唐云佳 黃幸鴿 顏曉寧 袁小鳳

浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院 杭州 310053

浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.，F(xiàn).thunbergii）為浙江省道地藥材“浙八味”之一，主產(chǎn)于寧波，其鱗莖具有清熱化痰、止咳、開郁、散結之功，臨床用量極大[1]。 貝母素甲（C27H45NO3）及貝母素乙（C27H43NO3）都屬于生物堿，是浙貝母的藥效指標之一，2020版《中國藥典》規(guī)定，干品浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的含量不能低于0.080%[2]。一般來說，生物堿含量會隨著季節(jié)性因素產(chǎn)生相應的改變[3]，然而浙貝母生物堿的含量變化情況迄今未知。

植物的特性主要與其生長環(huán)境有關，尤其是對于根莖類藥材，根際微環(huán)境對于其生理狀態(tài)的塑造具有重要作用[4]。由于根際微生物在碳氮循環(huán)方面的作用，使得根際微環(huán)境對植物的營養(yǎng)、健康以及質量具有重要意義[5]。已有研究表明，根際微生物的存在能夠引導植物生物堿的合成，如將織片草螺菌接種于狗尾草根部后，固定菌株定植的根中參與吲哚生物堿合成的化合物增多[6]；罌粟的細胞培養(yǎng)物無法組成性地積累生物堿，而是依賴于某些微生物所提供的酶類或輔因子[7]。這些均表明，微生物對于植物生物堿的積累具有重要價值。

浙貝母作為一種傳統(tǒng)中藥材，其藥物潛力被不斷發(fā)掘并應用，為了提高藥物質量，對于浙貝母有效成分生物堿的質量控制十分必要。因此，本研究以浙貝母根際土壤中的微生物為研究對象，借助高通量測序技術檢測浙貝母根際土壤微生物組成的多樣性，分析其變化規(guī)律；以分光光度法及高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測分析（high performance liquid chromatography-evaporative lightscattering detection，HPLCELSD）分別檢測浙貝母不同生長期生物堿及單體堿的含量；并結合土壤理化性質，探討浙貝母整個生長期內根際土壤微生物多樣性變化與生物堿含量之間的相關性，為道地藥材浙貝母的科學生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 實驗設計及樣品采集 選擇江蘇南通、浙江寧波和磐安為浙貝母種植基地，每個基地均用同樣的土壤種植3個種源（南通種源、寧波種源、磐安種源），于10月開始種植，次年1月25日左右開始出苗，分別于浙貝母苗期、花期和收獲期按5點取樣法采集土壤及鱗莖，每個樣品重復取樣3次，樣品具體代碼見表1。所有新鮮土壤過20目篩，去掉其中的石頭和動植物殘渣，裝入無菌收集管中，迅速帶回實驗室，-20℃保存?zhèn)溆茫凰玫降镊[莖，帶回洗凈后生曬切片，烘干待用。

表1 樣品代碼及含義Tab.1 Sample code and meaning

1.2 試劑和儀器 浙貝母藥材由浙江省中藥研究所俞旭平教授鑒定，為百合科植物浙貝母（F.thunbergii）的鱗莖。貝母素甲和貝母素乙標準品均購于中國藥品生物制品檢所（批號：110750-200608、110751-200608）；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit購于Omega公司（批號：00M56350 20000C02Q003）；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒購于Life公司（批號：1759393）；Agencourt AMPure XP磁珠購于Beckman公司（批號：14403400）；其他無機鹽和有機溶劑如無特殊說明均為分析純，購于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。PHS 3C型氫離子濃度指數(shù)（hydrogen ion concentration，pH）計為鄭州寶晶電子科技有限公司產(chǎn)品；S22PC型可見分光光度計購于上海棱光技術有限公司；Agilent 1100型液相色譜儀為Agilent Technologies有限公司產(chǎn)品。

1.3 土壤樣品理化性質測定 以pH計檢測質量體積比1:2.5的土壤與水溶液的pH值，通過重鉻酸鹽消化測定有機質含量，以磷酸苯二鈉比色法測定土壤磷酸酶的活性[8]，以靛酚比色法測定土壤脲酶活性[9]。

1.4 鱗莖總生物堿及單體堿含量的測定 取浙貝母樣品粉末約2.000g，按藥典方法制備供試品溶液[2]。采用可見分光光度計測定吸光度（absorbance，A）值，根據(jù)所得線性方程計算樣品中總生物堿的含量。

貝母素甲和貝母素乙標準品以0.05%鹽酸甲醇溶液溶解，分別制成對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液6、10、15μL，供試品溶液5～15μL，以液相色譜儀檢測。用外標兩點法對數(shù)方程分別計算貝母素甲、貝母素乙的含量[2]。

1.5 土壤基因組DNA提取、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增及測序 作為道地產(chǎn)區(qū)的寧波，其土壤理化性質具有一定的代表性，也賦予了浙貝母得天獨厚的生長環(huán)境，因此本研究以道地產(chǎn)區(qū)寧波為代表，研究浙貝母根際微生物。使用Omega E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取土壤基因組DNA。 上游引物5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’， 下游引物5’-GCCTCCCTCGCGCATCAGNNNNNNNNNNCATGCTGCC TCCCGTAGGAGT-3’。以土壤基因組DNA為模板，對細菌16S rDNA的V2區(qū)進行PCR擴增。用0.6倍的磁珠純化回收DNA，以Qubit2.0 DNA檢測試劑盒精確定量DNA[10]。依照既往研究的方法，提取土壤真菌基因組DNA，并按照其反應體系和條件對真菌進行擴增[11]。每個樣品DNA量取10ng，上機進行焦磷酸測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用焦磷酸測序方法對細菌進行分類和豐度分析。運算的分類單元（operational taxonomic units，OTUs）、Chao1指數(shù)、基于豐度的覆蓋率估計值（abundance-based coverage estimator，ACE）是生境內菌群豐度的評估指標，Shannon指數(shù)是生境內菌群多樣性的評估指標。具體處理方法詳見文獻[11]。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，Excel及Origin 8.0軟件作圖。 計量資料以±s表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析；相關性分析采用Pearson相關性分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同生長期浙貝母根際土壤理化性質的變化 為研究土壤因子與生物堿的關系，將3個種源用同一類型的土壤培養(yǎng)，研究不同發(fā)育期之間土壤理化性質的差異。見圖1。南通的根際土壤pH均在7.36～8.21之間，偏堿性；而浙江兩地的pH均在7.0以下，偏酸性。盡管不同時期的pH動態(tài)變化規(guī)律不同，但隨著浙貝母的生長，土壤pH均逐漸上升。見圖1A。有機質含量表現(xiàn)為先下降后上升，整體呈上升趨勢，只有寧波種源在本地種植表現(xiàn)為先升后降。見圖1B。脲酶活性在浙貝母的生長過程中呈下降的趨勢。見圖1C。磷酸酶活性的動態(tài)變化均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，與脲酶活性的變化趨勢基本相同。見圖1D。總的來說，隨著浙貝母的生長，土壤pH逐漸上升；有機質含量先下降后上升；而脲酶和磷酸酶活性則先上升后下降。作為道地產(chǎn)區(qū)，寧波的脲酶活性和磷酸酶活性均最高，表現(xiàn)出較好的土壤肥力。三個產(chǎn)區(qū)比較，浙江兩地的土壤理化性質也更為相似。

圖1 不同發(fā)育期的浙貝母土壤理化性質的動態(tài)變化圖Fig.1 Dynamic changes of soil physical and chemical properties of F.thunbergii in different developmental stages

2.2 不同生長期浙貝母總生物堿及單體堿含量變化 隨著浙貝母的生長，總生物堿及單體堿的含量均明顯下降，收獲期達到最低水平，種源、產(chǎn)地和生長期的不同均不會改變浙貝母總生物堿含量的變化趨勢。在浙貝母的生長早期，貝母素乙所占的比重大于貝母素甲，然而隨著鱗莖的生長貝母素甲的絕對含量雖然下降，但其相對含量卻逐漸增加最終超過貝母素乙，表明貝母素乙比貝母素甲損失得更快。見圖2。

圖2 浙貝母生長期內總生物堿及單體堿含量柱狀圖Fig.2 Histogram of total alkaloid and monomer alkaloid content during the growth period of F.thunbergii

2.3 部分土壤理化性質與生物堿含量的相關性分析 對土壤pH、有機質含量、脲酶和磷酸酶活性與總生物堿、單體堿含量進行相關性分析。研究發(fā)現(xiàn)，貝母素甲與貝母素乙、貝母素甲與貝母素甲乙之和、貝母素乙與貝母素甲乙之和、貝母素甲與總生物堿含量、貝母素乙與總生物堿含量、貝母素甲乙之和與總生物堿含量均呈正相關（r=0.51、0.76、0.95、0.60、0.89、0.90，P＜0.01），說明浙貝母中其他的單體堿與貝母素甲和貝母素乙的合成同步。此外，貝母素乙與有機質含量、總生物堿與有機質含量呈負相關（r=-0.63、-0.53，P＜0.01）；土壤中脲酶與磷酸酶的活性呈正相關（r=0.47，P＜0.05），有機質含量與脲酶活性、pH與磷酸酶活性呈負相關（r=-0.45，P＜0.05；r=-0.78，P＜0.01）。 見表2。說明在浙貝母生長初期土壤中酶活性越高，微生物活動越頻繁，從而導致土壤pH及有機質含量下降。

表2 土壤理化性質與生物堿含量的Pearson相關性分析Tab.2 Pearson correlation analysis of soil physical and chemical properties and alkaloid content

2.4 浙貝母土壤微生物多樣性分析 從浙貝母際土壤樣本中共檢測到39 157條序列，分類和豐度分析見表3，其中83%屬于細菌，17%屬于真菌，表明浙貝母根際土壤中細菌的豐度遠高于真菌。不同時期根際細菌的豐度顯示，OTUs、Chao1指數(shù)、ACE差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且隨著浙貝母生長呈下降趨勢，表明根際細菌豐度和種類隨浙貝母的生長而下降。而Shannon指數(shù)的排序結果與以上的豐度排序完全吻合，說明根際土壤中菌群多樣性和均勻度水平也隨浙貝母的生長而下降。根際真菌豐度和多樣性隨浙貝母的生長均呈現(xiàn)出先降后升的趨勢，但Shannon指數(shù)卻總體上升，表明根際土壤中真菌豐度雖然減少，但多樣性反而增加。值得注意的是，在苗期和花期并無檢測到曲霉屬的存在，而在收獲期檢測到了曲霉屬，且其豐度排名為優(yōu)勢屬前20。

表3 浙貝母各生長期根際土壤微生物多樣性分析Tab.3 Microbial diversity in rhizosphere soil of F.thunbergii in different growth stages

2.5 微生物群落的動態(tài)變化及優(yōu)勢菌群分析 在所有浙貝母根際土壤樣本中共檢測到32門細菌。見圖3A。優(yōu)勢菌群分析發(fā)現(xiàn)，浙貝母土壤中主要包括變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門及綠彎菌門，它們占土壤細菌近90%。隨著浙貝母的生長，變形菌門及酸桿菌門在根際土中的優(yōu)勢逐漸削弱，而放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的優(yōu)勢則逐漸增強，尤其在收獲期這些門的種類增加比較顯著。相比之下，綠彎菌門的變化不太明顯，再次證明浙貝母的生長對根際微生物有著重要影響。

在所有樣本中共檢測到10門真菌。見圖3B。其中子囊菌門是絕對優(yōu)勢門（87%～90%），而其他真菌如毛霉亞門、壺菌門以及擔子菌門等真菌僅占10%～13%。在整個生長期內，子囊菌門的豐度持續(xù)上升，毛霉亞門以及壺菌門豐度先下降后升高，而擔子菌門以及Fungi_incertae_sedis豐度則表現(xiàn)出相反的趨勢。

圖3 浙貝母生長期內根際土壤微生物門水平群落結構組分圖Fig.3 Composition map of horizontal community structure of microbial phyla in rhizosphere soil during the growth period of F.thunbergii

利用焦磷酸測序共檢測到了浙貝母土壤中694個屬，在排名前20的優(yōu)勢屬中Nitrosomonadaceae-uncultured、Gemmatimonadaceae-uncultured 及 Methylocystaceae-uncultured隨著浙貝母的生長其種類逐漸減少，這些細菌種類的變化趨勢與生物堿含量的變化趨勢完全相同，說明它們可能與生物堿合成密切相關。

2.6 生物堿與微生物多樣性的相關性分析 對浙貝母3個生長時期的土壤理化性質、生物堿含量、微生物豐度指數(shù)Chao1以及微生物多樣性指數(shù)Shannon進行Pearson相關性分析。結果表明，總生物堿含量和單體堿含量與細菌Chao1指數(shù)呈正相關（r=0.92、0.87，P＜0.01），但與真菌Chao1指數(shù)無相關關系（r=0.22、0.46，P＞0.05）；總生物堿含量和單體堿含量與細菌Shannon指 數(shù)也呈正相關（r=0.96、0.87，P＜0.01），但與真菌Shannon指數(shù)無相關關系（r=0.17、0.11，P＞0.05）。 見表4。以上結果表明根際細菌的確與生物堿合成有著密切聯(lián)系，甚至直接影響總生物堿及單體堿合成。此外，有機質含量與細菌及真菌Chao1指數(shù)均呈正相關（r=0.68、0.70，P＜0.05），表明真菌和細菌對土壤養(yǎng)分起著活化作用，通過有機質含量的改變間接影響著生物堿的含量。

表4 浙貝母生物堿與微生物多樣性之間相關性分析Tab.4 Correlation analysis between alkaloids of F.thunbergii and microbial diversity

3 討論

為了探索土壤微環(huán)境對浙貝母生長和品質的影響，本研究從分子微生態(tài)學角度分析不同產(chǎn)區(qū)、不同種源及不同生長時期的浙貝母土壤理化性質與根際微生物及生物堿合成的關系。研究結果表明，將不同種源的浙貝母種植在同一種土壤中，隨著浙貝母的生長，土壤pH逐漸上升，有機質含量先下降后上升，而脲酶和磷酸酶活性則先上升后下降。浙貝母的土壤性質均表現(xiàn)出產(chǎn)區(qū)差異及種源差異，產(chǎn)區(qū)間差異遠大于種源內差異，這表明產(chǎn)區(qū)的外環(huán)境對浙貝母的生長會產(chǎn)生直接的影響。與土壤性質表現(xiàn)出產(chǎn)區(qū)、種源差異不同，浙貝母生長期內總生物堿及單體堿含量呈一致的減少趨勢，這與藜蘆中甾體生物堿含量的變化相似[12]，表明種源、產(chǎn)地和生長期均不會影響浙貝母總生物堿含量的變化趨勢。土壤理化性質與生物堿Pearson相關性分析顯示，浙貝母中其他單體堿與貝母素甲和貝母素乙的合成同步，其合成皆與土壤有機質含量密切相關。浙貝母生長初期，土壤中酶活性越高，微生物活動越頻繁，導致有機質含量下降。由此推測，土壤有機質含量的下降導致了總生物堿及單體堿含量減少。

研究發(fā)現(xiàn)，隨著浙貝母的生長，生物堿含量、細菌豐度及多樣性指數(shù)均呈下降趨勢。Pearson相關性分析顯示，細菌多樣性與浙貝母總生物堿及單體堿含量呈正相關，說明生物堿含量與土壤細菌群落密切相關，和前期研究結果一致[13]。研究表明，細菌能夠引導生物堿的合成[14]。Caputi等[15]用生物合成法合成兩種酶，前二酮乙酸酯合成酶（precondylocarpine acetate synthase，PAS）和二氫前骨節(jié)心蛤堿合成酶（dihydroprecondylocarpine synthase，DPAS），從而實現(xiàn)了馬達加斯加長春花中抗癌藥物長春堿的生物合成。以上研究證明植物生長過程中缺少一些必需酶類，影響生物堿合成，而細菌可以提供這些必需酶類，使得生物堿合成代謝能夠正常進行。本研究中根際細菌多樣性的減少，可能使得浙貝母中依賴于細菌的生物堿合成途徑受阻，導致生物堿含量持續(xù)減少，具體還有待進一步研究證實。值得注意的是，優(yōu)勢屬中Nitrosomonadaceae-uncultured、Gemmatimonadaceae-uncultured及Methylocystaceae-uncultured的變化趨勢與生物堿含量的變化趨勢完全相同，而這些優(yōu)勢菌分別具有硝化作用[16]、幾丁質降解作用[17]和甲烷氧化作用[18]，這些優(yōu)勢屬的減少導致相關生物學作用的減弱，從而影響生物堿的合成。貝母中單體堿合成需要氮元素，而含氮有機物大多需要經(jīng)過細菌的分解才能被植物利用。因此，單體堿含量的下降以及有機質代謝減緩很可能與浙貝母根際酸桿菌門以及變形桿菌門等氮元素代謝相關細菌含量的減少有關。

研究顯示，真菌是生物堿合成的重要因素之一[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著浙貝母的生長，根際土壤中真菌豐度和多樣性均呈現(xiàn)出先降后升的趨勢，而Pearson相關性分析結果表明生物堿含量與土壤真菌多樣性之間無相關性。值得注意的是，在苗期和花期并無檢測到曲霉屬真菌的存在，而在收獲期檢測到了曲霉屬，且其豐度占據(jù)優(yōu)勢屬前20。前期研究已證實，曲霉屬真菌是浙貝母中的主要內生真菌[20]。正如鐮刀菌屬真菌等是川貝母鱗莖中產(chǎn)生生物堿的內生真菌一樣[21]，曲霉屬真菌在收獲期根際土中出現(xiàn)，可能與浙貝母生物堿的合成存在一定的關系，其內在聯(lián)系還需進一步研究。

由于本研究僅使用道地產(chǎn)區(qū)寧波產(chǎn)區(qū)的浙貝母根際土壤進行微生物多樣性分析，樣品批次偏少，存在著一定的局限性，但結合早期研究結果[13]，本研究仍能說明隨著浙貝母的生長，細菌多樣性與浙貝母生物堿含量之間呈正相關。此外，Pearson相關性分析以及細菌群落結構進行分析結果暗示了根際細菌對于浙貝母生物堿合成的促進作用，提示可以通過添加菌肥，提高土壤有機質含量及細菌多樣性來增加浙貝母生物堿的含量，從而提高浙貝母品質，接下來的研究重點將放在與生物堿合成相關的特異菌群的篩選和機制研究等方面。