李會云 程孟雪 李勇慧 劉忠艷

摘要：為了研究牡丹種質(zhì)資源的遺傳多樣性和DNA鑒定，采用ISSR標(biāo)記的方法來進行試驗，即采用改良的CTAB法從成熟干燥的牡丹葉片中提取基因組DNA，其質(zhì)量檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法和超微量分光光度計法，用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)系統(tǒng)，對加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia，UBC）公布的220條ISSR引物進行篩選。結(jié)果表明，從6個牡丹品種的葉片中提取的DNA濃度范圍在30×10-3 ～100×10-3 μg/μL之間，DNA樣品純度 D260 nm/D280 nm 比值在1.7～1.9之間;從220條ISSR引物中篩選出了12條適合牡丹的擴增結(jié)果好的引物，選出的引物擴增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好。說明提取的DNA質(zhì)量較好，該改良的CTAB法適用于從蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)含量較高的植物材料中提取基因組DNA;篩選出的12條ISSR引物為進一步研究牡丹資源的遺傳多樣性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牡丹;DNA提取;ISSR引物篩選;PCR擴增;改良的CTAB法

中圖分類號：S685.110.1?? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0058-06

收稿日期：2020-12-21

基金項目：河南省科技攻關(guān)項目（編號：192102110035）。

作者簡介：李會云（1982—），女，河南安陽人，博士，講師，從事植物生理及分子生物學(xué)的教學(xué)與科研工作。E-mail：30226972@qq.com。

牡丹（Paeonia suffruticosa），是芍藥科芍藥屬多年生落葉灌木[1]，是一種傳統(tǒng)中國花卉，也是世界著名花卉，姿態(tài)萬千、色彩豐富，不但在園林和花卉文化中占有重要地位，深受中國人民喜愛，而且在對外傳播和交流時受到世界人民喜愛。同時，牡丹也是一種重要的花卉植物和資源植物，其藥用、文化和觀賞歷史已約有2 000余年。中國牡丹主要分布在洛陽、蘭州、彭州、菏澤、延安、銅陵等地。據(jù)調(diào)查，不同產(chǎn)地的牡丹共計約有1 500個品種[2-4]。

近年來，RAPD、SSR、ISSR、AFLP和SRAP 等分子標(biāo)記已廣泛用于牡丹的遺傳多樣性分析、核心種質(zhì)構(gòu)建、種質(zhì)資源分類鑒定等方面[5]。ISSR（inter-simple sequence repeat）標(biāo)記是由Zietkiewicz等開發(fā)的分子標(biāo)記[6]。SSR（ simple sequence repeat） 廣泛分布在真核植物基因組中，由1～6個堿基對組成，其兩端序列通常是相對保守的單拷貝序列，因此，可以設(shè)計特異的寡核苷酸引物進行SSR-PCR，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)量，通過擴增串聯(lián)重復(fù)序列揭示了SSR的長度多態(tài)性[7]。ISSR是基于SSR發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，它根據(jù)基因組內(nèi)廣泛存在的微衛(wèi)星序列設(shè)計單一引物，擴增出DNA序列在SSR之間的反向排列，然后對擴增產(chǎn)物進行電泳、染色，根據(jù)條帶的存在及相對位置來分析不同樣品間ISSR標(biāo)記的多態(tài)性[8-9]。ISSR標(biāo)記方法由于其高效性、重復(fù)性好、操作簡單等特點，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、雜種后代快速鑒定等領(lǐng)域[10]。目前，ISSR標(biāo)記已經(jīng)用于湖南、云南香格里拉、福建、四川[11-14]牡丹的遺傳多樣性分析，然而，ISSR標(biāo)記尚未用于分析洛陽牡丹的遺傳多樣性。本試驗采用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系篩選ISSR引物，選出12條引物，為研究洛陽牡丹的遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗植物材料采自洛陽市牡丹研究院，共有6個牡丹品種：鶴頂紅、文培紫、海棠爭潤、銀粉金鱗、似荷蓮、錦袍江，對這6個牡丹品種從1～6依次進行編號，干燥處理后保存于自封袋備用。本試驗于2019年在洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生科樓406和509實驗室實施。

1.2 主要儀器設(shè)備

YXQ-SG46-280S型手提式壓力蒸汽滅菌器（施都凱儀器設(shè)備有限公司）;101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;SCIENTZ-48型高通量組織研磨機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;JA2003A型電子天平（上海精天電子儀器有限公司）;LX-200迷你型離心機（海門市其林貝爾儀器）;TGL-16B臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）;DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）;ChampChemi 610 Plus型全自動多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）;THZ-82A數(shù)顯恒溫振蕩器（常州朗越儀器制造有限公司）;SEDIG型梯度PCR儀;Eppendorf AG型PCR儀;K5500 Plus型超微量分光光度計。

1.3 主要試劑

CTAB、EDTA，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;Tris-HCl（pH值=8.0）、三氯甲烷、異戊醇、乙酸鈉、冰乙醇、β-巰基乙醇、GoldView I型核酸染色劑、10×DNA loading buffer，均購自北京索萊寶科技有限公司;2×Taq MasterMix混合液（康為，CW0690M）。

1.4 試驗方法

1.4.1 牡丹DNA的提取

根據(jù)改良的CTAB磁珠法[15]提取牡丹基因組DNA。取少量干燥葉片于 2 mL 的研磨管中，并放入直徑3 mm的鋼珠，再將研磨管放進組織研磨機中進行研磨，60 s后取出。加入1 000 μL 2% CTAB溶液和8 μL β-羥基乙醇，放入水浴鍋中65 ℃水浴1 h，每10 min倒置1次以混均勻。水浴鍋中取出后，加入500 μL CI（三氯甲烷 ∶異戊醇=24 ∶：1），搖床10 min（強度約160 r/min左右）。然后在室溫下1 200 r/min離心10 min，取上清液650 μL（視具體情況而定）于 1.5 mL 離心管中（棄去有機相）。再加入500 μL CI于1.5 mL的離心管中，搖床搖10 min。然后在室溫下1 200 r/min離心10 min，取上清液500 μL（視情況而定）于1.5 mL離心管中（吸取時小心仔細）。加入1/10體積3 mol/L乙酸鈉和2倍體積冰乙醇（體積與吸取的上清液相比）低溫靜置24 h（-20 ℃）。保留白色球狀物，倒去溶液（可先離心）。加入 500 μL 75%乙醇清洗2次，倒去溶液（根據(jù)情況離心，盡量第1次不離心，第2次離心。1 200 r/min離心2～3 min）。將離心管倒扣在吸水紙或衛(wèi)生紙上，約5～10 min，常溫下干燥DNA，之后再開蓋放在烘干機中，50 ℃烘干 20 min 左右。加入適量無菌水（50～100 μL）溶解DNA。

1.4.2 DNA濃度測定

通過超微量分光光度計測定DNA的濃度，通過測定DNA的D260 nm/D280 nm比確定DNA的純度和完整程度。最后將適用牡丹DNA保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCR擴增反應(yīng)

牡丹PCR反應(yīng)體系見表1（DNA模板是從35種牡丹中隨機選取的6個牡丹基因組DNA）。PCR擴增程序見表2。

1.4.4 瓊脂糖凝膠電泳

在錐形瓶中稱取0.3 g的瓊脂糖，加入30 mL 1×TAE緩沖液，配制成溶液，加熱混勻，向溶液中加入2 μL GoldView I型核酸染色劑，混合，倒入模具中（注意不能有氣泡，否則會影響跑膠結(jié)果），冷卻10 min。等瓊脂糖膠凝固后，將梳子垂直拔出。在電泳槽內(nèi)加入1×TAE緩沖液，將配好的膠放入電泳槽中，準(zhǔn)備點樣。從冰箱拿出擴增好的產(chǎn)物，第1個孔內(nèi)加入 1 μL 10×Loading buffer和4 μL Marker，之后每個孔內(nèi)加入5 μL擴增好的產(chǎn)物。按照順序依次迅速精準(zhǔn)點樣，以防止樣品擴散，導(dǎo)致跑膠條帶不清晰。加樣完畢后，設(shè)置電壓為120～130 V，電流為110 mA，電泳時間30～45 min。電泳結(jié)束后，輕輕取出凝膠并放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察成像結(jié)果。

1.4.5 引物篩選及退火溫度的確定

本試驗根據(jù)已優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系，用鶴頂紅、文培紫、海棠爭潤、銀粉金鱗、似荷蓮、錦袍江6個牡丹DNA樣品，對UBC公布的220條ISSR引物（表3）進行初篩和復(fù)篩，使用溫度梯度模式選擇合適的退火溫度。溫度設(shè)定為45、50、55、59 ℃4個溫度梯度。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

各個DNA樣品的濃度和D260 nm/D280 nm比值采用K5500 Plus型超微量分光光度計進行測定，各組引物的ISSR-PCR擴增圖通過Microsoft PowerPoint 2013和 Adobe Photoshop CS5 軟件進行制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取質(zhì)量檢測結(jié)果

通過改良的CTAB法提取牡丹DNA，用超微量分光光度計測DNA濃度。測得DNA濃度范圍在30～100 ng/μL，DNA樣品純度D260 nm/D280 nm比值范圍在1.7～1.9之間，提取的DNA質(zhì)量較好，無蛋白質(zhì)、酚類的污染。

2.2 ISSR引物篩選結(jié)果及退火溫度的確定

如果退火溫度太低，可能會發(fā)生非特異性擴增，并降低重復(fù)率;但是，如果溫度過高又會使條帶減少，導(dǎo)致一些可能反應(yīng)多態(tài)性的條帶消失[16]。因此確定合適的退火溫度十分必要。本研究將溫度設(shè)定為45、50、55、59 ℃ 4個溫度梯度，選擇最佳退火溫度。最后選出2個退火溫度：50、55 ℃。用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系對220條引物進行擴增、篩選。根據(jù)PCR產(chǎn)物的凝膠成像，最終從220條引物中共篩選出12條擴增條帶清晰、多態(tài)性好的ISSR引物，引物篩選結(jié)果和退火溫度的確定（表4、圖1、圖2和圖3）。

3 討論與結(jié)論

牡丹不僅具有較好的觀賞價值，同時還有很高的藥用價值。為了篩選出適合牡丹遺傳多樣性分析的ISSR引物，本試驗利用改良的CTAB法從牡丹成熟干燥的葉片中提取DNA，與Rawat等的ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究中同樣是選用成熟干葉的試驗材料[17]相一致。

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究牡丹遺傳多樣性和品種鑒定，可以獲得 DNA水平上的遺傳信息，不受外界環(huán)境的影響[18]。ISSR分子標(biāo)記受多種內(nèi)在因素的影響，測定的可靠性、穩(wěn)定性與PCR反應(yīng)條件密切相關(guān)[19-21]。退火溫度決定著 PCR 的特異性，它是引物和模板組合時的一個溫度參數(shù)，過高或過低都會影響 ISSR-PCR 擴增的清晰度及條帶的多少[22]。因此，在本試驗中采用溫度梯度PCR模式，將溫度設(shè)定為45、50、55、59 ℃4個溫度梯度，尋找合適的退火溫度。

為了能夠獲得所需的擴增產(chǎn)物，在該試驗中優(yōu)化了ISSR-PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系中5種成分（Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物與模板DNA） 的濃度與反應(yīng)結(jié)果有很大的關(guān)系。 TaqDNA

聚合酶是Mg2+依賴性酶，其活性會受到Mg2+濃度變化的影響，對Mg2+濃度比較敏感。Taq DNA 聚合酶用量過多時，不僅會造成成本的浪費，而且會出現(xiàn)非特異性擴增的條帶，產(chǎn)生彌散現(xiàn)象，用量過低時會降低擴增效率[23]。本試驗剛開始采用10 μL的體系，包括引物0.4 μL，10×Buffer 1 μL，dNTP 08 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，雙蒸水5.6 μL，模板DNA 2 μL。凝膠成像顯示其擴增結(jié)果并不理想。之后用2×Taq MasterMix混合液來代替10×Buffer、dNTP和Taq DNA聚合酶，換為15 μL反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 7.50 μL，引物0.75 μL，模板DNA? 1.25 μL，雙蒸水5.50 μL。凝膠成像顯示其擴增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好。利用此體系對所有引物進行引物篩選， 最終獲得ISSR-11、ISSR-44、

ISSR-45、ISSR-48、ISSR-59、ISSR-60、ISSR-81、ISSR-91、ISSR-93、ISSR-94、ISSR-97、ISSR-125共12條ISSR引物。本試驗用2×Taq MasterMix混合液來代替10×Buffer、dNTP和Taq DNA聚合酶，不僅可以有效解決它們之間的濃度配比問題，還可以節(jié)省操作時間、避免污染，與李振山在棗研究中使用的ISSR-PCR反應(yīng)體系和試驗結(jié)果[24]相似。

本研究結(jié)果表明，從鶴頂紅、文培紫、海棠爭潤、銀粉金鱗、似荷蓮和錦袍江6個牡丹品種的葉片中提取的基因組DNA濃度范圍在30～100 ng/μL之間，DNA樣品純度D260 nm/D280 nm比值在1.7～1.9之間，表明所提取的6個樣品的DNA質(zhì)量較好，沒有蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染，證實了該改良的CTAB法適用于從蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)含量較高的植物材料中提取基因組DNA。從220條ISSR引物中篩選出了12條引物，以6個牡丹品種的基因組DNA為模板，通過優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系進行擴增，凝膠成像結(jié)果顯示，擴增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好，共篩選出了12條引物，為研究牡丹遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。

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