張瑜 李欠 黃翔 馮彥梅 楊蘭 邱黛玉

摘 要： 為優(yōu)化中藥材當歸中主要活性成分阿魏酸和藁本內(nèi)酯同時提取的最佳工藝條件，該文以超聲波輔助響應面優(yōu)化當歸中阿魏酸和藁本內(nèi)酯提取工藝，采用氫核磁共振定量方法同時測定當歸中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量。優(yōu)化工藝以阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量的綜合評分為考察指標，選取乙醇濃度、提取時間、液料比三個主要因素，采用單因素篩選結(jié)合Box-Behnken中心組合設計試驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明：優(yōu)化的最佳提取工藝條件為乙醇濃度80.87%，液料比13.04 mL·g-1，提取時間30.14 min，驗證試驗結(jié)果與預測值一致。氫核磁共振定量方法以氘代二甲基亞砜為測試溶劑，吡嗪為內(nèi)標物，其中吡嗪、阿魏酸和藁本內(nèi)酯的定量共振峰分別為δ 8.66 ppm、δ 6.37～6.35 ppm和δ 5.55～5.53 ppm。該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復性和加標回收率良好，定量限和檢測限較低，能夠滿足實際分析測試需要。綜上所述，利用響應面法對提取工藝條進行優(yōu)化，實驗結(jié)果準確可靠，重現(xiàn)性良好，適用于當歸中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的同時提取;氫核磁共振定量方法操作簡單、分析速度快、專屬性強，可用于當歸中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的同時測定。

關鍵詞： 提取工藝， 當歸， Box-Behnken響應面法， 氫核磁共振

中圖分類號： Q946 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1188-08

Abstract： In order to optimize the optimum technological conditions for the simultaneous extraction of ferulic acid and ligustilide， the extraction process of ferulic acid and ligustilide from A. sinensis were optimized by ultrasonic assisted response surface. Taking the comprehensive score of ferulic acid and ligustilide content as the evaluation index and the ethanol concentration， extraction time and liquid-to-solid ratio were selected as the three main factors， and the contents of ferulic acid and ligustilide in A. sinensis were determined by 1H-qNMR. Single factor screening combined with Box-Behnken central combination design test was used to optimize the parameters of extraction process. The single-factor screening results showed that a high comprehensive score was obtained under the three conditions of 80% ethanol concentration， liquid-to-solid ratio was 12 mL·g-1， or 30 min extraction duration. Based on this， the Behnken center combination design test was designed and implemented. The results showed that the influence degree of each experimental factor on the comprehensive score was the ethanol concentration， the liquid-to-solid ratio was the second， and the extraction time was the least. The best optimum extraction conditions were as follows： ethanol concentration was 80.87%， liquid-to-solid ratio was 13.04 mL·g-1， extraction duration was 30.14 min. The verification test results were consistent with the predicted values. The quantitative resonance peaks of pyrazine， ferulic acid and ligustilide were δ 8.66 ppm， δ 6.37-6.35 ppm and δ 5.55-5.53 ppm， respectively， using DMSO-d6 as solvent and pyrazine as internal standard substance by 1H-qNMR. The precision， stability， repeatability and recovery of the method were good， and the limits of quantification and detection were low， which can meet the needs of practical analysis and testing. To sum up， the optimization method of response surface method was used to optimize the extraction process， the experimental results were accurate and reliable， good reproducibility， and suitable for the simultaneous extraction of ferulic acid and ligustilide in A. sinensis. The 1H-qNMR method had the advantages of simple operation， fast analysis speed and strong specificity， and could be used for the simultaneous determination of ferulic acid and ligustilide in A. sinensis.

Key words： extraction process， Angelica sinensis， Box-Behnken response surface method， 1H-qNMR

中藥材當歸是傘形科當歸屬植物當歸（Angelica sinensis）的干燥根（國家藥典委員會，2015），具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的作用，是我國臨床最常用中藥之一（國家藥典委員會，2015;董晴和陳明蒼，2016）。當歸中主要含有的生物活性成分有揮發(fā)油、有機酸類、多糖以及黃酮等（周桂生等，2012;趙雪嬌等，2013）。其中，阿魏酸是當歸中有機酸類的代表，屬于較早分離出來的有效成分之一（趙雪嬌等，2013）。揮發(fā)油在當歸中含量約為1%，是當歸的重要有效成分之一，其中以藁本內(nèi)酯含量為最高。2015年版《中國藥典》以阿魏酸的含量測定和其他常規(guī)鑒別項目作為當歸質(zhì)量控制的手段和指標（國家藥典委員會，2015），而對藁本內(nèi)酯含量并未作出明確規(guī)定。

近年來，響應面法和氫核磁定量方法分別在中藥有效成分的提取和含量測定方面得以廣泛應用（Xu et al.，2013;林珊等，2014;王志偉等，2016;趙昱瑋等，2016;高偉等，2017;Tanaka et al.，2019;戶憲珍等，2019;黃翔等，2019;Sun et al.，2017;王紅等，2019;周吉等，2019）。氫核磁定量方法測試時間非常短（2～5 min即可完成），特征峰化學位移在不同儀器之間重現(xiàn)性好，且定量過程中不需使用對照品，通過廉價易得的內(nèi)標物即可完成定量，可以有效降低成本（林珊等，2014;王志偉等，2016;高偉等，2017;Tanaka et al.，2017）。響應面優(yōu)化提取方法與常用的正交實驗法相比具有很多優(yōu)點：響應面法的實驗次數(shù)相對較少，檢測精確度高，預測的函數(shù)模型相對準確，因其能夠準確地反映實驗因素和預測結(jié)果之間關系而得以廣泛應用（Xu et al.，2013;趙昱瑋，2016;Sun et al.，2017; 戶憲珍等，2019;黃翔等，2019;王紅等，2019;周吉等，2019）。本文以阿魏酸和藁本內(nèi)酯成分含量的綜合評分為響應值，使用Design-Expert 10.0.4.0軟件進行試驗設計，優(yōu)化當歸提取工藝，為當歸應用和質(zhì)量標準建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

對照品阿魏酸（批號：FD170255）購自薩恩化學技術(shù)有限公司;藁本內(nèi)酯購自北京庫來搏科技有限公司，純度>98%;吡嗪購自上海麥克林生化科技有限公司;DMSO-d6（氘代純度，99.9%）購自薩恩化學技術(shù)有限公司。當歸藥材購自甘肅岷縣經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學中藥學教研室邱黛玉副教授鑒定為中藥當歸。

核磁共振波譜儀（Bruker Advance Ⅲ 600），AL-104電子分析天平（慈溪市天東衡器廠）、KQ-500B超聲波清洗儀（深圳市得康科技有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-101N（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、恒溫水浴鍋（江蘇正基有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 氫核磁共振測試條件 DMSO-d6為測試溶劑，吡嗪為內(nèi)標物。吡嗪、阿魏酸和藁本內(nèi)酯的定量共振峰分別為δ 8.66、δ 6.37～6.35 ppm、δ 5.55～5.53 ppm。

采用zg30脈沖序列，譜寬（SWH）為11 904.8 Hz，弛豫時間（D1）為1 s，脈沖寬度（P1） 14.90 s，樣品掃描次數(shù)（NS） 32次。所有數(shù)據(jù)均使用MestReNova軟件處理。

1.2.2 溶液的制備 內(nèi)標溶液的制備：準確稱取19.70 mg內(nèi)標物吡嗪溶解至3.94 mL DMSO-d6中，制得5.00 mg·mL-1內(nèi)標溶液，作為用于1H-qNMR樣品定量的內(nèi)標樣品;準確稱取7.50 mg內(nèi)標物吡嗪溶解至0.75 mL DMSO-d6中，制得10.00 mg·mL-1內(nèi)標溶液，作為用于線性關系考察時1H-qNMR定量的內(nèi)標樣品。

對照品溶液的制備：準確稱取22.00 mg阿魏酸對照品溶解至2 mL DMSO-d6溶液中，制得11.00 mg·mL-1阿魏酸對照品溶液;準確稱取59.00 mg藁本內(nèi)酯對照品溶解至2 mL DMSO-d6溶液中，制得29.50 mg·mL-1藁本內(nèi)酯對照品溶液備用。

當歸提取物的制備：取藥材粉末（過40目篩）約10.00 g，精密稱定，置于容量瓶中，加入90%乙醇100 mL，超聲處理（40 min，40 ℃），抽濾，重復2次，合并濾液，于50 ℃減壓回收溶劑至無醇味，用2倍量乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯，于70 ℃ 水浴上旋干得粗浸膏并稱重。

供試品溶液的制備：取上述浸膏20 mg，精密稱定，加內(nèi)標溶液吡嗪50 μL（吡嗪19.70 mg，溶于3.94 mL DMSO-d6），再加入450 μL DMSO-d6，超聲溶解，移置核磁管，用于氫核磁共振法測定（圖1）。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 線性關系考察 取“1.2.2”項下對照品儲備液400、200、100、50、25和13 μL裝入核磁管，加入內(nèi)標溶液吡嗪50 μL（吡嗪7.5 mg，溶于0.75 mL DMSO-d6），再依次加入DMSO-d6 50、250、350、400、425、437 μL，即得8.80、4.40、2.20、1.10、0.550、0.286 mg·mL-1阿魏酸對照品溶液和23.6、11.8、5.90、2.95、1.48、0.767 mg·mL-1藁本內(nèi)酯對照品溶液系，進行1H-NMR測定。

1.2.3.2 精密度考察 取“1.2.2”項下對照品溶液，按“1.2.1”項下核磁條件，重復測定5次，以對照品定量峰面積與內(nèi)標物定量峰面積的比值計算阿魏酸和藁本內(nèi)酯的RSD值。

1.2.3.3 重復性試驗 平行制備6份供試品溶液，在同一實驗條件下測定，以樣品定量峰面積與內(nèi)標物定量峰面積的比值計算阿魏酸和藁本內(nèi)酯的RSD值。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 將供試品溶液在室溫下放置，時間分別為0、2、4、8、10、12、24 h，然后進行穩(wěn)定性實驗測定，以樣品定量峰與內(nèi)標物定量峰面積比值計算阿魏酸和藁本內(nèi)酯的RSD值。

1.2.3.5 加樣回收率試驗 制備5份已知含量的當歸藥材樣品浸膏供試液，分別加入藁本內(nèi)酯和阿魏酸對照品DMSO-d6溶液，按照“1.2.1”項下的條件測定，計算回收率和RSD值。

1.2.4 檢出限和定量限 1H-qNMR檢出限（LOD）和定量限（LOQ）可由LOD=3.3 σ/S，LOQ=10 σ/S計算得出（σ指回歸線的剩余標準差，S指非零截距線性回歸曲線斜率）。

1.2.5 樣品含量測定 按“1.2.2”項下“供試品溶液制備”方法平行制備試驗樣品溶液2份，并按照“1.2.1”項核磁共振測試條件下進行重復測定2次，計算樣品的含量平均值。

1.2.6 數(shù)據(jù)標準化處理 按照標準化處理公式，將單因素試驗結(jié)果和響應面試驗的結(jié)果進行數(shù)據(jù)標準化處理，最終得到2種指標成分的綜合評分。

1.2.7 單因素試驗設計 以藁本內(nèi)酯和阿魏酸2種成分提取含量作為綜合評分的考察指標，分別考察提取溶劑乙醇濃度、提取時間和液料比三個因素對藁本內(nèi)酯和阿魏酸提取率的影響。

1.2.8 響應面試驗設計 以上述優(yōu)化后的各單因素值為基礎，通過Design-Expert 10.0.4.0軟件Box-Behnken響應面設計，對乙醇濃度、液料比、提取時間3個因素結(jié)果進一步優(yōu)化，重復試驗，并進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系考察 分別以對照品的積分面積X與對照品溶液濃度Y做線性回歸，得出回歸方程分別為阿魏酸Y=7.007X+0.016，R2=0.999，線性范圍0.286～8.80 mg·mL-1;藁本內(nèi)酯Y=7.223X+0.211，R2=0.999，線性范圍0.767～23.6 mg·mL-1。A. 吡嗪; B. 阿魏酸對照品; C. 藁本內(nèi)酯對照品; D. 當歸提取物; 1. 阿魏酸定量峰; 2. 藁本內(nèi)酯定量峰; δ=8.66為內(nèi)標物吡嗪定量峰。

2.1.2 精密度考察 以對照品定量峰面積與內(nèi)標物定量峰面積的比值計算阿魏酸和藁本內(nèi)酯的RSD值分別為1.41%、0.34%。表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復性試驗 以樣品定量峰面積與內(nèi)標物定量峰面積的比值計算阿魏酸和藁本內(nèi)酯的RSD值分別為1.50%、1.54%，表明該方法具有良好的重復性。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 以樣品定量峰與內(nèi)標物定量峰面積比值計算阿魏酸和藁本內(nèi)酯的RSD值分別為2.21%、1.62%，表明供試品溶液24 h穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率試驗 阿魏酸和藁本內(nèi)酯的回收率分別為95.2%～102.3% （ RSD=2.91% ）和97.7%～103.7% （RSD=2.41% ），平均回收率分別為98.6%和100.24%，加樣回收率良好。

2.2 檢出限和定量限

計算得出：阿魏酸LOD=21.11 μg·mL-1，LOQ=63.97 μg·mL-1;藁本內(nèi)酯LOD=58.76 μg·mL-1，LOQ=178.07 μg·mL-1。

2.3 單因素實驗結(jié)果

表1為單因素試驗設計方案，平行提取3次。表2為數(shù)據(jù)標準化處理結(jié)果。從表2可以看出，綜合評分隨著乙醇體積分數(shù)的增大先上升隨后開始降低。當乙醇體積分數(shù)為80%左右時，綜合評分達到最高值，表明此時阿魏酸和藁本內(nèi)酯溶解度最大，因此選擇80%乙醇體積分數(shù)作為最優(yōu)選擇。液料比在大于12 mL·g-1后，綜合評分變化趨于平緩，表明溶劑中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量趨于平穩(wěn)，最佳液料比為12 mL·g-1時即可溶出大部分有效成分。綜合評分在10～30 min時逐漸增大，30 min左右趨于穩(wěn)定，40 min以后綜合評分有少許下降，因此30 min為最優(yōu)超聲時間。

2.4 響應面實驗結(jié)果

2.4.1 響應面實驗設計方案 以乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）作為該響應面實驗設計的三個自變量，以阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量的綜合評分作為響應值（R），采用Box-Behnken方法進行實驗設計，實驗設計方案和結(jié)果見表3。

2.4.2 模型顯著性分析 本研究采用Design-Expert 10.0.4.0軟件對表3中數(shù)據(jù)進行處理，經(jīng)擬合得到回歸方程為R=2.09+0.47 A+0.13 B+0.19 C-0.12 AB+0.44 AC-0.38 BC-3.29 A2-0.73 B2-0.43 C2，調(diào)整系數(shù)為0.992 7，決定系數(shù)（r2）=0.996 8，表明回歸方程擬合度好，實驗誤差小，此模型可用于該實驗的分析。

表4為方差分析和顯著性檢驗結(jié)果，結(jié)果說明乙醇濃度、液料比、提取時間和乙醇濃度與液料比、提取時間與液料比的交互作用對綜合評分有顯著的影響。各實驗因素對綜合評分影響順序為乙醇濃度（A）>液料比（C）>提取時間（B）。

2.4.3 最佳提取工藝參數(shù)預測及實驗驗證 通過圖2可知，乙醇濃度與液料比、 乙醇濃度與提取時間的3D曲面圖的傾斜度較高，說明因素間交互作用顯著，對當歸中兩種有效成分提取的影響較顯著。以阿魏酸和藁本內(nèi)酯兩種成分評分最大值為目標，由軟件分析，得出這兩種指標成分的最佳提取條件為乙醇濃度80.87%，液料比13.04 mL·g-1，提取時間30.14 min。為了方便實際操作，將提取條件參數(shù)進行合理修正：乙醇濃度81%，液料比13 mL·g-1，提取時間30 min，重復提取3次進行驗證，實驗結(jié)果如表5所示，綜合評分的平均值為2.20，與預測值2.14相差2.80%，說明該實驗方法準確度高，穩(wěn)定可靠，可用于當歸中2種成分的含量測定。

3 討論

本實驗使用不同濃度的乙醇和甲醇分別對當歸粉末進行提取，研究發(fā)現(xiàn)采用乙醇提取制備的浸膏中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量均比甲醇高，且由于乙醇毒性較小，更加綠色環(huán)保，適應于工業(yè)化生產(chǎn)，所以選擇乙醇作為提取溶劑。

氘代溶劑和內(nèi)標物質(zhì)的選擇：合適的氘代溶劑對樣品和內(nèi)標均應具有良好的溶解性。內(nèi)標應具有一個易于識別且不與待測峰重疊的譜峰。通過文獻比較和篩選實驗，選擇廉價易得、性質(zhì)穩(wěn)定、不與待測物質(zhì)發(fā)生反應、不與待測物的譜峰重疊的吡嗪作為內(nèi)標物，其氫核磁峰在8.66 ppm;此外，DMSO-d6能夠很好地溶解待測樣品和內(nèi)標物質(zhì)，且不與其他峰重疊，因此選擇DMSO-d6為溶劑。

本試驗通過對乙醇濃度、液料比、提取時間三個因素進行考察，結(jié)果顯示這三個單因素對當歸藥材中阿魏酸和藁本內(nèi)酯兩種成分同時提取有較大影響，并結(jié)合Box-Behnken中心組合設計試驗進行提取工藝優(yōu)化，優(yōu)選出最佳提取工藝，為當歸的有效開發(fā)利用提供參考。

目前當歸中有效成分含量測定主要采用HPLC法，其具有流動相配備復雜、檢測時間長、使用對照品等缺點。氫核磁共振定量法具有檢測速度快，準確性高，重現(xiàn)性好，無需昂貴的對照品，僅用少量廉價的內(nèi)標物質(zhì)即可同步對多種成分進行含量測定等優(yōu)點，已廣泛應用于中藥有效成分含量的測定（林珊等，2014;王志偉等，2016;Tanaka et al.，2017）。本研究采用氫核磁共振法同時測定當歸中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量，可以有效地降低成本，并且整個檢測過程在3 min左右即可完成。

4 結(jié)論

本文以中藥當歸為研究對象，以氫核磁定量方法測定當歸提取物中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量，以阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量的綜合評分為考察指標，采用單因素篩選結(jié)合Box-Behnken中心組合設計實驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

（1）當歸中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的最佳提取工藝為乙醇濃度80.87%，液料比13.04 mL·g-1，提取時間30.14 min，在此條件下，2種成分提取綜合評分為2.14。

（2）在最佳提取工藝條件下，測得當歸中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量分別為1.07 mg·g-1和6.98 mg·g-1，且該工藝條件操作簡單，重復性好，對當歸中有效成分提取有一定的參考價值。

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（責任編輯 李 莉）