盧昌華 鄧文靜 曾建榮 劉鍵鍾 張宏意 何夢(mèng)玲 嚴(yán)寒靜

摘 要： 法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase， FPPS）是廣藿香甲羥戊酸途徑中萜類物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶，其催化異戊二烯焦磷酸（IPP） 和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）合成萜類物質(zhì)前體法尼基焦磷酸。為了進(jìn)一步研究廣藿香萜類合成途徑的分子機(jī)制，該文通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得FPPS基因的cDNA序列，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)FPPS編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)果表明：（1）該序列的開放閱讀框全長(zhǎng)1 050 bp，編碼349個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為40 KD，等電點(diǎn)為5.43，存在一個(gè)結(jié)構(gòu)域，參與異戊二烯化合物的合成，不存在信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì);系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，廣藿香FPPS氨基酸序列和丹參（Salvia miltiorrhiza）、撒爾維亞（S. officinalis）的氨基酸序列親緣關(guān)系最近。（2）使用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建pET-32b-FPPS原核表達(dá)載體，并導(dǎo)入菌株BL21（DE3）中，考察不同濃度異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）對(duì)誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合表達(dá)蛋白以包涵體形式存在沉淀中，4個(gè)濃度的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)效果差異不明顯。（3）采用熒光定量技術(shù)分析0.10、0.25 mmol·L-1 MeJA對(duì)FPPS基因表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)0.10 mmol·L-1MeJA誘導(dǎo)后FPPS基因的表達(dá)量趨勢(shì)是先升高后降低再升高再降低;0.25 mmol·L-1 MeJA誘導(dǎo)后FPPS基因的表達(dá)量趨勢(shì)是先降低后升高再降低。因此，推測(cè)植物體內(nèi)MeJA濃度的變化能影響FPPS基因的表達(dá)，高濃度具抑制作用，低濃度具促進(jìn)作用。本研究為廣藿香萜類合成途徑的研究奠定基礎(chǔ)，以及為后續(xù)基因功能驗(yàn)證提供理論參考。

關(guān)鍵詞： 廣藿香， 法尼基二磷酸， 無縫克隆， 茉莉酸甲酯， 熒光定量PCR

中圖分類號(hào)： Q943 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2021）07-1155-10

Abstract： Farnesyl diphosphate synthase （FPPS）， a key enzyme for terpene biosynthesis in patchouli mevalonate pathway， catalyzes isoprene pyrophosphate （IPP） and dimethylallyl diphosphate pyrophosphate （DMAPP） into farnesyl pyrophosphate. In order to study the molecular mechanism of terpenoid synthesis pathway in patchouli， this study obtained the cDNA sequence of the FPPS gene by reverse transcription， and used bioinformatics softwares to predict the physicochemical properties， structure and function of the protein encoded by FPPS. The results were as follows： （1） The open reading frame of the sequence is 1 050 bp in length and encodes 349 amino acids. The predicted molecular weight of the expressed protein is 40 KD. The isoelectric point of the protein is 5.43. And there is a domain involved in the synthesis of isoprene compounds. There is no signal peptide in the protein， and its subcellular localization is in the cytoplasm. Phylogenetic analysis showed that the amino acid sequence of patchouli FPPS is closest to the amino acid sequence of Salvia miltiorrhiza and S. japonica. （2） In order to study the expression of FPPS protein， the effects of different concentrations of isopropyl-β-D-thiogalactoside on the expression of the fusion protein were examined. The results indicated that fusion-expressed protein was present in the form of inclusion bodies. And there was no significant differences in the expression of protein induced by four concentrations of IPTG. （3） In order to study the effects of methyl jasmonate （MeJA） on the expression of FPPS， this experiment used fluorescence quantitative technology to analyze the effects of 0.10 and 0.25 mmol·L-1 MeJA on the expression level of FPPS gene. The results found that the expression of FPPS gene after 0.10 mmol·L-1 MeJA induction was first increased， then decreased， then increased and then decreased. However， after 0.25 mmol·L-1 MeJA induction， the expression of FPPS gene tended to decrease first， then increase and then decrease. It is speculated that high concentrations of MeJA have an inhibitory effect， and low concentrations of MeJA have a promoting effect. This study lays the foundation for the research on terpenoid synthesis pathways of patchouli and provides a theoretical reference for subsequent gene function verification.

Key words： Pogostemon cablin， farnesyl pyrophosphate， seamless cloning， methyl jasmonate， qPCR

廣藿香來源于唇形科（Lamiaceae）刺蕊草屬（Pogostemon Desf.）植物廣藿香（Pogostemon cablin）的干燥地上部分，在我國(guó)海南地區(qū)和嶺南地區(qū)均有栽培，常用于治療暑濕導(dǎo)致的各種表證，也用于濕濁導(dǎo)致的胃脘不適。目前，廣藿香不僅作為一種藥用植物，同時(shí)也作為一種香料植物。廣藿香油含有140多種生物活性物質(zhì)，其中包括萜類化合物和類黃酮（Mallappa & Uma，2015），常用于緩解抑郁和壓力，鎮(zhèn)靜神經(jīng)，控制食欲，改善性欲;同時(shí)還具有殺蟲，抗菌和抗真菌的特性（Albuquerque et al.， 2013;Rocha et al.， 2018）。廣藿香醇作為廣藿香油的主要成分之一，是一種廣泛用于香水和化妝品的三環(huán)倍半萜化合物（Paul et al.， 2010），可作為紫杉醇的化學(xué)合成起始化合物（Blowman et al.， 2018）。近年來隨著廣藿香藥用價(jià)值不斷被挖掘，醫(yī)藥和香料行業(yè)對(duì)廣藿香的需求日益增加，因此，研究廣藿香中重要化合物合成的分子機(jī)制，提高廣藿香藥材中揮發(fā)油的含量，特別是廣藿香醇含量，具有重要意義。

異戊二烯基二磷酸合酶有兩種立體結(jié)構(gòu)，分別屬于E家族和Z家族，在E家族中，異戊二烯鏈中的碳原子在雙鍵的相反側(cè)（反式），其家族主要合成短鏈類異戊二烯;而對(duì)于Z家族，異戊二烯鏈中的碳原子在雙鍵的同一側(cè)（順式），主要合成長(zhǎng)鏈類異戊二烯。法尼基焦磷酸合酶是類異戊二烯途徑的主鏈延伸酶，屬于異戊二烯基二磷酸合酶的E家族。催化二甲基烯丙基（DMAPP）二磷酸（C5）的連續(xù)縮合和香葉基二磷酸（C10）的烴基加成到異戊烯基（IPP）二磷酸（C5）中，生成法尼基焦磷酸（FPP）的E-異構(gòu)體（C15）（Kellogg & Poulter，1998;Thulasiram & Poulter，2006） 。FPPS是類異戊二烯途徑合成化合物的分支點(diǎn)，相當(dāng)于化合物合成的發(fā)散點(diǎn)。因此，一旦FPPS活性或結(jié)構(gòu)的改變會(huì)使下游類異戊二烯化合物產(chǎn)生較大差異，使流向各個(gè)化合物分支的碳通量產(chǎn)生變化，從而影響到下游萜類物質(zhì)表達(dá)，所以FPPS在類異戊二烯代謝的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。FPPS除了是合成類異戊二烯的關(guān)鍵酶外，還在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。FPPS在成纖維細(xì)胞中的過表達(dá)也增加了Ras信號(hào)蛋白的法尼基化作用，并激活細(xì)胞外Ras/ERK信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（John et al.， 2002）。在藥物研究方面， FPPS酶可充當(dāng)藥物開發(fā)的分子靶標(biāo)。Beek et al.（1999）通過在牛腦上使用C14標(biāo)記甲羥戊酸，異戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸，證明了FPPS是含氮的雙膦酸酯NBps的細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。隨著對(duì)FPPS酶功能的深入研究，越來越多功能被挖掘，將有望提高其在藥品研發(fā)和生產(chǎn)中的作用，為前沿醫(yī)學(xué)研究做貢獻(xiàn)。

茉莉酸甲酯的母體結(jié)構(gòu)為環(huán)戊酮，是茉莉酸經(jīng)過甲酯化產(chǎn)生的化合物，作為植物體內(nèi)的內(nèi)源信號(hào)分子，在植物的新陳代謝、次生產(chǎn)物合成、抗病蟲害和抗逆性方面發(fā)揮重要作用（Fung et al.， 2004）。一般情況下，茉莉酸甲酯因?yàn)槠鋼]發(fā)性和分子特性，可以從植物的氣孔進(jìn)入植物體內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)距離的信號(hào)傳導(dǎo)和植物間的信息交流（徐偉和嚴(yán)善春，2004）。茉莉酸甲酯進(jìn)入植物體后進(jìn)一步被水解成茉莉酸，茉莉酸的產(chǎn)生會(huì)刺激不同種類的次生代謝產(chǎn)物的生物合成，比如生物堿尼古丁、異喹啉、硫代葡萄糖苷、花青素、倍半萜化合物青蒿素和萜類吲哚生物堿等。當(dāng)昆蟲啃食植物時(shí)，植物通過釋放特異性的應(yīng)激子，從而產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)參與到防御中，在這一系列的信號(hào)傳導(dǎo)中，茉莉酸被認(rèn)為是這一過程的核心物質(zhì)（Kessler et al.， 2004）。Thaler（1999）發(fā)現(xiàn)用茉莉酸處理過的煙草植株揮發(fā)性物質(zhì)的量會(huì)增加，在一定程度上提高了煙草害蟲被寄生蜂寄生的概率。Ozawa et al.（2009）和Zhou et al.（2009）研究發(fā)現(xiàn)利馬豆植株在經(jīng)過茉莉酸處理后能夠釋放萜類揮發(fā)物，從而引誘捕食性螨蟲來捕食葉螨、細(xì)須螨、跗線螨和癭螨等有害螨。

茉莉酸甲酯的信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)使植物揮發(fā)性物質(zhì)的增加，倍半萜類化合物是揮發(fā)性物質(zhì)的重要組成成分，而法尼基焦磷酸又是合成倍半萜化合物的重要前體物質(zhì)，因此，研究茉莉酸甲酯對(duì)法尼基焦磷酸基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)于揭示茉莉酸甲酯在植物之間的信號(hào)傳導(dǎo)及植物發(fā)揮抗病蟲害的機(jī)制具有重要作用。

本研究對(duì)廣藿香的FPPS基因進(jìn)行克隆，采用無縫克隆構(gòu)建pET-32b-FPPS原核表達(dá)載體，進(jìn)行原核蛋白小量表達(dá)，并對(duì)FPPS進(jìn)行生物信息學(xué)分析;與此同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)研究茉莉酸甲酯對(duì)FPPS基因表達(dá)量的影響，以期對(duì)進(jìn)一步研究廣藿香的倍半萜生物合成途徑及茉莉酸甲酯對(duì)FPPS的調(diào)控表達(dá)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 廣藿香葉片

廣藿香植株種源來自海南省儋州市，移栽至廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院種植，經(jīng)劉基柱副教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香（Pogostemon cablin）。

1.2 菌株

大腸桿菌感受態(tài)DH5α、蛋白表達(dá)菌株BL21（DE3）均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.3 儀器和試劑

儀器：電子天平CP214（奧豪斯儀器有限公司）;紫外微分光光度計(jì)（K5500Plus，北京凱奧科技發(fā)展有限公司）;PCR儀T100（Bio-Rad Laboratories， Inc）;電泳儀DYCP-31CN（北京六一生物科技有限公司）;凝膠成像儀Tocan320（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）;藍(lán)光切膠儀BD-BGC1（無錫博弗瑞德生物科技有限公司）;冷凍離心機(jī)3K15（SIGMA）;恒溫?fù)u床QYC-200（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;熒光定量PCR儀（Biorad CFX96）;細(xì)胞破碎儀（SONICS VCX750）。

試劑：TRIpure Reagent（北京艾德萊生物科技有限公司）;FastKing一步法RT-PCR試劑盒;瓊脂糖（Biowest 公司）;DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒;pGM-T Fast ligation kit（天根生化科技有限公司）;SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒、Evo M-ML V RT試劑盒（艾科瑞生物）;6×protein loading buffer、Blue Plus Protein Marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;pET-32b質(zhì)粒、SE無縫克隆和組裝試劑盒、DL2000 Marker、ExRed核酸電泳染料（北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司）。

2 方法

2.1 廣藿香總RNA的提取

按照TRIpure Reagent試劑盒說明書提取RNA，根據(jù)FastKing一步法RT-PCR試劑盒得到cDNA，將產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的片段，并測(cè)定cDNA的濃度和純度，-20 ℃保存。

2.2 FPPS基因的T-A克隆

按pGM-T Fast ligation 試劑盒說明書進(jìn)行T-A克隆。導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，用引物FPPS-F：ATGGCGAATCCGAACGGAGC，F(xiàn)PPS-R：TTATTTCT

GTCTCTTGTAAATCTTGCC進(jìn)行菌液PCR鑒定。取陽性克隆菌液過夜培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，檢測(cè)濃度及純度，取適量質(zhì)粒送擎科生物科技有限公司測(cè)序，剩余質(zhì)粒-20 ℃保存，測(cè)序結(jié)果使用contigeexpress軟件進(jìn)行序列拼接，并用Blastn進(jìn)行序列比對(duì)。

2.3 無縫克隆構(gòu)建pET-32b-FPPS原核表達(dá)載體

2.3.1 FPPS基因和pET-32b載體同源臂的引入 FPPS基因PCR反應(yīng)體系：pGM-T-FPPS重組質(zhì)粒（100 ng·μL-1）1 μL，引物FPPS-pET-F（10 μmol·L-1）1.25 μL，引物FPPS-pET-R（10 μmol·L-1）1.25 μL，PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。（引物FPPS-pET-F： ACGACGACG

ACAAGGCGAATCCGAACGGAG，引物FPPS-pET-R：AGGGGTTATGCTAGTTATTTCTGTCTCTTG）

pET-32b載體PCR反應(yīng)體系：pET-32b載體（60 ng·μL-1）1 μL，引物pET-F（10 μmol·L-1）1.25 μL，引物pET-R（10 μmol·L-1）1.25 μL，PrimeSTAR Max DNA Polymerase 25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。（引物pET-F：GAGACAGAAATAACT

AGCATAACCCCTTGG，pET-R：CGTTCGGATTCGCC

TTGTCGTCGTCGTCGGTAC）

FPPS基因和pET-32b載體PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸6 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收，并檢測(cè)濃度及純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 FPPS基因與pET-32b線性化載體的環(huán)化 按照無縫克隆試劑盒說明書對(duì)FPPS基因和pET-32b線性化載體進(jìn)行環(huán)化，環(huán)化后導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆，挑取單菌落小量培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽性克隆菌株培養(yǎng)后提取質(zhì)粒后送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果拼接后與T-A克隆測(cè)序結(jié)果比對(duì)，同時(shí)確認(rèn)目的條帶插入位點(diǎn)是否準(zhǔn)確。

2.4 廣藿香FPPS蛋白的小量表達(dá)

分別考察20 ℃不同濃度的IPTG（1.0、0.75、0.5、0.25 mmol·L-1）誘導(dǎo)下蛋白的表達(dá)情況。

分別取50 μL各濃度IPTG誘導(dǎo)得到的上清、沉淀和對(duì)照空白菌液，加入10 μL 6×蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min，取10 μL樣品進(jìn)行電泳。電泳條件為80 V， 20 min;120 V，80 min?？傠娪緯r(shí)長(zhǎng)100 min。

電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)染色過夜，脫色后進(jìn)行拍照。

2.5 廣藿香FPPS基因的生物信息學(xué)分析

采用Expasy在線分析平臺(tái)對(duì)FPPS編碼的蛋白進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行分析;采用TMHMM 2.0預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu);使用SignalP 5.0在線預(yù)測(cè)蛋白是否含有信號(hào)肽;使用ProtComp 9預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位;使用SOPMA預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域;使用SWISS-MODEL在線軟件，基于同源建模的方法，構(gòu)建FPPS的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

利用MEGA 7.0軟件將本實(shí)驗(yàn)獲得的FPPS基因編碼的氨基酸序列和GenBank上收錄的其他植物61種植物的FPPS基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.6 MeJA對(duì)廣藿香FPPS表達(dá)量的影響

2.6.1 材料的選取及處理 取30株扦插半年、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的廣藿香，搬至恒溫室中培養(yǎng)數(shù)天以使植物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，配制好0.10、0.25 mmol·L-1茉莉酸甲酯溶液，均勻噴灑在植物葉片上，覆上保溫膜1 h，于2019年8月26號(hào)9點(diǎn)開始取樣，分別于0、2、6、12、24、48、72 h采摘成熟的葉片，迅速置于液氮中速凍后放于-80 ℃冰箱保存。

2.6.2 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 RNA提取和2.1方法一致，cDNA第一鏈合成根據(jù)Evo M-ML V RT試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6.3 引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證 根據(jù)廣藿香FPPS基因和內(nèi)參基因18S rRNA 的mRNA序列，采用CmSuite8軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。QFPPS-F：AGGTCCCTAAGGTTGGTA

TG;QFPPS-R： GGAACTCCACCTCATTGAAC。內(nèi)參基因18S引物18S-F： TCAACCATAAACGATGC

CGACC;18S-R：TTTCAGCCTTGCGACCATACTCC。驗(yàn)證FPPS及內(nèi)參基因使用10 μL體系，RT-PCR程序?yàn)轭A(yù)變性98 ℃，30 s;變性98 ℃，10 s;復(fù)性53 ℃，30 s;延伸72 ℃，1 min;終延伸72 ℃，7 min;中間3步進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后使用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2.6.4 熒光定量PCR反應(yīng) 熒光定量PCR反應(yīng)按SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒的說明書進(jìn)行，樣本和內(nèi)參都設(shè)置了3個(gè)平行，在96孔板中進(jìn)行，以1 mL無水乙醇稀釋同樣倍數(shù)后噴灑于廣藿香作為對(duì)照組。

2.6.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，使用2-ΔΔCT法對(duì)熒光定量的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，基因的表達(dá)量為2-ΔΔCT，處理組和對(duì)照組的ΔCT=目標(biāo)基因的CT值-同一樣本內(nèi)參基因的CT值，ΔΔCT=處理組的ΔCT-對(duì)照組的ΔCT，最后利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 廣藿香總RNA的提取與FPPS的cDNA的合成

提取到3個(gè)平行組的總RNA完整性都較好，OD260/280為1.8，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示18 S、28 S條帶清晰，能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要，具體如圖1所示。使用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到的cDNA進(jìn)行電泳顯示在1 000～1 500 bp之間有清晰明亮的條帶，如圖2所示。

3.2 廣藿香FPPS基因的T-A克隆

構(gòu)建完T載體后，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證陽性克隆，將陽性克隆菌株培養(yǎng)后提取質(zhì)粒后送擎科生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示與NCBI上其他植物的FPPS基因有很高匹配度，上傳到GenBank，登錄號(hào)為MN326318。

3.3 無縫克隆構(gòu)建原核表達(dá)載體

FPPS基因和pET-32b載體引入同源臂后，使用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示FPPS基因在1 000～1 500 bp有明顯條帶，pET-32b載體片段在5 500處有一清晰明亮條帶，具體如圖3所示。無縫克隆后再轉(zhuǎn)入DH5α，挑取8個(gè)菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，8個(gè)菌落全部轉(zhuǎn)化成功，具體如圖4所示。

3.4 FPPS蛋白的表達(dá)

控制20 ℃、130 r·min-1，分別對(duì)含有0、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol·L-1 IPTG的菌液誘導(dǎo)6 h進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pET-32b-FPPS菌株表達(dá)的蛋白為硫氧還蛋白-FPPS融合蛋白，分子量為50 KD左右，從圖5可明顯看出，融合蛋白沒有在上清表達(dá)，而是以包涵體形式存在于沉淀。在20 ℃不同濃度IPTG誘導(dǎo)下可看出，融合蛋白在的表達(dá)量沒有顯著差異。

3.5 生物信息學(xué)分析

FPPS基因的開放閱讀框全長(zhǎng)為1 050 bp，編碼349個(gè)氨基酸。與其他61種植物的FPPS氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，廣藿香的FPPS氨基酸序列與同為唇形科的丹參和撒爾維亞氨基酸序列的親緣關(guān)系最近，聚為一支，可信度為84%，它們與杜仲科、毛茛科、龍膽科、蘭科植物聚為一大類;其他植物大都以同科屬聚為一類。具體如圖6所示。

FPPS基因編碼的蛋白質(zhì)的分子量為40 KD，等電點(diǎn)為5.43。氨基酸組成中，酸性氨基酸（Asp，Glu）占14.1%，堿性氨基酸（Lys，Arg）占11.7%，極性氨基酸（Asn，Cys，Gln， Ser，Thr，Tyr）占26%，疏水氨基酸占35.2%，負(fù)電荷殘基占49%，正電荷殘基占41%。脂肪系數(shù)為91.89，不穩(wěn)定系數(shù)為34.47，在酵母體內(nèi)半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h，推測(cè)其蛋白質(zhì)比較穩(wěn)定。TMHMM 2.0預(yù)測(cè)蛋白全部位于膜外，無跨膜區(qū)域。使用PSORTⅡ在線軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。

SOPMA預(yù)測(cè)FPPS氨基酸序列共有4種二級(jí)結(jié)構(gòu)。其中：α螺旋氨基酸有214個(gè)，占氨基酸總數(shù)的61.32%;參與鏈延伸的氨基酸，有25個(gè)，占7.16%;β轉(zhuǎn)角氨基酸有9個(gè)，占氨基酸總數(shù)的2.58%;無規(guī)則卷曲有101個(gè)氨基酸參與，占氨基酸總數(shù)的28.94 %。具體如圖7所示。

使用SMART在線軟件預(yù)測(cè)FPPS基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FPPS有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，包含266個(gè)氨基酸殘基，從39至304（aa序列），可能參與異戊二烯化合物的合成。

使用SignalP 5.0預(yù)測(cè)FPPS蛋白不具有脂蛋白信號(hào)肽（Sec/SPⅡ）、Tat信號(hào)肽（Tat/SPI）或其他信號(hào)肽。

采用SWISS-MODEL軟件對(duì)FPPS蛋白進(jìn)行同源建模，以單萜合酶FDS-5和葉綠體-法尼基焦磷酸合酶1的嵌合體（SMTL ID ： 4kk2.1，相識(shí)度：75.66%）為模板蛋白，構(gòu)建FPPS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。GMQE值（Global Model Quality Estimation）為0.86（GMQE評(píng)分區(qū)間為0～1，越靠近1表示模型越可靠）;QMEAN值（Qualitative Model Energy Analysis）為-0.35（QMEAN 值在0附近，表明模型結(jié)構(gòu)與相似尺寸的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)具有良好的一致性。-4.0或以下的分?jǐn)?shù)表示模型質(zhì)量較差），從兩個(gè)值可以看出構(gòu)建的3D模型比較可靠，可以較好預(yù)測(cè)FPPS蛋白結(jié)構(gòu)。具體如圖8所示。

3.6 茉莉酸甲酯對(duì)FPPS基因表達(dá)量的影響

以對(duì)照組的FPPS基因的表達(dá)量為1。0.10 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下48、72 h FPPS的表達(dá)量與對(duì)照組有極顯著性差異;0.25 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下48 h FPPS的表達(dá)量與對(duì)照組有極顯著性差異。兩個(gè)濃度的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下的FPPS基因的表達(dá)量均在48 h達(dá)到最高。0.10 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下的FPPS基因表達(dá)量的趨勢(shì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間先升高后降低再升高后降低;0.25 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下的FPPS基因表達(dá)量的趨勢(shì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間先降低后升高再降低。具體如圖9所示。

4 討論與結(jié)論

4.1 FPPS蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

FPPS基因預(yù)測(cè)編碼的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5.43，本實(shí)驗(yàn)做小量表達(dá)發(fā)現(xiàn)蛋白在沉淀中以包涵體存在，因此，如果后續(xù)做包涵體的復(fù)性和純化實(shí)驗(yàn)，復(fù)性溶液配制時(shí)pH要盡量高于等電點(diǎn)，避免復(fù)性后出現(xiàn)沉淀;蛋白的亞細(xì)胞定位和跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果表明FPPS基因只存在于細(xì)胞質(zhì)中，這與馬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)等（2015）的報(bào)道結(jié)果相吻合，這有利于后續(xù)學(xué)者研究廣藿香相關(guān)萜類合成部位和進(jìn)行定向轉(zhuǎn)基因，比如，使用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽將FPPS基因和下游基因?qū)肴~綠體中，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)萜類化合物在葉綠體的大量表達(dá)。SMART預(yù)測(cè)結(jié)果表明FPPS有一個(gè)參與異戊二烯化合物合成的結(jié)構(gòu)域，從結(jié)構(gòu)上看，底物二甲丙稀基焦磷酸和異戊稀基焦磷酸均為C5結(jié)構(gòu)，而法尼基焦磷酸為C15結(jié)構(gòu)，并且為直鏈產(chǎn)物，所以該結(jié)構(gòu)域可能參與碳鏈的連接，先催化底物生成10個(gè)C的牻牛兒基焦磷酸后再生成C15的法尼基焦磷酸。

4.2 茉莉酸甲酯對(duì)FPPS基因的調(diào)控效果

植物體內(nèi)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量往往受到時(shí)間、空間和溫度的影響，并且同一植物的不同部位其表達(dá)量也有一定的差異性，劉璐等（2016）通過實(shí)時(shí)熒光定量分析1 d中8個(gè)不同時(shí)間段的廣藿香醇合酶基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間段基因的表達(dá)量有很大差異，并且在3點(diǎn)時(shí)廣藿香醇合酶基因表達(dá)量最高。吳耀生等（2007）發(fā)現(xiàn)在一年生的三七中，鯊烯合酶基因的表達(dá)量是根>蘆頭>莖。本次實(shí)驗(yàn)只針對(duì)茉莉酸甲酯對(duì)成熟葉片中FPPS基因表達(dá)量的影響，并在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)同一時(shí)間同一樣品都提取多個(gè)RNA后進(jìn)行混合，減少實(shí)驗(yàn)過程中葉片個(gè)體差異。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)不同成熟度的葉片（老葉、嫩葉、成熟葉）進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步了解MeJA對(duì)植物萜類合成的作用機(jī)制。

外源施加的MeJA對(duì)FPPS基因的表達(dá)量密切相關(guān)。FPPS基因的表達(dá)量在施噴0.10 mmol·L-1 MeJA后先升高后降低再升高再降低，而在施噴0.25 mmol·L-1 MeJA后FPPS基因的表達(dá)量是先降低后升高再降低。

在0.25 mmol·L-1 MeJA誘導(dǎo)下，植物吸收大量MeJA后，在0、2、6 h階段FPPS基因表達(dá)量出現(xiàn)抑制情況，MeJA在植物體內(nèi)降解后FPPS表達(dá)量在12、24、48 h階段是升高的，說明這一階段的茉莉酸甲酯濃度能促進(jìn)FPPS基因的表達(dá)，進(jìn)一步降解后FPPS表達(dá)量降低，植物慢慢恢復(fù)原有水平。

在0.10 mmol·L-1 MeJA誘導(dǎo)下，植物吸收MeJA的量比較少，在2 h時(shí)還未出現(xiàn)抑制狀態(tài)，因此，在2 h時(shí)FPPS基因表達(dá)量在是先升高的，植株逐漸吸收MeJA后濃度達(dá)到一定水平，出現(xiàn)了抑制，F(xiàn)PPS基因表達(dá)量在6、12、24 h階段是逐步降低的，植物對(duì)茉莉酸甲酯降解后達(dá)到適宜濃度，MeJA濃度對(duì)FPPS表達(dá)量又出現(xiàn)了促進(jìn)作用，在48 h時(shí)FPPS基因表達(dá)量升高，進(jìn)一步降解后，72 h時(shí)表達(dá)量降低。

茉莉酸甲酯濃度越高，植物富集的越快，更快出現(xiàn)抑制情況。綜合兩個(gè)濃度的MeJA對(duì)FPPS基因表達(dá)量的影響可以推測(cè)在植物體內(nèi)高濃度的茉莉酸甲酯會(huì)抑制FPPS基因的表達(dá)，低濃度茉莉酸甲酯能促進(jìn)FPPS基因的表達(dá)。

在萜類生物合成的途徑中，轉(zhuǎn)錄因子通過與相關(guān)的合成酶基因5′端上游的啟動(dòng)子元件相互結(jié)合，從而抑制或增強(qiáng)相關(guān)萜類的合成。此外，轉(zhuǎn)錄因子還可以對(duì)代謝通路上多個(gè)其他靶點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)調(diào)控，使其他基因的表達(dá)也受到影響并使基因表達(dá)趨向于產(chǎn)生相類似的代謝產(chǎn)物，從而達(dá)到多個(gè)靶點(diǎn)調(diào)控的作用（Aharoni & Galili，2011）。雖然，隨著醫(yī)藥行業(yè)的高速發(fā)展，萜類物質(zhì)在臨床上的作用不斷被挖掘，使萜類化合物的需求量逐漸增加，但是，由于萜類化合物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使化學(xué)合成遇到極大阻礙，目前大部分萜類化合物只能依靠從原植物中提取獲得。因此，從分子水平上來調(diào)控原植物中萜類的代謝從而提高萜類化合物產(chǎn)量成為科研工作者的研究熱點(diǎn)，而從關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控更是研究的必然趨勢(shì)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）