2+/calmodulin-dependent kinase II)，最終導(dǎo)致BECN1蛋白的磷酸化[25]。BECN1蛋白包含Bcl-2同源性(BH3)結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCD)和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(ECD)，在自噬中起著至關(guān)重要的作用[26]。磷酸化的BECN1會(huì)與PIK3C3(Phosphoinositide-3-Kinase Class 3)分離抑制自噬，并與BCL2或BCL2L1(BCL2 Like 1)結(jié)合，從而導(dǎo)致BAX(與BCL2相關(guān)的X蛋白)與BCL2分離，誘導(dǎo)凋亡，使用CaMKII抑制劑KN-93治療可減輕小鼠APAP肝損傷[27]。

Keap1:Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1；Nrf2:核因子類紅細(xì)胞2-相關(guān)因子2；ARE:抗氧化反應(yīng)元件；HO-1:血紅素氧合酶-1；GCL:谷氨酸半胱氨酸連接酶；Cytochrome C:細(xì)胞色素C；mtDNA:線粒體DNA；Endo G:線粒體蛋白內(nèi)切核酸酶G；AIF:凋亡誘導(dǎo)因子；MPT:線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變；MPTP:線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔；GSK-3β:糖原合酶激酶3β；MLK3:下游混合譜系激酶3；ASK-1:凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1；Sab蛋白:優(yōu)先與Btk結(jié)合的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白；SHP1:非受體型6 蛋白酪氨酸磷酸酶；PARP:聚ADPR聚合酶；ADPR:二磷酸腺苷核糖；TRPM2:瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族M成員2；CAMKⅡ:鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ圖2 APAP毒性作用下主要分子機(jī)制

五、線粒體通透性改變

線粒體同樣是APAP的作用靶點(diǎn)，當(dāng)APAP與線粒體蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)會(huì)導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈的紊亂以及線粒體氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的過氧化物、過亞硝酸鹽等作用于線粒體時(shí)將會(huì)造成線粒體通透性的改變(mitochondrial permeability transition,MPT)。此時(shí)，一種非特異性孔——線粒體通透性過渡孔(MPTP)將會(huì)打開，使得線粒體對(duì)分子量小于1.5 kDa 的陰陽離子溶質(zhì)的通透性突然增加[28]。

MPTP是一種由腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(ANT)、電壓依賴性陰離子通道(VDAC)親環(huán)蛋白D(cyclophilin D)構(gòu)成的蛋白組合體[29]。鈣離子積聚以及ROS均可導(dǎo)致MPTP的開放[30]。從而導(dǎo)致機(jī)制代謝物(最高不超過1 500 kDa)、線粒體蛋白內(nèi)切核酸酶G(endonuclease G)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)以及線粒體DNA釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[31]。核酸內(nèi)切酶G和AIF的釋放可促進(jìn)DNA裂解和細(xì)胞壞死，mtDNA可以觸發(fā)TOLL樣受體9(TLR9)誘導(dǎo)促炎性介質(zhì)的表達(dá)和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)以加重肝損傷[32]。

六、總結(jié)及展望

APAP造成的肝損傷有明顯的劑量依賴性且作為機(jī)制較為復(fù)雜，除了目前較為明確的氧化應(yīng)激，還可造成炎癥反應(yīng)[33]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，具體分子機(jī)制涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)激活、Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)激活、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變(mitochondrial membrane permeability transition,MPT)等等。

NAC(N-acetyl cysteine,N-乙酰-L-半胱氨酸)是含有巰基的抗氧化劑，體內(nèi)代謝后去乙酰化生成半胱氨酸，并在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為谷氨酰半胱氨酸，然后在GSH合酶的作用下生成谷胱甘肽，從而達(dá)到解毒的作用。NAC雖然被廣泛承認(rèn)并且大量應(yīng)用于臨床APAP肝損傷治療,但是其作用具有時(shí)間局限性，NAC對(duì)APAP導(dǎo)致肝毒性8 h內(nèi)有較好的療效，一旦超出時(shí)間范圍，療效將逐漸減弱[34]。同時(shí)，靜脈注射NAC可導(dǎo)致靜脈蕁麻疹瘙癢等不良反應(yīng)。因而，探究APAP肝毒性的分子機(jī)制仍有重要意義，并且有助于基于APAP的分子作用機(jī)制尋找潛在的治療靶點(diǎn)，從而更好防治APAP藥物性肝損傷的發(fā)生。