許萍萍 劉曉宇 許忠祥 楊靜 周密密 錢茱希 李彬 吳翠萍 安榆林

摘要：由丁香假單胞菌豌豆致病變種引起的豌豆細(xì)菌性疫病可引起寄主植物花梗、花和豆莢等萎蔫枯死，導(dǎo)致植株猝倒，對產(chǎn)量影響較大。目前在世界各豌豆重要生產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生并嚴(yán)重危害，至今尚無有效防治措施。為防范該病菌隨著豌豆進(jìn)口傳入我國，需要提高對該病菌的認(rèn)識，研制更加快速、高效的檢測方法。丁香假單胞菌豌豆致病變種與適合致病變種等9個(gè)致病變種組成基因型Ⅰ。根據(jù)丁香假單胞菌豌豆致病變種與不同豌豆品種致病性的不同，該變種又可分為8個(gè)生理小種。利用該病菌特異性片段設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的不同，可將上述8個(gè)生理小種分為2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育群。目前，對該病菌的鑒定主要通過常規(guī)的生理生化方法和環(huán)介導(dǎo)等溫及多位點(diǎn)序列分析等分子生物學(xué)方法。上述檢測方法存在檢測周期長、檢測效率低，且不能快速區(qū)分陽性結(jié)果是否來源于病原菌活細(xì)胞或死細(xì)胞等問題。可通過探索建立實(shí)時(shí)熒光PCR和數(shù)字PCR檢測方法，來實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確鑒定目標(biāo)菌種，并對供試菌株的活性進(jìn)行鑒定的目標(biāo)。

關(guān)鍵詞：豌豆;豌豆細(xì)菌性疫病病菌;病害;丁香假單胞菌豌豆致病變種;分類;檢測

中圖分類號：S436.43 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0046-05

豌豆細(xì)菌性疫病為我國禁止進(jìn)境植物檢疫性細(xì)菌病害，由丁香假單胞菌豌豆致病變種（Pseudomonas syringae pv. pisi）侵染引起，1915年首次報(bào)道在美國科羅拉多州發(fā)生[1]，至今已有百余年。隨后該病害迅速擴(kuò)散至世界各豌豆重要生產(chǎn)區(qū)，我國尚無分布。該病菌可引起寄主植物花梗、花和豆莢等萎蔫枯死，導(dǎo)致植株猝倒，早期侵染即可造成嚴(yán)重?fù)p失，對豌豆產(chǎn)量影響較大[2]。

豌豆細(xì)菌性疫病菌主要隨種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播[3]，病菌在種子表面或種子內(nèi)部可存活數(shù)個(gè)生長季節(jié)，經(jīng)表面藥劑處理后的種子內(nèi)部仍有病菌存活[4]，因此極難防治。豌豆是我國第一大食用豆進(jìn)口品種，我國是全球第二大進(jìn)口國，加拿大、美國是我國的豌豆主要進(jìn)口國[5]。根據(jù)歐洲和地中海植物保護(hù)組織（EPPO）2020年數(shù)據(jù)，豌豆細(xì)菌性疫病在加拿大廣泛分布，美國的加利福利亞州、科羅拉多州、堪薩斯州、紐約州、華盛頓州、威斯康辛州均有分布。2013年，原廈門檢驗(yàn)檢疫局從加拿大進(jìn)口豌豆中檢測出豌豆細(xì)菌性疫病病菌，其后也有其他口岸截獲該致病菌。因此，為有效降低豌豆細(xì)菌性疫病病菌傳入風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)一步提高對該病菌的認(rèn)識，有效加強(qiáng)進(jìn)口豌豆種子的檢疫。

1 豌豆細(xì)菌性疫病病菌的屬性及分類

1.1 基本屬性

豌豆細(xì)菌性疫病的病原菌為丁香假單胞菌豌豆致病變種，屬于薄壁菌門（Gracilicutes）假單胞菌科（Pseudomonadaceae）假單胞菌屬（Pseudomonas）丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的致病變種，屬于革蘭氏陰性菌。該病菌主要寄主為豌豆（Pisum sativum），自然條件下也可侵染扁豆（Lablab purpureus）、山黧豆（Lathyrus odoratus）、寬葉山黧豆（L. latifolius）、野豌豆屬（Vicia spp.）植物和孟加拉野豌豆（V. benghalensis）[6]。

1.2 現(xiàn)有分類

1.2.1 基因型 丁香假單胞菌寄主范圍廣，常見的致病變種已達(dá)60多種[7-8]，種內(nèi)致病變種的區(qū)分和鑒定一直是植物病原細(xì)菌鑒定中的難點(diǎn)。Gardan 等1999年根據(jù) DNA-DNA 雜交和核糖體分型將 48個(gè)致病變種及相關(guān)假單胞桿菌劃分為 9 類基因型，其中丁香假單胞菌豌豆致病變種與適合致病變種（P. syringae pv. aptata）、猝倒致病變種（P. syringae pv. lapsa）、皰疹致病變種（P. syringae pv. papulans）、致黑致病變種（P. syringae pv. atrofaciens）、大葉槭致病變（P. syringae pv. aceris）、黍致病變種（P. syringae pv. panici）、臭楝致病變種（P. syringae pv. dysoxyli）、日本致病變種（P. syringae pv. japonica）等 9個(gè)致病變種組成基因型1[9]。同基因型內(nèi)的不同致病變種遺傳關(guān)系非常接近，難以區(qū)分。

1.2.2 生理小種 Taylor等1995年通過研究該病原菌與8個(gè)不同豌豆栽培種無毒基因（A）與抗性基因（R）的相互作用將其分為7個(gè)生理小種[10]，詳見表1。Martin-Sanz等2011年報(bào)道新的8號生理小種，有熒光，可擴(kuò)增出272 bp條帶[11]。

1.2.3 血清學(xué)分類 Grondeau等1992年使用血清學(xué)方法將供試的所有丁香假單胞菌豌豆致病變種分成3個(gè)O血清型，分別為APT-PIS、HEL2和RIB[12]。

1.2.4 2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育群 Arnold等1996年找出病原菌特異性片段，并以此設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有的7個(gè)生理小種分別擴(kuò)增出272 bp或132 bp片段，因此將7個(gè)生理小種分為2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育群，Ⅰ群為1、5、7生理小種，Ⅱ群為2、3、4、6生理小種[13]。在這個(gè)研究中，作者還首次發(fā)現(xiàn)應(yīng)屬于Ⅱ群的3、4號生理小種的少量菌株擴(kuò)增出屬于Ⅰ群的條帶，因此又將3、4號生理小種分為3A/B，4A/B。這個(gè)分類在Cournoyer等1996年基于HrpL基因?qū)υ摬【腄NA序列分析中得到驗(yàn)證[14]。丁香假單胞菌豌豆致病變種分類情況詳見表2。

2 豌豆細(xì)菌性疫病病菌的檢測

2.1 檢測中容易混淆的近似菌

我國每年進(jìn)口的豌豆95%以上來自加拿大[15] 。由于豆類對后茬作物增產(chǎn)效果非常顯著，在加拿大，豌豆、扁豆、鷹嘴豆廣泛作為小麥、油菜的前茬作物[16]。因此，進(jìn)口的豌豆中極易混雜有扁豆、鷹嘴豆、小麥、油菜等的種子，在丁香假單胞菌豌豆致病變種的檢測中，上述夾雜的種子容易攜帶的丁香假單胞菌的其他致病變種細(xì)菌需要進(jìn)行排除。Lelliott等發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌（P. fluorescens）、惡臭假單胞菌（P. putida）廣泛存在于土壤中，綠黃假單胞菌（P. viridiflava）和丁香假單胞菌丁香致病變種（P. syringae pv. syringae）正常存在于植物地上部分[17]。這些細(xì)菌容易污染豌豆種子。Grondeau等發(fā)現(xiàn)血清學(xué)方法不能將丁香假單胞菌豌豆致病變種與丁香致病變種、綠黃假單胞菌進(jìn)行區(qū)分[12]。 進(jìn)口豌豆檢測中容易與豌豆細(xì)菌性疫病病菌混淆的細(xì)菌詳見表3。在檢測進(jìn)口豌豆細(xì)菌性疫病病菌時(shí)，可以通過查詢表3的寄主信息和發(fā)生國家/地區(qū)信息，判斷可能存在的其他假單胞菌種類。如對加拿大進(jìn)口豌豆檢測中，丁香假單胞菌大豆致病變種、斑生致病變種、菜豆致病變種、丁香致病變種、熒光假單胞菌、綠黃假單胞菌就是重點(diǎn)排除對象。

2.2 現(xiàn)有檢測方法

2.2.1 常規(guī)生理生化方法

2.2.1.1 細(xì)菌分離 種子表面用 0.5%次氯酸鈉消毒5 min，滅菌水洗3次，將消過毒的種子放在KB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。25 ℃培養(yǎng)2～3 d，出現(xiàn)光亮黏稠隆起的菌落[18]。

2.2.1.2 生化測試

2.2.1.2.1 革蘭氏判定 簡單快速地進(jìn)行預(yù)鑒定，可以采用KOH法，用接種環(huán)蘸取細(xì)菌和2滴3% KOH混合，若細(xì)菌變黏，則為革蘭氏陰性菌，不變黏，則為革蘭氏陽性菌[7]。

2.2.1.2.2 熒光色素沉著 將在含有1%酪氨酸的KB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)了24～48 h的細(xì)菌菌落，放紫外燈下觀察熒光色素沉著。

2.2.1.2.3 過氧化氫酶 新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物放在潔凈的載玻上，加1滴10%過氧化氫。該病原菌應(yīng)出現(xiàn)有氣泡產(chǎn)生的陽性反應(yīng)。

2.2.1.2.4 硝酸鹽測試 選擇含硝酸鹽源的培養(yǎng)基接種細(xì)菌分離株。培養(yǎng)基顏色的變化意味著細(xì)菌是厭氧，在無氧呼吸時(shí)將硝酸鹽（NO-3）還原為亞硝酸鹽（NO-2）。該病原菌不能降解N，因此不能產(chǎn)生陽性反應(yīng)。

2.2.1.2.5 LOPAT試驗(yàn) 即果聚糖試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、馬鈴薯軟腐試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)和煙草過敏試驗(yàn)。該病原菌LOPAT測試結(jié)果為果聚糖試驗(yàn)和煙草過敏試驗(yàn)陽性，氧化酶試驗(yàn)、馬鈴薯軟腐試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)均為陰性。

2.2.2 血清學(xué)方法 Grondeau等1992年使用血清學(xué)方法對豌豆疫病病菌進(jìn)行鑒定[3]。將供試的所有丁香假單胞菌豌豆致病變種分成3個(gè)O血清型，分別為APT-PIS（占比88.5%）、HEL2（11.4%）、RIB（0.1%）。同時(shí)指出血清學(xué)方法不能區(qū)分豌豆細(xì)菌性疫病病菌和丁香假單胞菌丁香致病變種和綠黃假單胞菌[12]。

2.2.3 分子生物學(xué)方法

2.2.3.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測法 封立平等2013年根據(jù)丁香假單胞菌豌豆致病變種的肽相關(guān)脂蛋白（oprL）特異性基因設(shè)計(jì)了2對引物FIP/BIP和F3/B，建立了丁香假單胞菌豌豆致病變種環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增檢測體系，其結(jié)果表明2對引物特異性強(qiáng)，可特異性區(qū)分丁香假單胞菌丁香致病變種、綠黃假單胞菌、丁香假單胞菌大豆致病變種、丁香假單胞菌菜豆致病變種。其檢測靈敏度比普通PCR高出100倍[19]。

2.2.3.2 多位點(diǎn)序列分析 陳青等2016年使用E11/E16、E22/E26等7對引物，對菌株的16S、gap1、gltA等6個(gè)序列進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和測序，并結(jié)合進(jìn)行Biolog 測定、煙草過敏性反應(yīng)和致病性測試，最終將菌株鑒定為豌豆細(xì)菌性疫病病菌[6]。

2.2.3.3 常規(guī)PCR技術(shù) 基于常規(guī)PCR技術(shù)對細(xì)菌的檢測常以擴(kuò)增病原菌基因組的核糖體基因序列16S rDNA 、16S-23S rDNA間隔區(qū)或看家基因gap1、gltA、gyrB 和 rpoD為基礎(chǔ)，由于丁香假單胞菌的核糖體、看家基因的高度保守性，因而單純以 16S rDNA 或看家基因?yàn)槟繕?biāo)片段序列，設(shè)計(jì)的引物探針，很難有效鑒別丁香假單胞菌致病變種。

對于不同寄主植物有著不同的致病性是丁香假單胞菌的重要鑒別特征，致病基因以及致病相關(guān)基因很可能作為丁香假單胞菌不同菌株以及致病變種的分類鑒定指標(biāo)。丁香假單胞菌通過獲得hrp基因簇從而發(fā)展成植物病原菌[20]。植物病原細(xì)菌的hrp基因參與對寄主植物的致病性反應(yīng)以及激發(fā)對非寄主植物的過敏性反應(yīng)。Inoue等分別于2000年和1999年發(fā)現(xiàn)hrpS、hrpA、hrpZ以及hrpB基因在不同丁香假單胞菌菌株之間的排列順序始終一致，有著高度同源，對于丁香假單胞菌分組鑒定有著重要的意義[21-22]?？刂贫∠慵賳伟兎N產(chǎn)生乙烯的是位于丁香假單胞菌的一個(gè)原源質(zhì)粒上的efe基因，Weingart 等1999年基于efe基因設(shè)計(jì)了引物 EFEP1/EFEP2用于檢測丁香假單胞菌豌豆致病變種[23]。

2.2.3.4 紅外光譜檢測 徐曉鷗等2014年使用紅外光譜技術(shù)，利用菜豆暈疫病病菌和豌豆細(xì)菌性疫病病菌在3 000～4 000 cm-1內(nèi)，分別具有特異性峰位，來鑒定2種菌。該方法檢測周期僅為2 h左右，檢測步驟簡潔，樣品前處理便捷[24]。

總之，在該病原菌的檢測上，生理生化方法耗費(fèi)時(shí)間較長，同時(shí)一些理化鑒定結(jié)果易于因?yàn)橹饔^上的差異從而不能客觀反映不同致病變種之間的差異。近些年，在分子生物學(xué)檢測方法上，進(jìn)行了較多的嘗試，但存在特異性不足、缺乏對病原菌的活性判定等問題。

3 問題與展望

丁香假單胞菌寄主范圍廣，且有眾多的致病變種，致病變種的區(qū)分和鑒定一直是植物病原細(xì)菌鑒定中的難點(diǎn)。現(xiàn)有的丁香假單胞菌豌豆致病變種的檢測方法存在檢測周期長、檢測效率低且不能快速區(qū)分陽性結(jié)果來源與病原菌活細(xì)胞或死細(xì)胞等缺點(diǎn)，從而影響口岸通關(guān)效率。

使用實(shí)時(shí)熒光PCR，根據(jù)不同致病變種丁香假單胞菌基因組中特定基因序列的差異性，設(shè)計(jì)特異性引物，可快速、精準(zhǔn)鑒別目標(biāo)致病變種，并具有較高的靈敏度。包奇等2016年建立的基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測桑丁香假單胞菌的方法，從供試的29株菌株中特異性檢測出桑丁香假單胞菌，檢測極限可達(dá)普通PCR的1/1 000[25]。

相對于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，數(shù)字PCR技術(shù)具有特異性更高、靈敏度更好、無需外部標(biāo)準(zhǔn)的絕對定量等優(yōu)點(diǎn)，其檢測結(jié)果一般不受擴(kuò)增效率的影響，對PCR抑制物的耐受性也比較高，因此重復(fù)性也更好[26]。田茜等2018年建立了水稻細(xì)菌性條斑病病菌和白葉枯病病菌數(shù)字PCR檢測方法，均可特異性檢測到目標(biāo)病菌的供試菌株;同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度達(dá)到數(shù)字PCR的檢測下限時(shí)，實(shí)時(shí)熒光PCR的CT值均為35，處于結(jié)果判斷的臨界值，很難得到準(zhǔn)確的結(jié)果，而相對的在利用數(shù)字 PCR 檢測體系對濃度較低的樣品進(jìn)行檢測時(shí)，雖然陽性微滴數(shù)較少，但是可以得到準(zhǔn)確的靶標(biāo)分子拷貝數(shù)等數(shù)值，這個(gè)特性對于實(shí)現(xiàn)微量病原菌的快速準(zhǔn)確檢測具有十分重要的意義[27]。數(shù)字PCR的絕對定量技術(shù)可用于對供試菌株死活的快速判定。作為全新的技術(shù)手段，數(shù)字PCR存在儀器昂貴、測試成本較高等問題[28]。因此，建議在對丁香假單胞菌豌豆致病變種的檢測中，可探索建立實(shí)時(shí)熒光PCR和數(shù)字PCR檢測方法，以實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確鑒定目標(biāo)菌種，并對供試菌株的活性進(jìn)行鑒定。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sackett W G. A bacterial stem blight of field and garden peas[M]. Colorado：the Experiment Station Fort Collins，1916：43-43.

[2]Bradbury J F. Guide to plant pathogenic bacteria[Z]. 1986：23-24.

[3]Grondeau C，Olivier V，SamsonR. Détection de Pseudomonas syringae pv.pisi dans les semences de pois：méthodes，limites et controverses[J]. Phytoma，1993，455：45-47.

[4]Stead D E，Pemberton A W. Recent problems with Pseudomonas syringae pv.pisi in the UK[J]. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin，1987，17：291-294.

[5]劉 慧. 中國食用豆貿(mào)易現(xiàn)狀與前進(jìn)展望[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2012，18（8）：45-49.

[6]陳 青，錢俊婷，林振基，等. 進(jìn)境加拿大豌豆中豌豆細(xì)菌性疫病菌的檢測[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2016，46（2）：169-175.

[7]趙廷昌. 植物病原細(xì)菌鑒定實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2011：12-14.

[8]蔡妙英. 細(xì)菌名稱[M]. 2版北京：科學(xué)出版社，1996：8-10.

[9]Gardan L，Shafik H，Belouin S，et al. DNA relatedness among the pathovars of Pseudomonas syringae and description of Pseudomonas tremae sp. nov. and Pseudomonas cannabina sp. nov. （ex Sutic and Dowson 1959）[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49（2）：469-478.

[10]Taylor J D，Bevan J R，Crute I R，et al. Genetic relationship between races of Pseudomonas syringae pv. pisi and cultivars of Pisum sativum[J]. Plant Pathology，2010，38（3）：364-375.

[11]Martín-Sanz A，Palomo J L，Pérez De La Vega M，et al. Identification of pathovars and races of Pseudomonas syringae，the main causal agent of bacterial disease in pea in North-Central Spain，and the search for disease resistance[J]. European Journal of Plant Pathology，2011，129（1）：57-69.

[12]Grondeau C，Saunier M，Poutier F，et al. Evaluation of physiological and serological profiles of Pseudomonas syringae pv. pisi for pea blight identification[J]. Plant Pathology，2007，41（4）：495-505.

[13]Arnold D L，Athey-Pollard A，Gibbon M J，et al. Specific oligonucleotide primers for the identification of Pseudomonas syringae pv. pisi yield one of two possible DNA fragments by PCR amplification：evidence of the phylogenetic divergence[J]. Physilogical and Molecular Plant Pathology，1996，49（4）：233-245.

[14]Cournoyer B，Arnold D，Jackson R，et al. Phylogenetic evidence for a diversification of Pseudomonas syringae pv. pisi race 4 strains into two distinct lineages[J]. Phytopathology，1996，86（10）：1051-1056.

[15]周俊玲，張蕙杰. 世界豌豆生產(chǎn)及貿(mào)易形勢分析[J].世界農(nóng)業(yè)，2015（9）：131-135.

[16]杜甘露，張蕙杰，周俊玲. 加拿大食用豆生產(chǎn)、消費(fèi)及貿(mào)易概況[J].世界農(nóng)業(yè)，2012（10）：95-98.

[17]Lelliott R A，Billing E，Hayward A C. A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic Pseudomonas[J]. Journal of Applied Bacteriology，2010，29（3）：470-489.

[18]Schaad N W，Jones J B，Chun W. Laboratory guide for the identification of plant pathogenic bacteria[M]. Minnesota：APS Press St. Paul，1995：24-27.

[19]封立平，尼秀媚，厲 艷，等. LAMP方法檢測豌豆細(xì)菌性疫病菌[J]. 植物檢疫，2013，27（3）：80-84.

[20]Inoue Y，Takikawa Y. Phylogenic analysis of DNA sequences around the hrpL and hrpZ regions of Pseudomonas syringae group bacteria[M]//Pseudomonas syringae and Related Pathogens，1992：687-695.

[21]Inoue Y，Takikawa Y. Pseudomonas syringae strains are classified into five groups by comparing DMA homology at the hrp neighboring regions[J]. Journal of General Plant Pathology，2000，66（3）：238-241.

[22]Inoue Y，Takikawa Y. Grouping Pseudomonas syringae strainsby comparing DNA homology at the hrp gene cluster and its neigh-boring regions[J]. Ann Phytopathol Soc Jpn，1999，65（1）：32-41.

[23]Weingart H，Vlksch B，Ullrich M S. Comparison of ethylene production by Pseudomonas syringae and ralstonia solanacearum[J]. Phytopathology，1999，89（5）：360-365.

[24]徐曉鷗，吳志毅，陳 曦，等. 2 種豆類植物病原細(xì)菌的紅外光譜檢測與鑒定[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（2）：233-235.

[25]包 奇，曹夢琪，周 雨，等. 基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測桑丁香假單胞菌[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2016，42（2）：210-218.

[26]Dingle T C，Sedlak R H，Cook L，et al. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances[J]. Clinical Chemistry，2013，59（11）：1670-1672.

[27]田 茜，李云飛，王明生，等. 水稻細(xì)菌性條斑病菌和白葉枯病菌數(shù)字PCR檢測方法的建立[J]. 植物檢疫，2018，32（6）：25-31.

[28]李慧調(diào)，潘健章，方 群. 數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用[J]. 化學(xué)進(jìn)展，2020，32（5）：581-593.