劉青濤 盧鳳英 汪愛芬 尹秀鳳 朱秀同 何平有 趙玉龍 朱曉瑋 薛家賓 張小飛

摘要：為提高雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的耐熱性能，根據(jù)前期研究設(shè)計(jì)了3個(gè)耐熱保護(hù)劑配方，比較不同配方對疫苗的抗原凍干損失、溫度耐受性和保存期的影響。結(jié)果顯示，保護(hù)劑TS11、TS37、TS51所制備疫苗的抗原凍干損失均在0.5 lg以下，相互之間差異不明顯。但TS37所制備疫苗在37 ℃和45 ℃耐受后的抗原效價(jià)下降滴度明顯低于TS11和TS51，這說明TS37具有更好的耐熱保護(hù)效果。另外，25 ℃、2～8 ℃保存試驗(yàn)顯示，配方TS37可使疫苗在室溫下至少能保存1個(gè)月、冷藏條件下至少保存27個(gè)月而抗原含量和攻毒保護(hù)仍能達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。因此，本試驗(yàn)研制成功針對雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的耐熱保護(hù)劑TS37，該保護(hù)劑可使疫苗實(shí)現(xiàn)2～8 ℃下長期保存。

關(guān)鍵詞：耐熱保護(hù)劑;雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗;保存效果

中圖分類號：S852.5 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0152-05

雞新城疫和傳染性支氣管炎是危害我國養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病[1]。雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota+H120株）是目前應(yīng)用最廣的雞用活疫苗，在預(yù)防雞新城疫和傳染性支氣管炎中發(fā)揮了重要作用[2]。但目前國內(nèi)該疫苗的生產(chǎn)采用以脫脂奶粉和蔗糖為主要成分的常規(guī)凍干保護(hù)劑，疫苗必須在-15 ℃以下冷凍保存[3]，在儲存、運(yùn)輸和使用過程中對冷鏈的要求高，在臨床上常常發(fā)生由于達(dá)不到冷鏈要求所導(dǎo)致的疫苗免疫失敗[4]，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。而發(fā)達(dá)國家生產(chǎn)活疫苗普遍采用耐熱保護(hù)劑技術(shù)，疫苗只需在2～8 ℃保存，這方便了疫苗的保存和運(yùn)輸[5-6]。

耐熱保護(hù)劑技術(shù)是高品質(zhì)獸用活疫苗制造的關(guān)鍵工藝技術(shù)，發(fā)達(dá)國家早在20世紀(jì)80年代就對該技術(shù)進(jìn)行了研究，并且僅被少數(shù)跨國巨頭企業(yè)掌握，一直處于保密狀態(tài)[7-8]。雖然我們國家的獸用生物制品廠也對該技術(shù)進(jìn)行了大量研究，但是由于技術(shù)封鎖和起步較晚目前能用于規(guī)?；a(chǎn)的獸用耐熱保護(hù)劑活疫苗的種類還比較少[9]，特別是能用于雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota+H120株）規(guī)模化生產(chǎn)的耐熱保護(hù)劑技術(shù)仍然缺乏。為此，筆者于2005—2019年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所和兆豐華生物科技（南京）有限公司針對該疫苗進(jìn)行了耐熱保護(hù)劑研究，對耐熱保護(hù)劑對疫苗的溫度耐受性、保存期和免疫保護(hù)效果的影響進(jìn)行了評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 制苗與檢驗(yàn)用毒種 雞新城疫病毒（La Sota株）和傳染性支氣管炎病毒（H120株）制苗用雞胚液，雞新城疫病毒強(qiáng)毒（CVCC AV1611株），雞傳染性支氣管炎病毒強(qiáng)毒（M41株）;均由兆豐華生物科技（南京）有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 谷氨酸鈉，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;聚乙烯吡咯烷酮、明膠、蔗糖等，購自Sigma公司。

1.1.3 雞胚與實(shí)驗(yàn)動物 SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司;SPF雞由SPF雞胚孵化，在隔離器內(nèi)飼養(yǎng)至21日齡用于試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 耐熱保護(hù)劑疫苗的制備 在前期篩選的基礎(chǔ)上，用谷氨酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、蔗糖等基質(zhì)，通過自主開發(fā)的“獸用疫苗耐熱保護(hù)劑配方設(shè)計(jì)軟件”獲得TS11、TS37、TS51這3個(gè)保護(hù)劑配方。每個(gè)配方均有A、B這2個(gè)部分組成，A部分主要為不耐熱基質(zhì)，過濾除菌;B部分由耐熱基質(zhì)組成，高壓滅菌;A和B按體積比1 ∶ 4混合即為耐熱保護(hù)劑。耐熱保護(hù)劑與雞新城疫病毒La Sota株雞胚液、雞傳染性支氣管炎病毒H120株雞胚液按體積比 1 ∶ 1 ∶ 1 進(jìn)行混合，3 mL/瓶，分裝至7 mL西林瓶，進(jìn)行冷凍干燥。每個(gè)配方均制備3批疫苗，對疫苗的抗原凍干損失、溫度耐受性和保存期等進(jìn)行測定。

1.2.2 冷凍干燥效果檢驗(yàn) 按照《中國獸藥典》中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求對疫苗的外觀、真空度、剩余水分、純凈性、安全性和每羽份抗原含量進(jìn)行檢驗(yàn)和測定。

1.2.3 溫度耐受性評價(jià) 將疫苗置37 ℃ 7、10、15 d，45 ℃ 3、5 d后，觀察制品的外形并測定疫苗的抗原含量。

1.2.4 保存期測定 將疫苗置25 ℃ 30 d后進(jìn)行病毒含量測定，同時(shí)用雞進(jìn)行效力檢驗(yàn)。另外，將疫苗置2～8 ℃條件下保存，分別于3、6、9、12、18、24、27個(gè)月后取出，進(jìn)行病毒含量測定;其中保存24、27個(gè)月的疫苗，用雞進(jìn)行效力檢驗(yàn)。

1.2.4.1 雞新城疫部分雞效力檢驗(yàn)方法 采用30日齡的SPF雞15羽，其中10羽各滴鼻接種疫苗0.01羽份，5羽作為對照組，接種后14 d，每羽雞各肌肉注射雞新城疫病毒強(qiáng)毒104.0 ELD50，觀察 14 d，對照雞全部發(fā)病死亡，免疫雞至少保護(hù)9羽，則雞新城疫部分判為合格。

1.2.4.2 雞傳染性支氣管炎部分雞效力檢驗(yàn)方法 采用1～3日齡SPF雞10羽，每羽滴鼻接種疫苗1羽份，接種后10 d，連同對照雞10羽，用10倍稀釋的雞傳染性支氣管炎病毒強(qiáng)毒滴鼻，每羽1～2滴，觀察10 d，對照雞至少發(fā)病8羽，免疫雞至少保護(hù)8羽，則雞傳染性支氣管炎部分判為合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍干燥結(jié)果

根據(jù)《中國獸藥典》中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定對3種耐熱保護(hù)劑所制備疫苗的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定，由表1可知，3個(gè)保護(hù)劑配方所制備的9批疫苗的外形、剩余水分、真空度、純凈性和安全性檢驗(yàn)均合格。由圖1可知，3個(gè)保護(hù)劑配方所制備疫苗的抗原含量均達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求（新城疫抗原≥6.0 lg/羽份，傳染性支氣管炎抗原≥3.5 lg/羽份）[3]，不同保護(hù)劑所制備疫苗的抗原凍干損失差異不明顯，說明3種保護(hù)劑配方對雞新城疫和傳染性支氣管炎疫苗抗原均具有良好的冷凍干燥保護(hù)效果。

2.2 疫苗的溫度耐受性測定結(jié)果

為比較3個(gè)配方對疫苗的耐熱保護(hù)效果，將各批次疫苗分別置于37 ℃和45 ℃保存，保存一定時(shí)間后測定疫苗抗原效價(jià)，分析抗原損失情況。由表2可知，TS37所制備的雞新城疫疫苗在37 ℃ 保存 7 d 后抗原效價(jià)仍然能達(dá)到《中國獸藥典》中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求（≥6.0 lg/羽份），而TS11和TS51所制備疫苗在37 ℃保存7 d后抗原效價(jià)均下降到6.0 lg/羽份以下;而對于抗原損失的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（圖2）顯示，TS37所制備疫苗在37 ℃和45 ℃的抗原損失均顯著低于TS11和TS51所制備疫苗，這說明配方TS37對新城疫抗原的耐熱保護(hù)效果優(yōu)于TS11和TS51。由圖2、表3可知，TS37所制備雞傳染性支氣管炎疫苗在37 ℃和45 ℃的抗原損失均顯著低于TS11和TS51所制備疫苗，這說明配方TS37對傳染性支氣管炎抗原的耐熱保護(hù)效果也優(yōu)于TS11和TS51。

2.3 疫苗在25 ℃的保存試驗(yàn)結(jié)果

為比較不同耐熱保護(hù)劑配方在室溫條件下對疫苗抗原的保護(hù)效果，將疫苗置于25 ℃條件下保存 30 d，然后測定疫苗的抗原效價(jià)。結(jié)果（圖3）顯示，配方TS37所制備疫苗在25 ℃保存30 d雞新城疫與傳染性支氣管炎疫苗抗原的含量均在 6.0 lg/羽份和3.5 lg/羽份以上，而配方TS11和TS51所制備疫苗的2種抗原含量均下降至6.0 lg/羽份和3.5 lg/羽份以下，這進(jìn)一步說明配方TS37對雞新城疫與傳染性支氣管炎疫苗抗原的耐熱保護(hù)效果優(yōu)于TS11和TS51。

2.4 疫苗在2～8 ℃的保存試驗(yàn)結(jié)果

基于疫苗的耐熱效果評價(jià)結(jié)果，對配方TS37所凍干疫苗在2～8 ℃條件下的保存期進(jìn)行了測定。由圖4可知，疫苗在2～8 ℃條件下保存12個(gè)月雞新城疫抗原效價(jià)未下降，18個(gè)月后新城疫抗原效價(jià)雖然有所下降，但在保存27個(gè)月后疫苗抗原效價(jià)仍然高于6.0 lg/羽份。而對傳染性支氣管炎抗原的測定結(jié)果顯示，疫苗在2～8 ℃條件下保存27個(gè)月后，抗原效價(jià)仍然高于3.5 lg/羽份。以上結(jié)果說明， 配方TS37所凍干的疫苗在2～8 ℃條件下至少可以保存27個(gè)月。

2.5 疫苗的攻毒保護(hù)效果測定

為進(jìn)一步確定配方TS37在25 ℃和2～8 ℃條件下對疫苗的保護(hù)效果，對在25 ℃保存30 d和2～8 ℃保存24、27個(gè)月疫苗的免疫保護(hù)效果用攻毒試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。由表4可知，采用25 ℃保存30 d、2～8 ℃保存24、27個(gè)月的疫苗接種雞后可保護(hù)雞抵抗新城疫和傳染性支氣管炎病毒強(qiáng)毒株的攻擊。這進(jìn)一步說明，采用TS37所凍干疫苗在25 ℃至少可以保存30 d，在2～8 ℃至少可保存27個(gè)月。

3 討論

疫苗免疫是我國目前進(jìn)行動物疫病防控的最有效手段，疫苗質(zhì)量直接關(guān)系到我國動物疫病防控的效果[10]。但目前我國獸用疫苗企業(yè)所用的制造技術(shù)在先進(jìn)性上與發(fā)達(dá)國家還存在一定差距，特別是在獸用活疫苗耐熱保護(hù)劑技術(shù)上差距巨大[7-9]。目前能用于規(guī)?；a(chǎn)、推廣的耐熱保護(hù)劑活疫苗的種類并不多，并且主要集中在單苗，耐熱保護(hù)劑多聯(lián)活疫苗比較稀缺。對多個(gè)疫苗毒株能夠同時(shí)提供保護(hù)的耐熱保護(hù)劑一直是我國獸用疫苗制造行業(yè)難于突破的技術(shù)瓶頸。

本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了3個(gè)耐熱保護(hù)劑配方，并比較了3個(gè)配方對雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota+H120株）的耐熱保護(hù)效果。研究結(jié)果表明，配方TS11、TS37、TS51對雞新城疫、傳染性支氣管炎抗原均具有良好的凍干保護(hù)效果，凍干過程中的抗原損失均比較低。但是配方TS37所制備的疫苗在耐受高溫后的抗原效價(jià)下降滴度要明顯低于配方TS11、TS51，配方TS37具有更好的耐熱保護(hù)性能。另外，在25 ℃保存30 d TS37所制備疫苗的抗原效價(jià)仍然能達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，這說明該保護(hù)劑配方在室溫條件下對疫苗抗原具有很好的保護(hù)效果，這避免了疫苗在臨床應(yīng)用過程中的抗原損失，有效保證了疫苗的臨床應(yīng)用效果[10-11]。

活疫苗能夠快速誘發(fā)動物機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答[12-13]，并且可以選擇多種接種途徑（汽霧、飲水、滴鼻、點(diǎn)眼、注射等）進(jìn)行免疫[14-17]，因此在動物疫病防控中發(fā)揮了不可或缺的作用。但利用常規(guī)保護(hù)劑生產(chǎn)的傳統(tǒng)活疫苗必須在-15 ℃以下保存，對冷鏈的要求非常嚴(yán)格，這大大限制了活疫苗的應(yīng)用范圍，并且常常由于保存、運(yùn)輸不當(dāng)導(dǎo)致疫苗的抗原效價(jià)下降，從而引起免疫失敗和疫病的流行。而本研究通過溫度耐受性試驗(yàn)篩選出的配方TS37可以使雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗在2～8 ℃條件下的保存期達(dá)到27個(gè)月，這降低了疫苗在保存、運(yùn)輸過程中對于冷鏈的要求，可促進(jìn)獸用活疫苗的推廣利用，降低免疫失敗的發(fā)生率。另外，本研究中配方TS37所制備疫苗在37 ℃保存7～10 d，雞新城疫和傳染性支氣管炎抗原的效價(jià)下降均在1 lg之內(nèi)，因此我們可以把37 ℃保存7～10 d作為疫苗保存期的一個(gè)快速測定方法。

綜上所述，本研究中的耐熱保護(hù)劑TS37可提高雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗的耐熱性能，延長疫苗在室溫條件下的保存期，使疫苗實(shí)現(xiàn) 2～8 ℃條件下的長期保存，這減少了疫苗在運(yùn)輸、儲存、使用過程中的抗原損失，減少了疫苗免疫失敗的發(fā)生，具有良好的應(yīng)用前景。

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