蔣玥 衣服德 許華 李貴陽 卜仕金

摘要：為檢測(cè)鑒別雞白痢、腸炎、鼠傷寒、傷寒4種養(yǎng)禽業(yè)中常見的沙門氏菌血清型，利用每種血清型的特異基因位點(diǎn)，建立多重PCR（polymerase chain reaction）檢測(cè)方法，并通過試驗(yàn)對(duì)多重PCR法的特異性、靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，所建立的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，與非沙門氏菌無交叉反應(yīng)，靈敏度高。雞白痢沙門氏菌的最低檢測(cè)限度13.1 pg/mL，腸炎沙門氏菌最低檢測(cè)限度達(dá)12.5 pg/mL，鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌的最低檢測(cè)限度13.7 pg/mL，傷寒沙門氏菌最低檢測(cè)限度12.3 pg/mL。結(jié)果表明，此方法準(zhǔn)確可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高，有望成為以后檢測(cè)沙門氏菌的有效工具。

關(guān)鍵詞：雞白痢沙門氏菌;腸炎沙門氏菌;鼠傷寒沙門氏菌;傷寒沙門氏菌;多重PCR

中圖分類號(hào)： S852.61 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）13-0059-05

目前，已發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌血清型有2 000多種[1]。其中，雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌這幾種血清型的沙門氏菌在我國(guó)部分地區(qū)感染率較高[2]。有資料顯示這幾種血清型的沙門氏菌基因組相近[3]，想要檢測(cè)鑒別這幾種沙門氏菌血清型，可通過培養(yǎng)為前提的傳統(tǒng)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法[4]。傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括平板上鑒別培養(yǎng)[5]，生化檢測(cè)以及血清分型等[3]。這些方法雖然結(jié)果清晰、準(zhǔn)確，但是存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)[5]、特異性差、操作過程繁瑣等缺點(diǎn)，不適用于大批量的臨床樣本檢測(cè)[6]。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)PCR（polymeraze chain reaction）、恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、基因探針技術(shù)等，本試驗(yàn)用到的檢測(cè)技術(shù)是聚合酶反應(yīng)技術(shù)PCR中的多重PCR檢測(cè)技術(shù)[6]。

多重PCR檢測(cè)技術(shù)可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段，實(shí)現(xiàn)多通量的目的基因檢測(cè)。本研究用多重PCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)鑒別雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌4種養(yǎng)禽業(yè)中常見的沙門氏菌血清型。這個(gè)技術(shù)相比沙門氏菌傳統(tǒng)的檢測(cè)方法既快速、高效，也簡(jiǎn)單易操作[3-7]，并適用于規(guī)?；B(yǎng)殖中大量的樣本檢測(cè)。因此這個(gè)方法的建立能及時(shí)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)的沙門氏菌感染，為沙門氏菌的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

細(xì)菌基因組核酸提取試劑盒（GB50）及試驗(yàn)中所需的酶（IE-PME），均購(gòu)自青島英賽特生物科技有限公司，引物由青島生工生物科技有限公司合成。樣本主要包括：腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC（B）50071、鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14028、傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B）50071、雞白痢沙門氏菌陽性菌等（表1）。臨床樣品在2017年5月至2019年11月從山東各地采集，采集的沙門氏菌臨床樣品數(shù)為128份。

1.2 核酸模板提取

沙門氏菌的液體樣本用MH肉湯培養(yǎng)[8]。取 1 mL 菌液，按照基因組提取試劑盒的說明書，完成試驗(yàn)所需不同沙門氏菌基因組DNA提取。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與條件優(yōu)化 從GenBank獲取沙門氏菌的基因序列，利用Bioedit軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，具體的引物序列信息見表2。由表2可知，以提取的腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的基因組DNA作為模板，用對(duì)應(yīng)的引物檢測(cè)。首先用每對(duì)引物分別對(duì)每個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為MIX 12.5 μL，每對(duì)引物上下游各0.5 μL，模板各1.0 μL，ddH2O 4.5 μL（總體系25.0 μL）。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 變性10 s，64 ℃退火90 s，循環(huán)30次。根據(jù)目的基因擴(kuò)增結(jié)果，由表3可知，優(yōu)化多重反應(yīng)的引物濃度比例和溫度等條件，最終PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（121 V，20 min），每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 多重PCR特異性驗(yàn)證 用腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株、雞白痢沙門氏菌的陽性菌和金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、奇異變形桿菌、云南微球菌、副溶血弧菌基因組作為DNA模板，多重PCR反應(yīng)體系分別擴(kuò)增這幾種菌。PCR的反應(yīng)體系為：MIX 12.5 μL，腸炎沙門氏菌上下游引物各0.7 μL;雞白痢沙門氏菌上下游引物各0.7 μL;傷寒沙門氏菌上下游引物各 0.5 μL，鼠傷寒沙門氏菌上下游引物各0.6 μL，H2O 3.0 μL（總體系25.0 μL）;反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s，64 ℃退火90 s，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30個(gè)循環(huán)。

1.3.3 多重PCR靈敏性檢測(cè) ?對(duì)涉及的核酸基因組DNA，分別進(jìn)行10～106倍的梯度稀釋，將稀釋的核酸基因DNA放入配制好的多重PCR反應(yīng)體系，分析擴(kuò)增出的多重敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖，并分析得出方法的最低檢測(cè)限。

1.4 臨床樣本的應(yīng)用

將山東各地采集的128份沙門氏菌臨床樣本，接種到蛋白胨緩沖水中37 ℃培養(yǎng)24 h[5]。利用建好的多重PCR方法對(duì)128份沙門氏菌臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 多重PCR方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

采用單一PCR法對(duì)沙門氏菌臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，將得到的檢測(cè)結(jié)果與多重PCR法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，從而驗(yàn)證本試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重模板PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用相對(duì)應(yīng)的引物分別對(duì)4種沙門氏菌進(jìn)行擴(kuò)增。由圖1可知，擴(kuò)增后的DNA片段大小和預(yù)期結(jié)果完全一致，證明了各組引物對(duì)靶基因檢測(cè)的可行性。

2.2 多重PCR方法建立及條件優(yōu)化

在單重模板擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果的的基礎(chǔ)上，對(duì)多重PCR方法可行性進(jìn)行驗(yàn)證。由圖2可知，試驗(yàn)條帶與目的條帶大小一致，由此證明該方法對(duì)4種目的基因檢測(cè)的可行性。為實(shí)現(xiàn)各個(gè)目的條帶檢測(cè)效率最佳，本試驗(yàn)對(duì)各組引物濃度和溫度的條件進(jìn)行優(yōu)化，由圖3和圖4可分析得出，腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌最佳的上下游引物濃度分別是0.28、0.28、0.20、0.24 μmol/L。最終的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性10 s，64 ℃退火90 s，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30個(gè)循環(huán)。

2.3 多重PCR特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果

在最佳的引物比例條件下，對(duì)本試驗(yàn)所建多重PCR方法的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。由圖5可知， 只有鼠傷寒沙門氏菌+腸炎沙門氏菌+傷寒沙門氏菌+雞白痢沙門氏菌的混合模板DNA及鼠傷寒沙門氏菌DNA、腸炎沙門氏菌DNA、傷寒沙門氏菌DNA、雞白痢沙門氏菌DNA出現(xiàn)條帶，而非沙門氏菌的基因DNA不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，證明了該方法具有較強(qiáng)的特異性，可以實(shí)現(xiàn)沙門氏菌復(fù)雜血清型的分離分辨。由圖6可知，多重PCR反應(yīng)體系對(duì)混合模板DNA的最低檢測(cè)限分別是：雞白痢沙門氏菌 13.1 pg/mL;腸炎沙門氏菌 12.5 pg/mL;鼠傷寒沙門氏菌13.7 pg/mL;傷寒沙門氏菌12.3 pg/mL。因此，在檢測(cè)過程中只需要少量的臨床組織病料樣品即可檢測(cè)出是否感染相關(guān)的沙門氏菌血清型。

2.4 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

利用建好的多重PCR法對(duì)128份沙門氏菌陽性樣本進(jìn)行鑒定，部分臨床樣本檢測(cè)結(jié)果見圖7，檢測(cè)出腸炎沙門氏菌78.0%，雞白痢沙門氏菌3.9%，傷寒沙門氏菌0.8%，鼠傷寒沙門氏菌1.6%，其他占15.7%。

2.5 多重PCR準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果

單重PCR法對(duì)沙門氏菌臨床樣本進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖8至圖11。對(duì)2種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較（表4），可以看出2種檢測(cè)方法的結(jié)果完全一致。因此，本試驗(yàn)所用的多重PCR檢測(cè)法準(zhǔn)確性較高。

3 討論

沙門氏菌可導(dǎo)致人畜共患的細(xì)菌性疾病。禽類感染沙門氏菌后不但對(duì)自身健康造成影響，使得生產(chǎn)力下降;還會(huì)通過禽類食品傳播給人[9]，要想控制沙門氏菌，建立有效檢測(cè)方法是很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。有研究報(bào)道，雞白痢、腸炎、傷寒及鼠傷寒這4種沙門氏菌血清型不但常見多發(fā)且對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害較大[2]。因此，建立相關(guān)沙門氏菌的檢測(cè)鑒別方法具有實(shí)際應(yīng)用意義。

PCR檢測(cè)沙門氏菌具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，特別是多重PCR檢測(cè)技術(shù)，相比普通的單重PCR，可實(shí)現(xiàn)多通量的靶基因檢測(cè)[10]。目前，沙門氏菌血清型的檢測(cè)大多數(shù)是基于三重PCR檢測(cè)技術(shù)，而四重PCR法鑒別沙門氏菌血清型的報(bào)道卻相對(duì)較少。龔建森在禽源沙門氏菌的分析篩選研究報(bào)道中，利用三重PCR法鑒別腸炎、傷寒、鼠傷寒沙門氏菌[11]。而本研究則是采用四重PCR法鑒別雞白痢、腸炎、傷寒以及鼠傷寒這4種沙門氏菌。

在李紅等關(guān)于禽沙門氏菌多重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用的研究過程中，證實(shí)了多重PCR檢測(cè)技術(shù)具有特異性好、準(zhǔn)確性高、靈敏度強(qiáng)的特點(diǎn)[5]。本試驗(yàn)的結(jié)果也同樣驗(yàn)證了此方法具備這些優(yōu)點(diǎn)。因而，本試驗(yàn)的檢測(cè)方法可完成實(shí)驗(yàn)室和規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)鑒別。

但多重PCR技術(shù)也有不足之處，如會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生消極影響的引物二聚體、各組引物擴(kuò)增效率不一樣[12]等問題。想要解決這些問題，讓多重PCR檢測(cè)技術(shù)更好地應(yīng)用于各種病原體的檢測(cè)，是日后試驗(yàn)研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究建立了一種檢測(cè)鑒別雞白痢、腸炎、鼠傷寒、傷寒這4種沙門氏菌的多重PCR檢測(cè)方法，用于篩查實(shí)際生產(chǎn)中出現(xiàn)的這4種沙門氏菌。通過試驗(yàn)表明，此方法具備準(zhǔn)確可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可完成實(shí)際生產(chǎn)中相關(guān)沙門氏菌的監(jiān)測(cè)。

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