陳富剛 馬南 何志義

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,南寧 530021

85%左右的肺癌患者病理類型為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1],NSCLC主要分為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鱗癌(lung squamous carcinoma,LUSC)[2]。隨著近幾年來靶向治療及免疫治療在NSCLC中的開展,對部分患者的疾病緩解起到了顯著延長的作用,但是尋求更有效的治療方法以及如何解決免疫細胞腫瘤內(nèi)浸潤仍然是目前研究的一個重點。

CXC類趨化因子及其受體已被發(fā)現(xiàn)在血管生成,腫瘤細胞的侵襲,轉(zhuǎn)移和遷移過程中有著非常的重要作用[3]。CXCL13又稱為B淋巴細胞趨化因子,與炎癥、免疫密切相關,CXCL13最初被稱為B淋巴細胞趨化因子(B lymphocyte chemoattractant,BLC)或BCA-1,是一種穩(wěn)態(tài)趨化因子。它由次級淋巴組織(濾泡)B細胞區(qū)的基質(zhì)細胞組成性分泌,如脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體[4-5]。CXCL13主要分布在胃、肝臟和淋巴結(jié)中,在調(diào)控腫瘤生長,并參與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[6]。

免疫細胞浸潤現(xiàn)在已成為研究腫瘤的熱點,對它的類別和功能的研究將會加深對腫瘤的發(fā)生發(fā)展的了解。腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著重要價值,在判斷預后方面也具有指導意義,對腫瘤相關組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝產(chǎn)生影響,腫瘤細胞內(nèi)環(huán)境也會對其產(chǎn)生影響效果[7]。除了腫瘤細胞外,腫瘤微環(huán)境還包括眾多免疫細胞,如B細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TILs)、腫瘤相關巨噬細胞(tumorassociated macrophages,TAMs)等[8]。

單細胞測序技術作為一種新興的測序技術得到了快速成長,并且已經(jīng)成為了一項成熟技術,已在表觀遺傳、基因、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄等多個組學水平完成測序,可在單個細胞的不同組學水平上對惡性腫瘤異質(zhì)性、腫瘤演變以及臨床診治等多個方面進行深入地研究[9]。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成內(nèi)容,在腫瘤細胞中DNA整體呈低甲基化狀態(tài)而某些特定區(qū)域如啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)[10-11]。DNA甲基化因為它的穩(wěn)定性和容易檢測,已經(jīng)被證實有顯著的臨床實用價值[12]。

Wang等[13]的研究證實了CXCL13在NSCLC患者血清中、肺組織中升高,提示CXCL13參與NSCLC疾病進展,但是CXCL13在NSCLC中與免疫浸潤、癌細胞功能等機制的研究目前較少。本研究擬聯(lián)合使用免疫細胞浸潤、單細胞測序及甲基化相關數(shù)據(jù)庫,研究CXCL13在NSCLC中的作用,特別是CXCL13與NSCLC中免疫細胞浸潤的關系,為進一步深入研究CXCL13在NSCLC中的作用提供幫助。

1 資料與方法

1.1 差異基因查找 使用Gepia數(shù)據(jù)庫查找NSCLC正常組織與癌組織差異基因,分析數(shù)據(jù)來源于2020年7月1日 前Gepia數(shù) 據(jù) 庫 收 錄 的TCGA數(shù)據(jù),在高表達差異基因中篩選出與炎癥相關的CXCL13。分析方法選用LIMMA算法。LUAD組中,癌癥483例,對照347例。LUSC組中,癌癥486例,對照338例。篩選標準:log2FC＞1且P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 驗證CXCL13蛋白在NSCLC患者中的表達 使用Proteinatlas數(shù)據(jù)庫中免疫組織化學結(jié)果,分析CXCL13在NSCLC患者癌組織以及正常肺組織中蛋白表達情況。

1.3 CXCL13與NSCLC腫瘤功能相關性 使用CancerSEA網(wǎng)站分析CXCL13在不同NSCLC單細胞數(shù)據(jù)集中與癌癥各種功能狀態(tài)之間的相關性,使用Spearman相關系數(shù)分析。

1.4 CXCL13在NSCLC中甲基化情況 使用Ualcan數(shù)據(jù)庫分析CXCL13在NSCLC中甲基化水平,以及CXCL13甲基化水平與NSCLC患者吸煙、分期、TP53突變、臨床分期、淋巴結(jié)受累之間的關系。

1.5 CXCL13與NSCLC中免疫細胞浸潤關系使用TIMER數(shù)據(jù)庫中使用反卷積算法得到的LUSC和LUAD中免疫細胞浸潤組成,分析CXCL13表達與NSCLC中B細胞、T細胞CD8+細胞、Tregs細胞免疫浸潤的相關性,并同時使用多因素分析研究CXCL13表達、B細胞、T細胞CD8+細胞、Tregs細胞免疫浸潤與NSCLC預后的相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL13在NSCLC中m RNA表 達CXCL13在NSCLC中m RNA的表達在癌組織中明顯高于正常組織(P＜0.05),見圖1。

圖1 CXCL13在NSCLC中mRNA表達情況(a P＜0.05)

2.2 CXCL13在NSCLC肺組織中蛋白表達情況Proteinatlas數(shù)據(jù)庫驗證CXCL13在NSCLC肺組織中蛋白表達情況。CXCL13在NSCLC肺組織中表達稍高于正常肺組織,見圖2。

圖2 CXCL13在NSCLC肺組織中蛋白表達情況 A、D:正常肺組織；B、C:LUAD；E、F:LUSC

2.3 CXCL13與NSCLC腫 瘤 功 能 相 關 性CancerSEA分析CXCL13在不同NSCLC單細胞數(shù)據(jù)集中各種功能狀態(tài)活動之間的相關性(圖3)。

圖3 CXCL13與NSCLC腫瘤功能相關性 A:Kim(EXP0068)提示CXCL13與細胞周期、侵襲、DNA損傷和修復等相關。B:詳細功能關聯(lián)提示CXCL13表達在NSCLC患者中與轉(zhuǎn)移和侵襲呈正相關(Spearman系數(shù)分別為0.34、0.31,P＜0.001),與DNA修復呈負相關(Spearman系數(shù)為-0.34,P＜0.001)

2.4 CXCL13在NSCLC中甲基化情況 Ualcan分析CXCL13在NSCLC中甲基化水平,在LUSC患者癌組織、吸煙者組織以及無論是否存在P53突變、患者處于不同的臨床分期、不同淋巴結(jié)受累程度的情況下,多觀察到CXCL13甲基化水平降低(圖4),而在LUAD患者中結(jié)果多為相反(P＜0.05)(圖5)。

圖4 不同LUSC患者中CXCL13甲基化水平 A:腫瘤早期；B:腫瘤不同時期；C腫瘤轉(zhuǎn)移；D:P53突變；E:吸煙情況

圖5 不同LUAD患者中CXCL13甲基化水平 A:腫瘤早期；B:腫瘤不同時期；C腫瘤轉(zhuǎn)移；D:P53突變；E:吸煙情況

2.5 CXCL13表達在NSCLC中免疫細胞浸潤關系 利用TIMER網(wǎng)站分析CXCL13在NSCLC中免疫浸潤水平。CXCL13的表達在NSCLC患者中腫瘤純度呈負相關,與NSCLC患者B細胞、T細胞CD8+細胞、Tregs細胞浸潤呈正相關(P＜0.05),但相關程度比較低(Rho＜0.7,圖6～9)。經(jīng)多因素Cox回歸分析,CXCL13高表達合并高水平T細胞CD8+細胞浸潤組LUSC患者預后好于CXCL13高表達合并低水平T細胞CD8+細胞浸潤組(P＜0.05),CXCL13高表達合并低水平Tregs細胞浸潤組LUSC患者預后好于CXCL13高表達合并高水平Tregs細胞浸潤組(P＜0.05)。其余分組預后差異均無統(tǒng)計學意義(圖10)。

圖6 LUSC患者T細胞CD8+細胞、Tregs細胞、B細胞浸潤程度與預后關系

圖7 LUAD患者T細胞CD8+細胞、Tregs細胞、B細胞浸潤程度與預后關系

圖8 LUSC患者T細胞CD8+細胞、Tregs細胞、B細胞浸潤程度與預后關系

圖9 LUAD患者T細胞CD8+細胞、Tregs細胞、B細胞浸潤程度與預后關系

圖10 CXCL13的表達與NSCLC患者Tregs細胞免疫浸潤水平與預后的關系,使用QUANTISEQ算法分析 A:肺腺癌；B:肺鱗癌

3 討論

炎癥是機體對刺激的一種防御反應,也是腫瘤的標志之一,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用,而趨化因子是腫瘤中炎癥細胞浸潤的最重要的介質(zhì)分子[14]。趨化因子不僅可誘發(fā)炎癥細胞浸潤腫瘤細胞,而且還可促進新生腫瘤細胞存活、侵犯及增殖[15]。

CXCL13是一種炎癥趨化因子,本研究通過Gepia篩選NSCLC中存在差異表達的基因,CXCL13m RNA在NSCLC癌組織中表達明顯高于正常組織,進一步使用Proteinatlas數(shù)據(jù)庫驗證CXCL13在NSCLC肺組織中蛋白表達情況,結(jié)果顯示在CXCL13蛋白表達在NSCLC肺組織中高于正常肺組織。

T濾泡輔助細胞(TFH cell)的浸潤并產(chǎn)生的CXCL13對腫瘤部位產(chǎn)生B細胞反應非常重要,并與促進局部記憶B細胞分化以及T調(diào)節(jié)細胞亞群的擴張有關[16]。在B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)細胞的微環(huán)境調(diào)節(jié)中CXCL13/CXCR5軸具有特別重要的作用,B-CLL即外周血、次級淋巴組織和骨髓中CD5+腫瘤性B細胞的單克隆群體,次級淋巴器官和骨髓是B-CLL細胞增殖的庇護所,也保護它們免受自發(fā)或藥物誘導的凋亡。CXCL13/CXCR5信號有助于B-CLL細胞進入這些庇護所[17]。本研究結(jié)果顯示CXCL13與NSCLC中B細胞浸潤存在明顯相關性,且B細胞浸潤與不良預后明顯相關。CD8+T細胞密度被認為是一個強效的生存預測指標,CD8+T細胞密度也被認為與免疫治療的療效密切相關[18]。在癌癥晚期、化療后的患者中均顯示CD8+T細胞密度與預后密切相關[19-20],而腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞的浸潤程度增高與良好預后相關。Tregs和Treg釋放的免疫抑制因子進入腫瘤的微環(huán)境是重建抗腫瘤免疫反應的一種途徑[21]。NSCLC患者腫瘤組織、骨髓、淋巴結(jié)或外周血中高密度的異源性Treg被認為是腫瘤預后的預測因子[22]。本研究結(jié)果顯示CXCL13在NSCLC中CD8+T細胞和Treg細胞呈正相關(P＜0.05),但與Treg細胞相關系數(shù)較低。提示CXCL13的表達增高與NSCLC中CD8+T浸潤密切相關,與Treg細胞浸潤亦存在相關性,但仍需要進一步深入研究。

CancerSEA是分析單細胞測序的數(shù)據(jù)庫,使用該數(shù)據(jù)庫分析CXCL13在NSCLC各種細胞群及其功能的相關性,結(jié)果提示CXCL13表達在NSCLC細胞癌轉(zhuǎn)移、血管生呈正相關,與DNA修復呈負相關。之前的研究已經(jīng)顯示CXCL13在肺癌組織明顯高表達,誘導腫瘤細胞遷移[13,23]。在NSCLC患者中CXCL13/CXCL5參與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,體外實驗顯示CXCL 13刺激可以顯著促進NSCLC來 源 的NCI-H1915細 胞 遷 移[23]。CXCL13在肺癌小鼠模型中通過促進巨噬細胞釋放SPP1,從而促進癌細胞遷移[13]。CXCR1、CXCR2和CXCR4及其配體CXCL5、CXCL8和CXCL12的高表達似乎與腫瘤血管生成有關[23],但是,CXCL13與腫瘤中血管生成、DNA修復的具體機制目前仍缺乏具體研究。

DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展風險有關,有可能在癌癥早期就發(fā)生[24],DNA甲基化狀態(tài)的改變也被作為癌癥初期診斷和治療的標記物與藥物靶點之一。癌癥細胞中DNA序列改變可伴隨啟動子區(qū)域呈現(xiàn)出高甲基化狀態(tài),但全基因組的狀態(tài)處于低甲基化[10-11]。高甲基化狀態(tài)主要通過抑制正?；虻谋磉_進而誘發(fā)癌癥[25]。而低甲基化狀態(tài)一般表現(xiàn)在重復序列上,降低染色體的穩(wěn)定性,也會啟動部分原癌基因來加快腫瘤發(fā)生[26-27]。CXCL13在LUSC中的啟動子甲基化與正常組織相比多處于低甲基化狀態(tài),無論從分期、是否有TP53基因突變或者是否吸煙,而在LUAD中則多處于高甲基化狀態(tài),趨化因子和受體上調(diào)是由不同的機制驅(qū)動的,包括CXCL13基因的Rel A和Nrf2的轉(zhuǎn)錄控制,以及CXCR5啟動子的表觀遺傳調(diào)控(缺乏Cp G島甲基化)[28]。CXCL13在LUSC、LUAD中的甲基化水平不同,具體機制及臨床應用需要待進一步深入研究。

本研究基于生物信息學,通過使用TIMER、CancerSEA、Gepia等數(shù)據(jù)庫來進行分析研究CXCL13在NSCLC中的功能。但是,本研究仍有一些不足之處,首先很多趨化因子與腫瘤免疫浸潤有著聯(lián)系,比如CXCL8、CXCL12、CXCL21等,但是我們未能全面而系統(tǒng)地研究趨化因子家族在NSCLC中的功能,其次腫瘤免疫浸潤參與的細胞包括有很多種,如CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等,本研究只分析了其中三種。

總之,通過生物信息學方法,我們分析了CXCL13在NSCLC中的作用,CXCL13的高表達與NSCLC中B細胞、CD8+T細胞和Tregs細胞的免疫浸潤相關,但與Tregs細胞的免疫浸潤相關性較低。CXCL13與NSCLC的轉(zhuǎn)移與侵襲有關,并且通過啟動子甲基化的參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,其在LUSC和LUAD的 作 用 不 同。CXCL13參 與NSCLC的免疫細胞浸潤及腫瘤細胞功能,因此通過靶向免疫抑制CXCL13,也許可以作為今后對NSCLC的免疫治療方法之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突