韋克蘇 涂永高 張念 瞿永生 湯朝起 武圣江 姚晶 李德侖 沈晗

摘要：設(shè)置3個采收成熟度（尚熟、成熟、完熟）處理，對烘烤過程煙葉葉綠素和類胡蘿卜素降解規(guī)律、抗氧化酶活性和相對電導(dǎo)率的變化進(jìn)行系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，（1）各個色素組分降解主要發(fā)生在變黃中后期（24～72 h），色素降解速率和煙葉變黃速率隨著成熟度的提高而提高;（2）煙葉丙二醛（MDA）含量隨烘烤進(jìn)程逐漸升高，在72 h時達(dá)到峰值，成熟煙葉中的MDA含量低于尚熟和完熟煙葉處理;（3）不同處理煙葉抗氧化酶[過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）]活性均在隨烘烤進(jìn)程呈先升高后降低的趨勢，且活性在變黃期達(dá)到峰值，成熟處理煙葉中的POD、T-SOD、CAT活性均表現(xiàn)出較高水平;（4）不同處理煙葉相對電導(dǎo)率隨烘烤進(jìn)程逐漸上升，完熟煙葉的相對電導(dǎo)率顯著高于尚熟和成熟煙葉，定色中后期煙葉相對電導(dǎo)率明顯增大，以成熟處理煙葉相對電導(dǎo)率最小。成熟煙葉的色素降解比例較大，MDA含量較低，抗氧化酶活性較高，相對電導(dǎo)率較低，說明成熟煙葉細(xì)胞膜的完整性更好，有利于煙葉細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)的生理生化轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：烤煙;成熟度;色素降解;抗氧化系統(tǒng);相對電導(dǎo)率

中圖分類號： TS44+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0176-05

調(diào)制過程是煙葉品質(zhì)形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，煙葉在大田生育期的質(zhì)量和品質(zhì)特征，必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼{(diào)制過程才能充分彰顯，形成符合卷煙配方要求的品質(zhì)性狀[1-2]。采收成熟度是煙葉調(diào)制工藝設(shè)定和調(diào)制品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素之一，也是決定烤后煙葉經(jīng)濟效益和產(chǎn)品質(zhì)量的重要影響因素，是煙葉質(zhì)量的核心[3]。大量研究已經(jīng)證實，采收成熟度適宜的煙葉，經(jīng)過調(diào)制之后物質(zhì)轉(zhuǎn)化充分、化學(xué)成分協(xié)調(diào)、感官評吸質(zhì)量佳，煙葉經(jīng)濟性狀和品質(zhì)可用性較好[1，4-5]。調(diào)制后煙葉的化學(xué)物質(zhì)能否充分轉(zhuǎn)化與其體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性密切相關(guān)，而細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性在很大程度上與膜脂過氧化水平、膜系統(tǒng)中的酶活性有關(guān)[6-7]。已有研究大多關(guān)注于采收成熟度對煙葉理化品質(zhì)差異及協(xié)調(diào)性、感官評吸質(zhì)量的優(yōu)劣等方面[2，4-5]，而針對調(diào)制過程中煙葉細(xì)胞衰老程度和細(xì)胞膜透性、抗氧化酶系統(tǒng)動態(tài)變化模式的系統(tǒng)分析鮮見報道。本試驗對煙葉成熟衰老進(jìn)程關(guān)鍵色素指標(biāo)含量、主要抗氧化酶活性、細(xì)胞膜相對透性的變化規(guī)律進(jìn)行較系統(tǒng)的剖析，以期為煙葉成熟采烤技術(shù)的優(yōu)化提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年在貴州省煙草科學(xué)研究院平壩天馬試驗基地進(jìn)行。供試材料為主栽烤煙品種云87，于2019年2月15日完成播種，并于2019年4月27日完成煙苗移栽，田間管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)管理進(jìn)行，2019年8月中旬按照試驗處理采收中部煙葉烘烤。

1.2 試驗設(shè)計

試驗按照成熟度共設(shè)3個處理（尚熟、成熟、完熟）。煙葉成熟度劃分如下：尚熟標(biāo)準(zhǔn)為葉面淡綠色，葉片較平展，主脈發(fā)白，支脈淡綠色，絨毛部分脫落;成熟煙葉標(biāo)準(zhǔn)為葉面綠黃色，主脈全白、發(fā)亮，支脈2/3變白，絨毛脫落，葉尖下垂;完熟煙葉標(biāo)準(zhǔn)為葉面淺黃色或寡白，主脈支脈全白、發(fā)亮，葉面有明顯的黃斑，葉尖葉邊枯焦[2]。

試驗采用符合國煙辦綜[2009]418號《國家煙草專賣局辦公室關(guān)于印發(fā)烤房設(shè)備招標(biāo)采購管理辦法和密集烤房技術(shù)規(guī)范（試行）修訂版的通知》烤房規(guī)格的密集烤房，采用掛竿裝煙烘烤，裝煙密度控制為70～75 kg/m3，按照三段式烘烤工藝進(jìn)行烘烤。

1.3 樣品制備

取樣時間分別為烤前0 h（鮮樣）、烤中12 h、烤中24 h、烤中48 h、烤中72 h、烤中96 h，每次取20張煙葉樣品，評估煙葉變黃程度后，切去煙葉尖部、基部和主脈，用半葉法將樣品分為2份，一份用于測定葉綠素和相對電導(dǎo)率，另一份迅速放入液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于檢測酶活性，每個處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 煙葉顏色變化判定及色素組分測定 煙葉外觀顏色變化統(tǒng)計取不同烘烤階段煙葉20張，人工統(tǒng)計按照變黃部分占整張煙葉比例;色素組分測定采用95%乙醇提取，分別測定665、649、470 nm下的吸光度并按照公式計算各個組分含量[8]。

1.4.2 煙葉丙二醛含量及抗氧化酶活性測定 丙二醛（MDA）含量采用雙組分光光度計法測定，總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法測定，過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法，過氧化氫酶（CAT）酶活性測定采用紫外分光光度法[8]。

1.4.3 煙葉相對電導(dǎo)率測定 相對電導(dǎo)率采用抽氣法進(jìn)行測定[9]，分別測定抽濾后25 ℃的電導(dǎo)率（T1）、煮沸10 min后再次冷卻回到25 ℃的電導(dǎo)率（T2），并計算相對電導(dǎo)率，相對電導(dǎo)率=（T1/T2）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均用Excel 2007和SPSS 19.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤過程煙葉外觀顏色變化分析

如表1所示，不同成熟度煙葉的變黃程度隨烘烤進(jìn)程逐漸提高，煙葉變黃比例因成熟度處理呈現(xiàn)較大差異，隨著成熟度的提高，煙葉變黃比例提升加快，同一烘烤時間煙葉變黃比例表現(xiàn)為完熟煙葉>成熟煙葉>尚熟煙葉。烘烤12 h時，尚熟煙葉變黃比例低于5%，而成熟煙葉和完熟煙葉變黃比例分別達(dá)到5%～10%、10%～15%。在變黃后期（72 h）時，尚熟煙葉大部分變黃，變黃比例達(dá)75%～90%;成熟煙葉基本全黃，變黃比例為 90%～100%;而完熟煙葉則全部變黃，變黃比例為100%。

2.2 烘烤過程煙葉色素降解分析

如表2所示，煙葉色素組分隨著烘烤進(jìn)程逐漸分解，各個組分含量隨烘烤進(jìn)程逐漸降低。從不同烘烤階段煙葉色素組分降解量來看，在變黃中期至變黃后期（24～72 h）各個煙葉色素組分降解量均最大，該階段不同成熟度處理煙葉總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的降解比例分別達(dá)到64.77%～71.83%、69.11%～80.81%、71.85%～80.51%、60.65%～68.54%，其中尚熟煙葉色素組分在烘烤48～72 h期間的降解量最大，而成熟煙葉和完熟煙葉各個色素組分在烘烤24～48 h期間的降解量最大，隨著采收成熟度的提高，煙葉色素組分的降解速率逐漸提高。對比不同處理煙葉類胡蘿卜素隨烘烤進(jìn)程的降解規(guī)律發(fā)現(xiàn)，成熟煙葉類胡蘿卜素降解量最大，烘烤96 h時的降解量達(dá)到0.144 mg/g，降解比例高達(dá)80.90%，降解量和降解比例均高于其他2個處理。從不同處理總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量比值隨烘烤進(jìn)程的變化規(guī)律可知，總?cè)~綠素含量和類胡蘿卜素含量比值隨烘烤進(jìn)程逐漸降低，這說明總?cè)~綠素的降解速率大于類胡蘿卜素，隨著烘烤進(jìn)程的推進(jìn)，類胡蘿卜素在色素里面占的比例增大，煙葉顏色也逐漸由綠色轉(zhuǎn)為黃色。

2.3 烘烤過程煙葉抗氧化系統(tǒng)分析

2.3.1 烘烤過程中成熟度對煙葉MDA含量的影響 如圖1所示，煙葉中的MDA含量隨烘烤進(jìn)程的變化呈先升高后降低的趨勢，在烘烤 72 h 時 MDA含量出現(xiàn)峰值。在烘烤變黃中期（48 h）煙葉中的MDA含量在該階段變化趨勢因成熟度差異不明顯，完熟煙葉中MDA含量略低于尚熟煙葉和成熟煙葉。在變黃末期和定色前期（72 h），煙葉中的MDA含量急劇上升，且因成熟度呈現(xiàn)較大差異，表現(xiàn)為完熟煙葉>尚熟煙葉>成熟煙葉?？芍婵具^程中成熟煙葉MDA含量增長速率較慢，且變化趨勢相對于尚熟、完熟煙葉更穩(wěn)定，這可能與成熟煙葉較尚熟煙葉和完熟煙葉具有更強的抗逆性有關(guān)。

2.3.2 烘烤過程中成熟度對煙葉POD活性的影響 如圖2所示，煙葉中的POD活性在烘烤開始后即迅速上升，在變黃初期（12 h）至變黃中后期（48 h）基本呈一個高活性的平臺期，隨后POD活性急劇下降。在烘烤的不同階段，煙葉中POD活性因成熟度處理而呈現(xiàn)較大差異，成熟煙葉POD在12～48 h階段保持在較高的活性水平，高于同時期的尚熟和完熟煙葉，72 h之后隨烘烤進(jìn)程急劇降低。可知，成熟煙葉POD活性水平在變黃定色關(guān)鍵階段（12～24 h）均高于尚熟和完熟煙葉，這可能與該階段成熟煙葉中的細(xì)胞完整性有關(guān)。

2.3.3 烘烤過程中成熟度對煙葉總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的影響 如圖3所示，煙葉中的總超氧化物歧化酶隨烘烤進(jìn)程呈先升高后降低的單峰變化趨勢，但不同煙葉T-SOD活性峰值出現(xiàn)的階段不同，由先到后分別是成熟煙葉（12 h）、尚熟煙葉（24 h）、完熟煙葉（48 h），這表明成熟煙葉中的T-SOD對烘烤逆境的響應(yīng)最快，可以最快地保護(hù)細(xì)胞的完整性。煙葉中的T-SOD活性峰值表現(xiàn)為成熟煙葉（167.60 U/mg）>完熟煙葉（155.72 U/mg）>尚熟煙葉（143.72 U/mg），也表明了成熟煙葉T-SOD對煙葉細(xì)胞完整性的保護(hù)能力大于其他2個處理煙葉。

2.3.4 烘烤過程中成熟度對煙葉CAT活性的影響 如圖4所示，烘烤過程中3種煙葉CAT活性動態(tài)變化均呈單峰模式，不同成熟度煙葉的CAT活性在烘烤開始后均呈上升趨勢，且CAT活性在變黃中期（24 h）達(dá)到峰值，其中尚熟和成熟煙葉CAT活性的峰值分別達(dá)到21.90、20.35 U/mg，遠(yuǎn)高于完熟煙葉的CAT活性;隨后急劇降低，至定色后期（96 h）CAT活性大幅度降低。綜上所述，在煙葉變黃期，成熟和尚熟煙葉中的CAT活性遠(yuǎn)高于完熟煙葉。

2.4 烘烤過程中成熟度對煙葉相對電導(dǎo)率的影響

如表3所示，不同成熟度煙葉相對電導(dǎo)率隨烘烤時間逐漸升高，完熟煙葉的相對電導(dǎo)率顯著高于尚熟和成熟煙葉;而在烘烤0～72 h，尚熟煙葉的相對電導(dǎo)率略高于成熟煙葉，但差異不顯著。在定色后期（96 h），不同成熟度煙葉相對電導(dǎo)率均有顯著性差異，由高至低分別為完熟煙葉（68.53%）、尚熟煙葉（57.27%）、成熟煙葉（46.72%），表明該階段煙葉細(xì)胞膜完整性已經(jīng)被嚴(yán)重破壞。

3 討論

煙葉烘烤調(diào)制環(huán)節(jié)的實質(zhì)是給煙葉施加了逆境環(huán)境，加快了煙葉的成熟衰老進(jìn)程，加速煙葉內(nèi)在物質(zhì)轉(zhuǎn)化速率，促使煙葉凋萎、變黃、干燥[1-2]。在逆境條件下，組織有序的代謝規(guī)律發(fā)生障礙，活性氧含量大幅度增加，高水平含量的活性氧易引起植物細(xì)胞膜脂過氧化及大分子蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞或蛋白質(zhì)變性，引起膜結(jié)構(gòu)的變化及電解質(zhì)外滲[6-7，10-11]。烘烤過程中煙葉細(xì)胞的膜脂過氧化水平代表了煙葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的受破壞程度，說明了煙葉細(xì)胞生理機能的穩(wěn)定性，對煙葉物質(zhì)轉(zhuǎn)化和香氣形成具有直接的影響[6，12]。生物膜與植物抗性關(guān)系密切，MDA含量可以間接說明細(xì)胞膜系統(tǒng)受損的程度[10]。本研究中，丙二醛含量隨著烘烤進(jìn)程而逐漸升高，表明細(xì)胞膜受損程度隨著烘烤時間而加劇，而成熟煙葉中MDA含量的增長速率比尚熟煙葉和完熟煙葉慢，這與宮長榮等的研究結(jié)果[6，13]相符，說明烘烤過程中成熟煙葉細(xì)胞膜受損程度低于尚熟和完熟煙葉。作為煙葉體內(nèi)活性氧的清除過程中酶促反應(yīng)體系的主要催化酶，POD、SOD、CAT可以有效清除活性氧，它們的活性水平也基本決定了膜脂過氧化反應(yīng)的程度[6-7]。本研究結(jié)果表明，POD、SOD、CAT活性峰值基本都出現(xiàn)在煙葉的變黃階段（12～72 h），盡管不同抗氧化酶活性隨烘烤進(jìn)程的變化情況因成熟度處理有所差異，但總體表現(xiàn)為成熟處理煙葉中的抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性均不同程度高于尚熟煙葉和完熟煙葉，這與王傳義等認(rèn)為成熟度適宜（成熟）煙葉中SOD、POD活性高于成熟度偏低（尚熟）煙葉的結(jié)論[14]相符。烘烤過程中成熟煙葉能保持相對較穩(wěn)定的活性狀態(tài)，有利于清除細(xì)胞中的自由基和活性氧，減少對細(xì)胞完整性的傷害，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。

相對電導(dǎo)率也是衡量植物組織細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，相對電導(dǎo)率越高，表示電解質(zhì)的滲漏量越多，細(xì)胞膜完整性遭到破壞的程度就越大[8-9，15]。本研究發(fā)現(xiàn)烘烤階段煙葉相對電導(dǎo)率隨著烘烤進(jìn)程而逐漸升高，在變黃階段，成熟和尚熟處理煙葉相對電導(dǎo)率顯著低于完熟煙葉，說明成熟和尚熟處理煙葉在變黃期電解質(zhì)外滲程度不大，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性沒有受到嚴(yán)重破壞，利于細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)轉(zhuǎn)化;而在定色后期（96 h），不同成熟度煙葉相對電導(dǎo)率均達(dá)顯著性差異，說明該階段煙葉細(xì)胞膜完整性已經(jīng)被嚴(yán)重破壞。烘烤過程中不同成熟度煙葉細(xì)胞膜完整性的研究結(jié)論也可由色素物質(zhì)的降解速率和降解量來佐證，研究結(jié)果表明，不同成熟度處理煙葉色素組分含量均隨烘烤進(jìn)程逐漸降低，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的降解速率均隨著采收成熟度的提高而提高，同樣的，煙葉變黃速率也因成熟度而提高。就類胡蘿卜素而言，成熟煙葉中的類胡蘿卜素降解量最大，降解比例高達(dá)80.90%，高于尚熟煙葉和完熟煙葉，這與前人的研究結(jié)論[16-18]一致，這說明了煙葉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性可為其內(nèi)部的生理生化反應(yīng)提供有利條件。

本研究從烘烤過程中抗氧化酶系統(tǒng)和相對電導(dǎo)率的動態(tài)變化規(guī)律，分析研究了不同成熟度處理煙葉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)隨烘烤進(jìn)程的完整性和受損傷程度，再結(jié)合生產(chǎn)中煙葉烘烤進(jìn)程中顏色的判斷方法，輔以煙葉色素組分的降解速率和降解量的定量研究，結(jié)果表明成熟處理煙葉的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)隨烘烤進(jìn)程的受損傷程度略輕于尚熟和完熟煙葉處理，這也可以從不同處理煙葉色素組分的降解速率和降解量方面得到佐證，再次證實了煙葉采收成熟度對煙葉烘烤品質(zhì)的重要作用。然而，密集烘烤中不同成熟度煙葉品質(zhì)的形成除了與煙葉中色素組分降解有關(guān)外，還與各種成熟度煙葉的物理性狀、常規(guī)理化物質(zhì)和致香物質(zhì)轉(zhuǎn)化積累規(guī)律等密切相關(guān)[1-3，5]。為更好地了解密集烘烤中成熟度對煙葉品質(zhì)形成的影響及機制，還須進(jìn)行更深入而全面的研究和解析。

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