李志強(qiáng) 張和平 陳凱

寶雞市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 721008

肺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤,其中80%以上為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC被確診時(shí)大多處于中晚期,錯(cuò)過(guò)手術(shù)切除時(shí)機(jī),總體預(yù)后不夠理想[1]。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),微小RNA(miRNA)是一類在惡性腫瘤異常表達(dá)的小分子RNA,在腫瘤中作用與原癌基因和抑癌基因相似,影響著腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程[2]。miR-92a是miRNA家族的重要成員之一,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其可影響胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,但在不同種類腫瘤細(xì)胞中可能分別起到致癌或抑癌作用[3-4]。目前miR-92a對(duì)NSCLC細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程作用尚無(wú)定論,本次擬通過(guò)收集臨床樣本和進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),分析miR-92a在人NSCLC組織中表達(dá)情況,同時(shí)分析其差異性表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,以期為NSCLC臨床治療提供新的靶點(diǎn)和方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)性研究。收集我院2018年1月至2020年10月收治的39例NSCLC患者癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織,入組條件:(1)患者經(jīng)穿刺活檢取得NSCLC組織和癌旁組織標(biāo)本,所有操作符合臨床實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范；(2)取組織前患者未接受過(guò)放化療及相關(guān)藥物治療；(3)患者臨床資料完整。收集NSCLC患者臨床資料,39例患者中男21例,女18例；年齡(67.52±5.26)歲,范圍為42～73歲,其中≥60歲24例,＜60歲15例；病理分型中有鱗癌20例,腺癌19例,TNM分期中T1期10例,T2期8例,T3期14例,T4期7例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例,未轉(zhuǎn)移15例；組織分化中高分化26例,中等分化8例,低分化5例。本研究經(jīng)寶雞市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(BZYL2018-1),所有患者均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 PCR試劑盒(日本TAKARA公司),RNA提取試劑盒(美國(guó)默克公司),miR-92a mimics、miR-92a inhibitor及對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照質(zhì)粒(購(gòu)自北京中科院),RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),青鏈霉素(美國(guó)Invirogen公司),RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)賽默飛公司),CCK8試劑盒(武漢默沙克生物有限公司)。PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)公司T100型),Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司),CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司371型),酶標(biāo)儀(美國(guó)邁瑞MR-96A型)。

1.3 NSCLC組織和癌旁組織中miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量 采用RT-PCR檢測(cè)組織中miR-92a mRNA相對(duì)表達(dá)量,具體步驟:在組織標(biāo)本中加入Trizol試劑(60 mg勻漿組織中加入1 ml Trizol),經(jīng)過(guò)RNA相位分離、沉淀、洗滌和再溶解來(lái)提取組織中總RNA,并于-80℃凍存以統(tǒng)一檢測(cè)。測(cè)定提取的總RNA樣品濃度,確定合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,配置好PCR反應(yīng)體系后進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃2 min,95℃15 s,58℃60 s,共55個(gè)循環(huán)。引物序列:miR-92a上游,5′-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3′,下 游,5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC-3′；內(nèi)參U6上 游,5′-GCTTCGGCAGCACATTACTAAAAT-3′,下游,5′-CGCTTCACGAATTTGCGTCTCAT-3′,miR-92a m RNA相 對(duì) 表 達(dá) 量 以2-ΔΔCt表示,每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)3次并取平均值。記錄每例組織標(biāo)本中miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量,并分析其與患者臨床病理關(guān)系。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞(購(gòu)自北京中科院)在含10%胎牛血清(FBS)和1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-92a mimics、miR-92a inhibitor或miRNC對(duì)照序列轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中,并分別作為miR-92a mimics組、miR-92a inhibitor組和對(duì)照組,轉(zhuǎn)染后繼續(xù)孵育48 h。

1.5 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-92a mRNA相對(duì)表達(dá)量 吸去培養(yǎng)液并加入PBS清洗、胰酶消化,在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓時(shí)加入培養(yǎng)基終止消化,隨后用玻璃吸管吸取細(xì)胞液使之混合均勻,待培養(yǎng)瓶的細(xì)胞完全脫離瓶底懸浮,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞液濃度至(3～10)×106個(gè)/ml,在6孔板中接種培養(yǎng)細(xì)胞,每個(gè)孔內(nèi)加入1 ml Trizol試劑,用移液槍打勻后移入EP管,隨后用注射器進(jìn)行快速抽吸以吹打裂細(xì)胞,加入氯仿震蕩后離心并吸取上清液,在上清液中加入異丙醇靜置1 min后再次離心,取沉淀加入DEPC水配置的乙醇稀釋,離心并取沉淀,干燥,加入DEPC水溶解,采用分光光度計(jì)檢測(cè)其紫外吸光度以確定RNA濃度和純度,后面步驟與1.3中相同,逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增,miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量 以2-ΔΔCt表示,每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)3次并取平均值,然后對(duì)各組間表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比分析。

1.6 CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率 將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞用PBS清洗后加入胰酶消化,在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓時(shí)加入培養(yǎng)基終止消化,隨后用玻璃吸管吸取細(xì)胞液使之混合均勻,待培養(yǎng)瓶的細(xì)胞完全脫離瓶底懸浮,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞液濃度至(3～5)×104個(gè)/ml,在96孔板中接種培養(yǎng)細(xì)胞并標(biāo)記,培養(yǎng)條件為37℃5% CO2。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時(shí),分別加入10μl CCK8試劑37℃避光孵育2 h,以空白孔調(diào)零,隨后加入150μl DMSO溶解并在450 nm處測(cè)定吸光度值,OD值可反映增殖水平大小,每組重復(fù)操作3次并取平均值。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 在6孔板背面用記號(hào)筆劃兩條平行直線并接種細(xì)胞,采用移液槍將標(biāo)記部位直線內(nèi)細(xì)胞劃除,此過(guò)程在顯微鏡下操作,并分別在劃痕24 h、48 h后拍照并計(jì)算細(xì)胞遷移距離,遷移距離=原始距離-現(xiàn)階段細(xì)胞間距離。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),各組不同時(shí)點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析,計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織和正常組織中miR-92a表達(dá)NSCLC組織中miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量高于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組織和癌旁正常組織中miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量(±s)

表1 NSCLC組織和癌旁正常組織中miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量(±s)

組別 例數(shù) miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量NSCLC組織 39 2.58±0.47癌旁正常組織 39 1.04±0.39 t值 15.747 P值 ＜0.01

2.2 NSCLC患者不同臨床病理miR-92a的表達(dá)NSCLC患者在不同性別、不同年齡以及鱗癌與腺癌的之間癌組織中miR-92a mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但患者TNM分期T3+T4期者較T1+T2期者、中低分化較高分化者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-92a m RNA表達(dá)量高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。

表2 miR-92a m RNA表達(dá)與NSCLC患者臨床病理關(guān)系(±s)

表2 miR-92a m RNA表達(dá)與NSCLC患者臨床病理關(guān)系(±s)

項(xiàng)目 例數(shù) miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量 t值 P值性別 0.792 0.434男21 2.62±0.32女18 2.53±0.39年齡(歲) 1.982 0.055≥60 24 2.67±0.24＜60 15 2.48±0.33病理類型 1.804 0.079鱗癌 20 2.63±0.20腺癌 19 2.49±0.28 TNM分期 4.651 0.000 T1+T2 18 2.19±0.30 T3+T4 21 2.68±0.35分化程度 6.047 0.000中低分化 13 2.84±0.26高分化 26 2.13±0.38淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 5.203 0.000是24 3.25±0.68否15 2.17±0.54

2.3 各組細(xì)胞miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量比較RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-92a mimics組miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)水平高于mimics-NC組,轉(zhuǎn)染24 h后miR-92a inhibitor組 細(xì) 胞miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)水平低于inhibitor-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表3、4。

表3 兩組miR-92a m RNA的表達(dá)(±s)

表3 兩組miR-92a m RNA的表達(dá)(±s)

組別 細(xì)胞數(shù) miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量miR-92a mimics組 6 2.33±0.19 mimics-NC組 6 1.02±0.29 t值 4.704 P值 0.043

2.4 各組細(xì)胞增殖水平比較 培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,各組細(xì)胞均隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)增殖水平逐漸升高,miR-92a mimics組細(xì)胞增殖水平高于mimics-NC組,miR-92a inhibitor組細(xì)胞增殖水平低于inhibitor-NC組,4組在組間、時(shí)點(diǎn)間以及組間和時(shí)點(diǎn)間的交互作用,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表5、圖1。

表5 各組細(xì)胞增殖水平比較(±s)

表5 各組細(xì)胞增殖水平比較(±s)

組別 細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞增殖水平(OD值)0 h 24 h 48 h 72 h miR-92a mimics組 6 0.375±0.014 0.690±0.02 0.778±0.023 0.984±0.015 mimics-NC組 6 0.381±0.025 0.407±0.017 0.527±0.018 0.672±0.019 miR-92a inhibitor組 6 0.372±0.018 0.398±0.015 0.407±0.036 0.428±0.026 inhibitor-NC組 6 0.376±0.23 0.403±0.026 0.531±0.024 0.679±0.038組間 F=2 319.690，P＜0.001時(shí)點(diǎn)間 F=2 011.809，P＜0.001組間·時(shí)點(diǎn)間 F=290.645，P＜0.001

圖1 各組細(xì)胞增殖情況比較

表4 兩組轉(zhuǎn)染24 h后miR-92a mRNA的表達(dá)(±s)

表4 兩組轉(zhuǎn)染24 h后miR-92a mRNA的表達(dá)(±s)

組別 細(xì)胞數(shù) miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量miR-92a inhibitor組 6 0.27±0.13 inhibitor-NC組 6 1.03±0.31 t值 6.110 P值 0.023

2.5 各組遷移能力比較 劃痕24 h、48 h后,miR-92a mimics組細(xì)胞遷移能力高于mimics-NC組,miR-92a inhibitor組細(xì)胞遷移距離低于inhibitor-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表6、圖2。

表6 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力比較(±s)

表6 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力比較(±s)

組別 細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)移(μm)24 h 48 h miR-92a mimics組 6 601.4±95.6 840.2±168.9 mimics-NC組 6 220.1±67.2 324.7±13.5 miR-92a inhibitor組 6 97.6±18.4 128.7±46.7 inhibitor-NC組 6 226.1±38.3 319.6±23.3組間 F=2 506.614，P＜0.01時(shí)點(diǎn)間 F=485.179，P＜0.01組間·時(shí)點(diǎn)間 F=64.559，P＜0.01

圖2 各組細(xì)胞遷移能力比較

3 討論

NSCLC是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤,具有較高的發(fā)病率和病死率,手術(shù)切除是其主要治愈手段[5]。NSCLC早期臨床癥狀無(wú)明顯特異性,確診時(shí)多為中晚期而失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)[6]。目前臨床上多采用放化療、免疫療法、分子靶向療法等進(jìn)行治療,其中分子靶向療法可有效延長(zhǎng)患者生存期[7],因此尋找NSCLC靶向標(biāo)志物能為肺癌治療提供新的思路和方向。

miRNAs是一類具有重要生物學(xué)功能的小分子單鏈RNA,近年來(lái)大量研究證實(shí)多種miRNAs在惡性腫瘤發(fā)展過(guò)程中起作用[8-10]。miR-92a是miRNAs家族成員,位于13號(hào)染色體上,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[11]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-92a在髓母細(xì)胞瘤中表達(dá)較高,且主要通過(guò)下調(diào)MMP蛋白抑制劑表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[12]。還有學(xué)者在體外實(shí)驗(yàn)中下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中miR-92a表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng),提示miR-92a在乳腺癌中可能起到抑癌作用[13]。本研究結(jié)果顯示,NSCLC組織中miR-92a相對(duì)表達(dá)量高于正常組織,提示miR-92a在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào)。有學(xué)者采用原位雜交和PCR技術(shù)分析了多種NSCLC細(xì)胞系(H2170,SPC-A1,A549)中miR-92a表達(dá),發(fā)現(xiàn)其均高于正常支氣管上皮細(xì)胞中miR-92a表達(dá)[14],提示miR-92a在NSCLC細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá),可能在NSCLC中起到促癌作用,與本次研究結(jié)果類似。而分析miR-92a表達(dá)與NSCLC患者臨床病理因素發(fā)現(xiàn),TNM分期T3+T4期、中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者癌組織中miR-92a m RNA相對(duì)表達(dá)量分別高于T1+T2期、高分化、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者,提示miR-92a表達(dá)與NSCLC臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示miR-92a可能參與了NSCLC的增殖生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-92a在NSCLC中所起作用,本次通過(guò)在體外實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建體miR-92a高表達(dá)和低表達(dá)的NSCLC細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-92a表達(dá)后細(xì)胞增殖和遷移能力均增強(qiáng),而下調(diào)miR-92a表達(dá)后細(xì)胞增殖和遷移能力均降低,提示miR-92a可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-92a可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性,影響放化療效果[15],有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-92a在肺癌A549細(xì)胞的表達(dá)上調(diào),且下調(diào)其表達(dá)后細(xì)胞增殖水平和血管生成標(biāo)志物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)量也降低,提示miR-92a可促進(jìn)NSCLC進(jìn)展[16]。以上結(jié)果表明miR-92a在NSCLC中發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到致癌作用。目前關(guān)于miR-92a參與NSCLC發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制尚不明確。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-92a能靶向調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/Akt通路抑制細(xì)胞自噬來(lái)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞存活,這可能是提高NSCLC細(xì)胞活性和增殖水平的原因之一[17]。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),miR-92a能通過(guò)上調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)促進(jìn)直腸癌細(xì)胞的遷移能力[18],但miR-92a影響NSCLC細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究和論證。

綜上所述,miR-92a在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào),且與患者臨床病理相關(guān),下調(diào)miR-92a表達(dá)可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力。因此通過(guò)本次研究我們初步驗(yàn)證了miR-92a在可促進(jìn)NSCLC的發(fā)展,這可能為NSCLC的臨床診療提供新的思路和治療靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突