都晶晶，夏玉，任揚(yáng)，李燕紅，李政，張改生，王軍衛(wèi)，馬守才，宋瑜龍，齊倩，牛娜

摘要：【目的】克隆小麥絨氈層退化基因（Tapetum degeneration retardation，TaTDR-Like），研究其組織表達(dá)及不同育性材料間花藥不同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式，為深入揭示小麥花藥異常發(fā)育的分子機(jī)制打下理論基礎(chǔ)?！痉椒ā恳云胀ㄐ←溒贩N西農(nóng)1376（MF-XN1376）為材料，通過PCR擴(kuò)增克隆得到TaTDR-Like基因的3個(gè)同源拷貝，利用生物信息學(xué)分析TaTDR-Like蛋白特性及TaTDR-Like基因啟動(dòng)子順式作用元件，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TaTDR-Like基因的組織表達(dá)情況及在可育、不育材料花藥不同時(shí)期中的時(shí)空表達(dá)模式，利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行自激活檢測(cè)，并構(gòu)建植物融合表達(dá)載體35S-TaTDRLD-EGFP，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草葉片表皮細(xì)胞，觀察 TaTDRL-D蛋白亞細(xì)胞定位情況?！窘Y(jié)果】成功克隆小麥TaTDR-Like基因，發(fā)現(xiàn)該基因存在3個(gè)同源拷貝即TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D，分別編碼550、553、557個(gè)氨基酸，其蛋白分子量分別為58.50、58.90和59.21 kD，等電點(diǎn)（pI）分別為4.77、4.66和4.63。TaTDR-Like蛋白均在C端有1個(gè)bHLH保守結(jié)構(gòu)域，其中TaTDRL-A與TaTDRL-B的保守結(jié)構(gòu)域相似度達(dá)100%，與TaTDRL-D的保守結(jié)構(gòu)域相似度為96%，TaTDRL-D與OsTDR、AtAMS保守結(jié)構(gòu)域相似度分別為98%和88%;系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明TaTDR-Like蛋白與大麥（KAE8787147.1）、二穗短柄草TDR（XP_014756384）、水稻TDR（Os02g0120500）和擬南芥AMS（AT2G16910.1）的進(jìn)化關(guān)系較密切;啟動(dòng)子分析表明TaTDR-Like基因啟動(dòng)子處含有較多光響應(yīng)元件、非生物應(yīng)激反應(yīng)、激素響應(yīng)元件等順式作用元件;組織特異性表達(dá)分析顯示TaTDRL-D在花藥中的表達(dá)量最高，而TaTDRL-A和TaTDRL-B在幼穗表達(dá)量較高;對(duì)花藥發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)分析顯示TaTDRL-D在花藥發(fā)育單核早期表達(dá)量最高，之后逐漸降低，單核晚期到三核期不育材料（CMS-XN1376）表達(dá)量均高于可育材料（MF-XN1376）;自激活檢測(cè)結(jié)果表明TaTDRL-D具有轉(zhuǎn)錄激活活性;亞細(xì)胞定位顯示TaTDRL-D蛋白定位于細(xì)胞核。【結(jié)論】TaTDRL-D基因可能參與小麥花藥發(fā)育，負(fù)調(diào)控花藥育性。

關(guān)鍵詞： 小麥;TaTDR-Like基因;克隆;轉(zhuǎn)錄因子;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S512.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）09-2329-10

Cloning and expression analysis of TaTDR-Like genes in wheat

DU Jing-jing1， XIA Yu1， REN Yang1， LI Yan-hong1， LI Zheng2， ZHANG Gai-sheng1，3，WANG Jun-wei1， MA Shou-cai1， SONG Yu-long1，3， QI Qian1， NIU Na1，3*

（1College of Agronomy， Northwest A & F University/National Yangling Agricultural Biotechnology Breeding Center/Yangling Branch of National Wheat Improvement Center/Engineering Research Center of Wheat Breeding of Ministry of Education， Yangling， Shaanxi? 712100， China; 2College of Life Science， Henan University/State Key Laboratory

of Crop Adversity Adaptation and Improvement， Kaifeng， Henan? 475001， China; 3Key Laboratory of

Crop Heterosis Research and Utilization in Shaanxi Province，Yangling， Shaanxi? 712100， China）

Abstract：【Objective】Wheat tapetum degeneration retardation-like（TaTDR-Like） genes were cloned and their expression patterns were analyzed between different tissues and different developmental stages of anthers in order to gain insight into the molecular mechanisms underlying abnormal wheat pollen development. 【Method】In this study， orthologues of rice （Oryza sativa L.） gene TDR（Os02t0120500） were cloned from the common wheat cultivar， MF-XN1376. Bioinformatics was used to analyze the characteristics of the proteins and cis-acting elements of the gene promoters. Moreover， real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to assess the tissue-specific expression of TaTDR-Like genes in different tissues （anther， leaf， ovary， stem and spike） and expression pattern of TaTDRL-D genes in anthers at different developmental stages. The subcellular localization of TaTDRL-D protein was observed， and yeast two-hybrid technology was used to detect its self-activation. The plant fusion expression vector 35S-TaTDRLD-EGFP was construc-ted and transferred into tobacco leaf epidermal cells through agrobacterium-mediated transfer. 【Result】It was found that there were three homologous copies， namely TaTDRL-A， TaTDRL-B and TaTDRL-D， encoding 550， 553 and 557 amino acids （aa）， corresponding to molecular weights of 58.50， 58.90 and 59.21 kD and isoelectric points （pI） of 4.77， 4.66 and 4.63， respectively. TaTDR-Like proteins all have a bHLH conserved domain at the C-terminal. TaTDRL-A and TaTDRL-B had 100% and 96% similarity with TaTDRL-D， respectively， while TaTDRL-D showed 98% and 88% similarity with OsTDR and AtAMS， respectively. A phylogenetic tree analysis showed that TaTDR-Like proteins were closely rela-ted to rice TDR （Os02g0120500）， Brachypodium distachyum TDR（XP014756384），barley（KAE8787147.1） and Arabidopsis AMS （AT2G16910.1）. Promoter analysis results showed that TaTDRL-A， TaTDRL-B and TaTDRL-D promoters contain many cis-acting elements， such as those involved in the response to light conditions，? abiotic stress and phytohormones， which may participate in plant growth， development and the response to abiotic stress. Tissue-specific expression analysis showed that TaTDRL-D had the highest expression level in anthers， followed by young panicles and stems， while TaTDRL-A and TaTDRL-B showed higher expression levels in young panicles. Further studies revealed the expression level of TaTDRL-D to be the highest at the early mononuclear stage of anther development after which it showed a gradual decrease. The expression level in cytosolic male sterility tissues （CMS-XN1376） was higher than that in male fertile tissues （MF-XN1376） from the late mononuclear stage to the tri-nuclear stage. The results showed that TaTDRL-D had transcriptional activation activity. Subcellular localization showed that the TaTDRL-D protein was localized in the nucleus. 【Conclusion】TaTDRL-D gene may be involved in anther development and negatively regulate anther fertility in wheat.

Key words： wheat; TaTDR-Like gene; cloning; transcription factor; expression analysis

Foundation item：Shaanxi Key Research and Development Project（2019NY-003）;Key Laboratory Project of Shaanxi （2018SZS-22） ;Postdoctoral Foundation of Shaanxi （2016BSHED113）;College Students Innovation and Entrepreneurship Training Project of Northwest A & F University（X202010712224）

0 引言

【研究意義】雜種優(yōu)勢(shì)作為自然界的一種普遍現(xiàn)象，已在玉米、水稻、油菜等作物的高產(chǎn)和抗逆育種中取得顯著成果（王竹云等，2019;尤詩婷等，2019）。研究表明，小麥（Tritiaum aestivum L.）也具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)（趙昌平，2010）。小麥雄性不育是雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑，其不育機(jī)理是雜種優(yōu)勢(shì)利用的理論基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)絨氈層異常發(fā)育會(huì)導(dǎo)致雄性不育，在花藥中的主要作用包括提供小孢子發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)、參與花粉外壁前體及孢粉素前體合成、分泌并轉(zhuǎn)運(yùn)胼胝質(zhì)酶、合成花粉包被等（樓悅，2012），表明小孢子的正常發(fā)育與絨氈層細(xì)胞是否正常發(fā)育密切相關(guān)。因此，克隆小麥絨氈層退化基因（Tapetum degeneration retardation，TaTDR-Like）并對(duì)其進(jìn)行序列特征分析及組織表達(dá)分析，可為解析TaTDR-Like的功能及闡明小麥花藥發(fā)育過程中花粉異常的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TDR基因?qū)儆赽HLH轉(zhuǎn)錄因子家族，大量研究表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族主要參與調(diào)控植物生長發(fā)育（如光信號(hào)傳遞、植物激素信號(hào)和器官發(fā)育等）（Heisler et al.，2001;Fujimori et al.，2004;Oscar et al.，2004;廉騰飛等，2018）和逆境脅迫（干旱、低溫和鹽等）（Graciela et al.，2015;徐秀榮等，2019;Liu et al.，2020）。目前相關(guān)研究主要集中在擬南芥和水稻上，小麥中尚未見TDR基因的研究報(bào)道。在水稻中，TDR基因可通過影響花藥脂肪積累、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等途徑引起絨氈層細(xì)胞程序性死亡（PCD），并在花藥發(fā)育過程中控制花粉壁發(fā)育（Li et al.，2006）。此外，TDR的功能缺失還導(dǎo)致236個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化，其中有154個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，82個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，表明TDR是花粉發(fā)育過程中絨氈層PCD以及其他一些基本生物學(xué)過程的主要調(diào)控因子（Zhang et al.，2008）。擬南芥AMS基因（Aborted Microspores）（AT2G16910.1）是OsTDR的同源基因，該基因?qū)儆赽HLH基因MYC亞家族的典型轉(zhuǎn)錄因子，在花粉發(fā)育早期表達(dá)，在花粉減數(shù)分裂前后達(dá)到最高，是擬南芥孢粉素生物合成、分泌和花粉壁形成的主要調(diào)控因子（Anna et al.，2003）。ams突變體表現(xiàn)出小孢子缺陷，缺乏孢粉素沉積，總酚類化合物和角質(zhì)單體顯著減少（Xu et al.，2014）。目前已在多種植物中鑒定到AMS基因并證實(shí)其與花藥的發(fā)育及育性相關(guān)，如在瓜類中利用育性分離群體定位到該基因（LOC103498166），同時(shí)證實(shí)敗育小孢子AMS基因在雄性不育系（ms-5）和雄性可育系（HM1-1）2 mm（四分體）及5 mm（第1次花粉有絲分裂）期間的表達(dá)量存在顯著差異（Sheng et al.，2017）;在辣椒（Capsicum annuum L.）中發(fā)現(xiàn)并擴(kuò)增2種亞型：CaAMS1和CaAMS2。研究發(fā)現(xiàn)CaAMS在絨氈層強(qiáng)烈表達(dá)，CaAMS的下調(diào)導(dǎo)致花絲部分縮短、雄蕊皺縮不裂及花粉敗育（Guo et al.，2018）。洋蔥（Allium cepa L.）AcAMS過表達(dá)顯示轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)為部分不育甚至完全不育，部分不育植株的果莢變短，完全不育植株果莢不僅短小而且伴隨彎曲生長，轉(zhuǎn)基因株系花的雄蕊比雌蕊更長，花藥不飽滿且無光澤，有活力的花粉粒明顯少于野生型（袁巧玲，2019）。【本研究切入點(diǎn)】至今鮮見有關(guān)小麥TDR基因同源拷貝克隆及該基因在花藥育性表達(dá)模式分析的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】從小麥品種西農(nóng)1376中通過PCR擴(kuò)增克隆得到TaTDR-Like基因的3個(gè)同源拷貝，研究TaTDR-Like基因組織表達(dá)及不同育性材料間花藥不同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和啟動(dòng)子順式作用元件分析，從轉(zhuǎn)錄激活活性、亞細(xì)胞定位和基因表達(dá)的角度初步探討小麥TaTDR-Like基因的功能，為深入揭示小麥花藥異常發(fā)育的分子機(jī)制打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為普通小麥品種西農(nóng)1376（MF-XN1376）和遺傳型雄性不育系西農(nóng)1376（CMS-XN1376），MF-XN1376是CMS-XN1376的保持系，二者具有相同的細(xì)胞核背景。試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。于2018年10月播種，每個(gè)材料各播種10行，行長1 m，行距0.25 m，株距0.67 m。取MF-XN1376植株的花藥、莖、葉、子房和幼穗用于組織表達(dá)分析，分別取MF-XN1376和CMS-XN1376的單核早期、單核晚期、二核期和三核期的花藥用于時(shí)空表達(dá)分析。取材后所有樣品立即冷凍在液氮中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：TRIzol和KOD FX高保真購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)試劑盒Trans-Script? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和TransScript? Tip Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物有限公司，pClone007 Vector Kit購自北京擎科生物科技有限公司，BM無縫克隆試劑盒購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。主要設(shè)備儀器：IX83-FV1200激光共聚焦熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS Corporation。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總RNA提取及cDNA合成 采用TRIzol法提取植物組織總RNA。利用反轉(zhuǎn)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1. 2. 2 小麥TaTDRL基因克隆 從GenBank中獲取OsTDR蛋白序列（XP_015625730.1），通過NCBI/blplants/Blast的參考基因組數(shù)據(jù)庫識(shí)別TaTDR-Like的氨基酸序列。選擇得分最高、E-val最低的預(yù)測(cè)基因作為目標(biāo)基因。目的基因的CDS序列從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫獲得，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中得到證實(shí)。使用Primer Premier 5.0根據(jù)TaTDR-Like的CDS序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增TaTDR-Like基因的引物（表1）。以MF-XN1376 cDNA為模板，KOD高保真酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系50 ?L：10×KOD-Plus-Neo PCR Buffer 5 ?L，2 mmol/L dNTPs 5 ?L，25 mmol/L MgSO4 3 ?L，上、下游引物各3 ?L，cDNA模板3 ?L，ddH2O 28 ?L。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s，64 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min 30 s，進(jìn)行44個(gè)循環(huán);68 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物連接pClone007載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在相應(yīng)抗性LB培養(yǎng)基上篩選出若干個(gè)獨(dú)立的克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后委托北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。通過DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與TaTDRL序列進(jìn)行比對(duì)。

1. 2. 3 生物信息學(xué)分析 利用在線網(wǎng)站（FGENESH-HMM-baseg gene structure prediction）將TaTDR-Like翻譯為蛋白序列，利用在線工具ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn)。利用在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)TaTDR-Like蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);采用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)TaTDR-Like蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;kinasephos在線軟件進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)（http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/predict.php）;使用ClustalX對(duì)TaTDRL、OsTDR和AtAMS進(jìn)行多重序列比對(duì)獲得logo圖;使用MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析;使用在線工具ProtScale（http：//www.gravy-calculator.de/）預(yù)測(cè)親水性平均數(shù)（GRAVY）;在Plant-mPLoc網(wǎng)站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進(jìn)行TaTDR-Like的亞細(xì)胞定位分析。

1. 2. 4 啟動(dòng)子分析 從EnsemblPlants（http：//plants.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫中獲得上游2000 bp的TaTDRL啟動(dòng)子區(qū)域序列。使用PlantCARE（https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action=newplace）和NewPLACE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/web-tools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫分析TaTDR-Like啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)控元件。

1. 2. 5 熒光定量PCR 使用INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES網(wǎng)站（https：//sg.idtdna.com/Scitools/Applications/RealTimePCR/？tdsourcetag=s_pctim_aiomsg）根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1）。分別以不同組織、不同時(shí)期花藥cDNA為模板，以小麥TaActin為內(nèi)參基因，按照全式金熒光定量說明書建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及程序，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用 2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1. 2. 6 酵母雙雜自激活檢測(cè) 分別利用TaTDRL-D-BD-F/-R、（1～294）-BD-F/-R、（295～344）-BD-F/-R為引物擴(kuò)增TaTDRL-D的CDS全長（1～344）以及截取的N端（1～294）、bHLH結(jié)構(gòu)域（295～344），分別連接pGBKT7（酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ和SalⅠ）載體，測(cè)序正確后，將這些構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H。在SD/-Trp培養(yǎng)基挑選單克隆，將菌落稀釋100、10-1和10-2接種至SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基中再培養(yǎng)3 d。

1. 2. 7 亞細(xì)胞定位 以TaTDRL-D-EGFP-F/-R為引物擴(kuò)增TaTDRL-D與EGFP的融合序列。利用無縫克隆Mix（北京博邁德生物技術(shù)有限公司）構(gòu)建35S-TaTDRLD-EGFP融合載體，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，挑取PCR檢測(cè)正確的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，采用注射法將重懸農(nóng)桿菌侵染入本氏煙葉片中，48 h后將注射孔附近的葉片制作成玻片，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察本氏煙草表皮細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光信號(hào)，明確融合蛋白的定位情況。

2 結(jié)果與分析

2. 1 TaTDRL基因的克隆及序列分析結(jié)果

以小麥品種MF-XN1376為材料獲得cDNA第一鏈，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得TaTDRL-A（TraesCS6A02G071300.1）、TaTDRL-B（TraesCS6B02 G095600.1）和TaTDRL-D（TraesCS6D02G069300.1）3個(gè)同源拷貝基因片段，瓊脂糖凝膠電泳顯示與目標(biāo)條帶大小一致（圖1）。對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序和分析，結(jié)果顯示TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D其完整的CDS長度分別為1653、1662和1674 bp，分別編碼550、553和557個(gè)氨基酸。對(duì)TaTDR-Like進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)（圖2），發(fā)現(xiàn)TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D基因全長分別為2153、2059和2150 bp，其中TaTDRL-A的基因結(jié)構(gòu)含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，5'和3'未翻譯區(qū)域（UTRs）分別為301和199 bp;TaTDRL-B的基因結(jié)構(gòu)含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，5'和3'未翻譯區(qū)域（UTRs）分別為130和267 bp;TaTDRL-D的基因結(jié)構(gòu)含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，5'和3'未翻譯區(qū)域（UTRs）分別為251和225 bp。

2. 2 TaTDRL蛋白的生物學(xué)分析結(jié)果

利用在線網(wǎng)站ExPASy預(yù)測(cè)TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D蛋白分子量分別為58.50、58.90和59.21 kD，等電點(diǎn)（pI）分別為4.77、4.66和4.63。SMART在線軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D均在C端含有1個(gè)bHLH保守結(jié)構(gòu)域，分別跨越288～337、291～340和295～344 個(gè)氨基酸（圖3-A、3-B和3-C）。利用SOPMA對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示TaTDRL-A含有35.82%的α-螺旋、49.64%的隨機(jī)螺旋、11.09%的延伸鏈和3.45%的β-轉(zhuǎn)角。TaTDRL-B蛋白含有35.08%的α-螺旋、49.91%的隨機(jī)螺旋、10.13%的延伸鏈和4.88%的β-轉(zhuǎn)角。TaTDRL-D蛋白含有36.62%的α-螺旋、50.09%的隨機(jī)螺旋、9.16%的延伸鏈和4.13%的β-螺旋。ExPASy和Protscale在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D的GRAVY值分別為 -0.472、 -0.513和-0.495，均為親水蛋白。利用在線軟件kina-sephos進(jìn)行磷酸化分析，結(jié)果表明TaTDR-Like蛋白含有較多磷酸化位點(diǎn)，其中TaTDRL-A有3種類型共10個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包含8個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖3-D）;TaTDRL-B有2種類型共11個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包含10個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖3-E）;TaTDRL-D有2種共8個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包含7個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖3-F）。

為進(jìn)一步分析TaTDRL基因功能，對(duì)TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D蛋白進(jìn)行在線BLASTp分析（圖4），結(jié)果表明，TaTDR-Like 3個(gè)同源拷貝間蛋白同源性較高，保守結(jié)構(gòu)域基本相同，其中TaTDRL-A與TaTDRL-B的保守結(jié)構(gòu)域相似度達(dá)100%，與TaTDRL-D的保守結(jié)構(gòu)域相似度為96%，TaTDRL-D與OsTDR、AtAMS保守結(jié)構(gòu)域相似度分別為98%和88%。與其他植物同源蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TaTDR-Like結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子AtAMS及OsTDR相似。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5），其中AtPIF1（AT2G20180）屬于外源基因，是光敏色素作用因子（Qiu et al.，2020），結(jié)果表明TaTDR-Like同源基因聚類為同一簇，與AtPIF1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。TaTDR-Like與大麥TDR（KAE8787147.1）進(jìn)化親緣關(guān)系最近，與二穗短柄草TDR（XP_014756384）、OsTDR和AtAMS親緣關(guān)系較近。表明TaTDR-Like蛋白序列在進(jìn)化上具有較高的保守性。

2. 3 TaTDR-Like基因啟動(dòng)子分析結(jié)果

對(duì)TaTDR-Like基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明在TaTDRL基因啟動(dòng)子上包含若干順式作用元件，包括參與植物激素響應(yīng)元件、非生物應(yīng)激反應(yīng)和光響應(yīng)的順式作用元件。對(duì)具有相同或類似功能的不同順式作用元件進(jìn)行分類和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖6。TaTDR-Like基因啟動(dòng)子序列含有較多的光響應(yīng)元件，共計(jì)11種類型19個(gè)，并且不同成員的光反應(yīng)元件種類和數(shù)量各不相同，其中TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D的光反應(yīng)元件數(shù)量分別為7、2和10個(gè)，說明不同染色體組的TaTDR-Like基因?qū)獾捻憫?yīng)程度可能不同。同時(shí)，TaTDR-Like基因啟動(dòng)子序列含有許多激素響應(yīng)元件，包括脫落酸、生長素、赤霉素和茉莉酸甲酯等順式作用元件，并且不同染色體組均含有脫落酸和茉莉酸甲酯的順式作用元件，其中TaTDRL-A缺少赤霉素響應(yīng)元件，TaTDRL-B缺少生長素響應(yīng)元件。表明TaTDR-Like基因的表達(dá)調(diào)控可能受多種激素調(diào)控，并且不同組成員間可能具有相互補(bǔ)充和促進(jìn)作用。此外，對(duì)TaTDR-Like基因啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)含有較多不同類型的逆境響應(yīng)元件，如厭氧誘導(dǎo)ARE、低溫響應(yīng)元件LTR及干旱相關(guān)的元件MBS等，說明該基因可能響應(yīng)了多種逆境脅迫。綜合分析發(fā)現(xiàn)，小麥TaTDR-Like基因可能在植物生長發(fā)育及逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。

2. 4 TaTDR-Like基因的表達(dá)模式分析結(jié)果

為分析TaTDR-Like基因在小麥不同組織中的表達(dá)模式，以小麥品種MF-XN1376的花藥、莖、葉、子房和幼穗cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果（圖7）表明，TaTDRL在各組織內(nèi)均有表達(dá)，但表達(dá)量存在明顯差異，其中，TaTDRL-A在幼穗表達(dá)量最高，在花藥和葉中表達(dá)量較高，在子房中表達(dá)最低;TaTDRL-B在幼穗表達(dá)量最高，在其他組織中表達(dá)量無明顯差異;TaTDRL-D在花藥中的表達(dá)量最高，在其他組織中表達(dá)量均較低。說明TaTDRL可能參與花藥的發(fā)育，而TaTDRL-D在花藥中高表達(dá)，推測(cè)TaTDRL-D在參與花藥發(fā)育方面起主要作用。

為進(jìn)一步探究TaTDRL-D是否影響花藥育性，分別以可育材料MF-XN137和遺傳型不育材料CMS-XN1376花藥的單核早期、單核晚期、二核期及三核期的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果（圖8）表明，TaTDRL-D在單核早期中的表達(dá)量最高，但MF-XN1376與CMS-XN1376間無明顯差異;之后表達(dá)量逐漸降低，在可育和不育材料間呈現(xiàn)表達(dá)量差異，并且不育材料CMS-XN1376始終高于可育材料MF-XN1376。

2. 5 自激活檢測(cè)結(jié)果

為研究TaTDRL-D是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，分別截取TaTDR-Like的CDS以及N端（1～294）、bHLH結(jié)構(gòu)域（295～344）3個(gè)區(qū)段，并被融合到GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（GAL4-BD）上，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2H中，結(jié)果顯示TaTDRL-BD載體和N端-BD載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中可檢測(cè)到報(bào)告基因HIS3和ADE2的表達(dá)，表明TaTDRL-D具有轉(zhuǎn)錄激活活性（圖9）。

2. 6 亞細(xì)胞定位

使用在線軟件預(yù)測(cè)TaTDRL-D定位于細(xì)胞核。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將35S-TaTDRLD-EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到煙草葉片表皮細(xì)胞中，瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果（圖10）顯示空載信號(hào)飽滿，細(xì)胞膜和細(xì)胞核均有表達(dá)，而融合蛋白TaTDRLD-EGFP定位在細(xì)胞核中，與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

絨氈層細(xì)胞作為一種營養(yǎng)組織，與發(fā)育中的配子體直接接觸，減數(shù)分裂后PCD促進(jìn)絨氈層解體被認(rèn)為是小孢子形成、釋放和隨后花粉成熟的物質(zhì)信號(hào)，絨氈層提前或推遲降解導(dǎo)致小孢子發(fā)育異常，最終引起雄性不育（于世霞，2017）。前人研究表明AMS轉(zhuǎn)錄因子屬于典型的bHLH基因的MYC亞家族，可直接與花粉外壁發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子相結(jié)合（Anna et al.，2003）。已有研究表明，在擬南芥中AMS基因是孢粉素合成、分泌和花粉壁形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，ams突變體表現(xiàn)為孢子體隱性雄性不育，純合突變植株完全沒有成熟花粉，敗育的主要原因是絨氈層過早降解引起小孢子退化，并伴隨著雄蕊花絲變短現(xiàn)象（Alison et al.，2017）。水稻OsTDR基因?qū)儆贏MS的同源基因，該基因優(yōu)先在絨氈層表達(dá)，促進(jìn)絨氈層PCD（Li et al.，2006）。AMS同源基因在辣椒、洋蔥和瓜類等植物上被證實(shí)與絨氈層發(fā)育有關(guān)（Sheng et al.，2017;Guo et al.，2018;袁巧玲，2019）。綜上所見，TDR轉(zhuǎn)錄因子在絨氈層的發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，但在小麥上未見相關(guān)報(bào)道。本研究從西農(nóng)1376中克隆得到小麥TaTDR-Like基因，發(fā)現(xiàn)具有3個(gè)同源拷貝，分別命名為TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)TaTDR-Like的同源拷貝均含有1個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域。序列分析結(jié)果表明TaTDR-Like保守結(jié)構(gòu)域與OsTDR及AtAMS結(jié)構(gòu)域序列高度同源，其中TaTDRL-A與TaTDRL-B的保守結(jié)構(gòu)域相似度達(dá)100%，與TaTDRL-D保守結(jié)構(gòu)域的相似度為96%，TaTDRL-D與OsTDR、AtAMS保守結(jié)構(gòu)域相似度分別為98%和88%，推測(cè)TaTDR-Like與OsTDR、AtAMS具有相似的生理功能。此外，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示TaTDR-Like蛋白與OsTDR、大麥（AKE8787147）的進(jìn)化關(guān)系較密切，同時(shí)TDR與其他物種的同源蛋白聚類為一簇，與AtPIF1（外源基因）聚類遠(yuǎn)，諸多研究證實(shí)TDR與花粉外壁的合成和絨氈層降解有關(guān)（Li et al.，2006;Zhang et al.，2008;Xu et al.，2014;Guo et al.，2018;袁巧玲，2019），表明TDR功能十分保守，可能在物種分化之前就具有調(diào)控花藥發(fā)育的相關(guān)功能。亞細(xì)胞定位顯示TaTDRL-D蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)并證明其具有轉(zhuǎn)錄激活活性，說明其具有轉(zhuǎn)錄因子的基本特性，為后續(xù)進(jìn)一步尋找下游靶基因打下基礎(chǔ)。

啟動(dòng)子分析結(jié)果表明，TaTDR-Like基因啟動(dòng)子上游有較多激素響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件，推測(cè)TaTDR-Like基因在植物生長發(fā)育及逆境響應(yīng)過程中可能發(fā)揮重要作用。由于不同的同源拷貝間順式作用元件的類型和數(shù)量各異，推測(cè)由于小麥基因組龐大且復(fù)雜，不同的同源拷貝間可能存在相互補(bǔ)充或促進(jìn)作用。在擬南芥上有研究發(fā)現(xiàn)CLAVATA3/ESR-RELATED19（CLE19）小肽負(fù)調(diào)控AMS基因的表達(dá)，這種細(xì)胞外配體及其受體樣蛋白激酶（RLK）介導(dǎo)的信號(hào)通路在花藥發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用（Wang et al.，2017）。本研究在TaTDR-Like蛋白上預(yù)測(cè)到較多的磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)TaTDR-Like蛋白可能與某種激酶互作并受該激酶磷酸化，從而影響TaTDR-Like的功能。

本研究通過組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)TaTDR-Like基因在不同組織中表達(dá)量差異明顯，TaTDRL-A和TaTDRL-B在花藥幾乎不表達(dá)，而TaTDRL-D在花藥表達(dá)量最高，說明TaTDRL-D可能參與花藥發(fā)育過程，并起著重要作用。進(jìn)一步驗(yàn)證TaTDRL-D在花藥各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)TaTDRL-D在可育材料MF-XN1376和遺傳型不育CMS-XN1376的單核晚期開始出現(xiàn)表達(dá)量的差異，之后逐漸降低，三核期表達(dá)量最低，且不育材料CMS-XN1376表達(dá)量高于可育材料MF-XN1376。前人研究發(fā)現(xiàn)AMS和TDR基因在花藥發(fā)育早期表達(dá)量達(dá)到峰值并起作用，之后逐漸減?。‵u et al.，2014;Alison et al.，2017），TaTDRL-D同樣驗(yàn)證了這一趨勢(shì)。有研究表明遺傳性雄性不育CMS-XN1376在單核晚期開始出現(xiàn)敗育，三核期敗育完全（Wang et al.，2015），敗育時(shí)期與本研究TaTDRL-D表達(dá)量差異相吻合，這些結(jié)果均證明TaTDRL-D基因可能影響小孢子的育性，而關(guān)于TaTDRL-D在小麥花藥發(fā)育中的作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

TaTDRL-D基因可能參與小麥花藥發(fā)育，負(fù)調(diào)控花藥育性。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）