孫博 霍華珍 蔡愛華 謝運(yùn)昌 李海云 李典鵬

摘 要： 建立HPLC法同時測定大果山楂果實中原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、p-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸的方法，并通過HPLC法分析這八種酚酸在不同產(chǎn)地大果山楂果實中的含量。采用ZORBAX SB-C18色譜柱，以甲醇/1.5%甲酸水溶液（v/v）為流動相，梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長280、320 nm。結(jié)果表明：（1）在線性范圍內(nèi)八種酚酸質(zhì)量濃度與色譜峰峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均>0.997，檢出限0.08～0.20 μg·mL-1，定量下限 0.27～0.67 μg·mL-1，變異系數(shù)均<5.0%，加標(biāo)回收率99.3%～103.3%;（2）10個不同產(chǎn)地的大果山楂果實中酚酸含量豐富，均檢出原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、阿魏酸和肉桂酸七種酚酸，其中，二氫咖啡酸、根皮酸、阿魏酸均為首次檢出，以綠原酸為主（8 410.2～13 826.7 μg·g-1），占總酚酸的80%以上，總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10 187.8～15 583.9 μg·g-1之間，其中廣西百色靖西和桂林恭城產(chǎn)的果實總酚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高，均大于15 000 μg·g-1。綜上結(jié)果表明，該研究的HPLC法適用于大果山楂果實中酚酸含量的測定，可為大果山楂優(yōu)良品種的選育、產(chǎn)品質(zhì)量控制及深度開發(fā)利用提供方法和科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞： HPLC， 大果山楂， 果實， 酚酸， 含量

中圖分類號： Q946 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1135-10

Abstract： The contents of phenolic acids in Malus doumeri fruits from different production areas were investigated， and at the same time， HPLC method was developed to detect eight phenolic acids， including protocatechuic acid， chlorogenic acid， dihydrocaffeic acid， caffeic acid， phloretic acid， p-coumaric acid， ferulic acid and cinnamic acid. ZORBAX SB-C18 column was adopted. The mobile phase was composed of methanol and 1.5% formic acid aqueous with a gradient elution. The column temperature was 35 ℃， the flow rate was 1.0 mL·min-1， the detection wavelength was 280， 320 nm， and the injection volume was 20 μL. The results were as follows： （1） Linear relationship between the mass concentration and the peak area of the chromatogram of eight phenolic acids good， with the correlation coefficient > 0.997， the detection limit 0.08-0.20 μg·mL-1， the lower limit of quantitation 0.27-0.67 μg·mL-1， the coefficient of variation <5.0%， and the adding standard recovery 99.3%-103.3%. （2） Seven phenolic acids （protocatechuic acid， chlorogenic acid， dihydrocaffeic acid， caffeic acid， phloretic acid， ferulic acid and cinnamic acid） were detected over ten samples in different production areas. Among the seven phenolic acids， dihydrocaffeic acid， phloretic acid and ferulic acid were detected in M. doumeri fruits for the first time， and chlorogenic acid （8 410.2-13 826.7 μg·g-1） was predominant， accounting for more than 80% of the total phenolic acids. The mass fraction of total phenolic acids ranged from 10 187.8 to 15 583.9 μg·g-1. The mass fraction of total phenolic acids from fruits picked from Jingxi of Baise and Gongcheng of Guilin in Guangxi was relatively high， more than 15 000 μg·g-1. The above results indicate that the HPLC method used in this study is suitable for the determination of phenolic acids contents in M. doumeri fruit， and can provide methods and scientific basis for screening superior variety， products quality control， and deep exploitation and utilization of M. doumeri fruits.

Key words： HPLC， Malus doumeri， fruits， phenolic acids， content

大果山楂，又名澀梨、廣山楂等，為薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus Mill.）植物臺灣林檎（M. doumeri ）或光萼林檎（M. leiocalyca ）的果實，主要分布于中國南部廣西、福建、臺灣等地，廣西逐步成為大果山楂臺灣林檎人工栽培主產(chǎn)區(qū)（王雷宏等，2012;曾勇豪等，2014;黃欣欣，2015）。大果山楂含有豐富的營養(yǎng)成分和活性成分，具有降脂、保肝和抗腫瘤等生理功效（Zhu et al.， 2019;趙帥等，2020），是廣西道地藥材之一（鄧家剛和韋松基，2007），為壯藥，其果實酸甜，可加工成果糕、果酒等地方特色食品，具有廣闊的開發(fā)利用前景（廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，2011;張巧等，2018;郭婷等，2019）。但大果山楂物質(zhì)基礎(chǔ)研究不夠深入，缺乏科學(xué)、合理的質(zhì)量評價方法，阻礙了其深度開發(fā)和利用（溫玲蓉，2016;趙帥等，2020）。

酚酸類化合物是含有活潑氫供體結(jié)構(gòu)的酚羥基有機(jī)酸，具有抗氧化、抗菌和抗病毒等多種生物活性，是大果山楂果實中重要的功效成分之一（溫玲蓉，2016;Choi et al.， 2017;陳志杰等，2018），定性定量分析大果山楂果實的酚酸類組成及含量對評價果實的品質(zhì)并促進(jìn)其深度加工利用具有重要意義?，F(xiàn)有多種分析酚酸類化合物的方法，而高效液相色譜法（HPLC）因具有準(zhǔn)確度高、經(jīng)濟(jì)簡便等優(yōu)點(diǎn)被檢測領(lǐng)域廣泛使用（李巖等，2018;鄧渝等，2018;屈艷勤等，2019）。目前，對大果山楂果實中酚酸類成分進(jìn)行定性定量分析的報道較少，僅有Wen et al.（2016）采用HPLC法測定了果實中綠原酸、咖啡酸、肉桂酸三種酚酸的含量，且分離效果仍有待改進(jìn)。本研究建立HPLC法同時測定大果山楂果實中原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、p-香豆酸、阿魏酸和肉桂酸的方法，并比較分析這八種酚酸在不同產(chǎn)地大果山楂果實中的含量，以期為大果山楂優(yōu)良品種的選育、原料和產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及深度開發(fā)和利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大果山楂樣品采自10個不同產(chǎn)地的新鮮果，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所李典鵬研究員和黃渝松副研究員鑒定，均為臺灣林檎（Malus doumeri） 果實，具體見表1。選擇無病蟲害、無機(jī)械損傷且成熟度基本一致的樣品，在溫度4 ℃、濕度78%左右環(huán)境中貯藏。

原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、肉桂酸、p-香豆酸、阿魏酸、二氫咖啡酸和根皮酸對照品（純度≥98%），西安玉泉生物科技有限公司;甲醇、乙腈（色譜純），安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?氫氧化鈉、鹽酸、甲酸（AR），西隴化工股份有限公司;乙酸乙酯、乙醚（AR），天津市大茂化學(xué)試劑廠;EDTA、抗壞血酸（AR），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

1.2 儀器和設(shè)備

Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（配有Prominence SPD-M20A PDA檢測器），日本島津公司;高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司;真空冷凍干燥機(jī)，上海喬楓實業(yè)有限公司;RIOS 8超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司;XS205DU電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司;F-020ST數(shù)控超聲波清洗機(jī)，深圳福洋科技集團(tuán)有限公司;LHS智能恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社;BCD-213D11D雙門冰箱，廣東容聲電器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 1.5%甲酸水溶液的配制：取15.0 mL甲酸，超純水定容至1.0 L，用0.45 μm水相膜過濾，超聲5 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。酚酸單一對照品儲備液的配制：分別精確稱取20.0 mg的原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、肉桂酸、p-香豆酸、阿魏酸、二氫咖啡酸和根皮酸對照品，置于25 mL 棕色容量瓶中，并用色譜甲醇溶解后定容至刻度，得到800.0 μg·mL-1的單一對照品儲備液，置于-20 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。樣品稀釋液的配制：?.5%甲酸水溶液95 mL，加入5 mL色譜甲醇，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用?；旌戏铀釋φ掌饭ぷ饕旱呐渲疲旱攘恳迫?種單一對照品儲備液，充分混勻后，用樣品稀釋液稀釋至0.05～100 μg·mL-1的系列混合酚酸對照品溶液，過0.45 μm有機(jī)濾膜，超聲脫氣5 s，現(xiàn)配現(xiàn)用。堿提取液：分別先配成4 mol·L-1 NaOH、1%抗壞血酸和10 mmol·L-1 EDTA 溶液，將三者按120∶2∶3的比例添加后混勻;萃取液：乙醚和乙酸乙酯按體積比1∶1混勻即可。

1.3.2 大果山楂果實總酚酸的提取及分析前樣品預(yù)處理

1.3.2.1 總酚酸的提取 參照文獻(xiàn)方法（Luo et al.， 2013; 李巖等，2018;匡鳳元等，2019），稍作改進(jìn)。將新鮮的大果山楂果實切成小塊，凍干磨成粉。酚酸有機(jī)溶劑提?。悍Q取粉末樣品2.000 g，加入80%甲醇水溶液40 mL，常溫浸提24 h，40 ℃超聲提取 30 min，過濾，10 000 r·min-1 離心 5 min，濾渣重復(fù)提取2次，合并上清液得到A提取液。堿提?。簩⑸鲜鲞^濾得到的殘渣和離心得到的沉淀合并后加入50 mL堿提取液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)并密封條件下室溫攪拌約24 h，用HCl調(diào)節(jié)pH為2.0，用60 mL萃取液萃取三次，合并萃取液10 000 r·min-1 離心5 min，得到B提取液。酸提?。豪^續(xù)將上述堿處理過的殘渣和沉淀在85 ℃下用50 mL HCl（4 mol·L-1）水解30 min，冷卻后用NaOH調(diào)節(jié)pH為2.0，其余同堿提取方法，得到C提取液。合并A、B、C三種提取液即為總酚酸提取液。

1.3.2.2 分析前樣品預(yù)處理 將1.3.2.1得到的總酚酸提取液50 ℃真空旋蒸干，用色譜甲醇溶解并定容至25.0 mL，進(jìn)樣前用樣品稀釋液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)的濃度，10 000 r·min-1離心5 min，過0.45 μm有機(jī)濾膜備用。

1.3.3 色譜條件優(yōu)化及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 ?檢測波長：取八種酚酸對照品儲備液各50 μL，單獨(dú)稀釋成80.0 μg·mL-1，分別在波長190～400 nm之間掃描紫外光譜，選擇有較大吸收且無溶劑干擾的波長作為檢測波長。色譜柱：選用四種不同填料的反相色譜柱（Symmetry C18、Atlantis T3、BEH C18和ZORBAX SB-C18），分析80.0 μg·mL-1的混合酚酸對照品工作液，選擇分離度和峰型相對較好的色譜柱。流動相及檢測條件：以甲醇-水溶液或乙腈-水溶液為流動相，改變水溶液的酸種類和濃度、梯度洗脫程序、柱溫和流速，以對照品各色譜峰之間的分離度、樣品中主要目標(biāo)組分的理論塔板數(shù)以及樣品中目標(biāo)組分與干擾峰的分離效果評價系統(tǒng)適應(yīng)性，并確定較優(yōu)的色譜條件。

1.3.4 方法學(xué)驗證方法

1.3.4.1 線性關(guān)系和靈敏度試驗 將混合酚酸對照品工作液按1.3.3優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行檢測，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制八種酚酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性方程和線性范圍，以信噪比（S/N）為3時，確定檢出限（LOD），S/N為10時，確定定量下限（LOQ）（陳丹丹等，2019），重復(fù)6次。

1.3.4.2 精密度試驗 精密吸取40.0 μg·mL-1混合酚酸對照品工作液，處理方法同1.3.4.1，連續(xù)進(jìn)樣檢測6次，以色譜峰面積計算每個酚酸的變異系數(shù)（RSD）值。

1.3.4.3 穩(wěn)定性試驗 移取5.0、20.0、60.0 μg·mL-1混合酚酸對照品工作液，處理方法同1.3.4.1，在1 d內(nèi)進(jìn)樣檢測6次，時間間隔4 h;在6 d內(nèi)，每日同一時間點(diǎn)進(jìn)樣1次。按照1.3.4.2方法計算每個酚酸日內(nèi)和日間的RSD值。

1.3.4.4 重復(fù)性試驗 精密稱取1.3.2.1方法制備的大果山楂凍干粉2.000 g，共6份，分別按1.3.2的方法提取酚酸并進(jìn)行樣品預(yù)處理，進(jìn)樣檢測，按照1.3.4.2方法計算每個酚酸的RSD值。

1.3.4.5 加標(biāo)回收率的測定 精密稱取1.3.2.1方法制備的大果山楂凍干粉1.000 g，以原有目標(biāo)化合物量的150%、100%、50%加入8個酚酸對照品溶液，按照1.3.2的方法提取酚酸并進(jìn)行樣品預(yù)處理，進(jìn)樣檢測，重復(fù)3次，將得到的色譜峰面積代入線性方程，根據(jù)樣品和加標(biāo)樣品的濃度計算每個酚酸的加標(biāo)回收率和RSD值。

1.3.4.6 樣品色譜圖分析 移取1.3.2.2制備的樣品進(jìn)行檢測，比較單一對照品的保留時間并結(jié)合相應(yīng)的紫外光譜對樣品中目標(biāo)組分進(jìn)行定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和峰面積計算對應(yīng)樣品中每個酚酸的含量，重復(fù)6次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析（ANOVA），Adobe Photoshop cc 2019軟件對圖像進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇 酚酸單一對照品紫外掃描的結(jié)果表明：原兒茶酸、二氫咖啡酸、根皮酸和肉桂酸在280 nm附近有最大吸收峰;綠原酸、咖啡酸、p-香豆酸和阿魏酸在320 nm附近有最大吸收峰。因此，選擇280、320 nm作為檢測波長。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化結(jié)果及對照品和樣品色譜圖分析 色譜柱是HPLC檢測分析的核心部件，其性能發(fā)揮受到分析樣品的化學(xué)組成和理化性質(zhì)的影響（李旻昊等，2019）。四種反相色譜柱研究結(jié)果表明，ZORBAX SB-C18色譜柱在同一分析條件下目標(biāo)組分峰形相對較好，因此，選擇該色譜柱用于本實驗后續(xù)進(jìn)一步的研究。流動相是影響HPLC分離效果的重要因素，甲醇-水溶液或乙腈-水溶液是酚酸類成分分析采用較多的流動相，在水溶液中添加適量濃度的酸對改善樣品的分離度和峰形有明顯的效果，甲酸或乙酸比較常用（王曉梅等，2016;鄧寶安等，2017;李巖等，2018;鄧渝等，2018;匡鳳元等，2019;屈艷勤等，2019）。比較甲醇、乙腈、甲酸水溶液和乙酸水溶液對目標(biāo)組分的分離效果，結(jié)果表明：以0.1%乙酸水溶液為流動相時，甲醇和乙腈的分離效果均不理想，綠原酸和二氫咖啡酸大部分重疊，而以0.1%甲酸水溶液為流動相時，甲醇和乙腈均能改善綠原酸和二氫咖啡酸的分離效果，兩者的分離度分別為1.0和0.8，甲醇稍優(yōu)于乙腈，但隨著綠原酸和二氫咖啡酸的分離，相鄰咖啡酸與二氫咖啡酸的分離度只能達(dá)到1.2。以甲醇為流動相，進(jìn)一步研究不同濃度的甲酸水溶液對目標(biāo)組分分離效果的影響，當(dāng)甲酸水溶液為1.0%時，八種對照品酚酸之間的分離度可達(dá)到1.5，基線平穩(wěn)且色譜峰峰形較好，因此，選擇甲醇-甲酸水溶液作為流動相。

準(zhǔn)確地對目標(biāo)成分進(jìn)行定性和定量分析，不僅對照品的分離度需要滿足要求，也需考慮樣品中的目標(biāo)成分是否與干擾峰實現(xiàn)到有效分離。大果山楂酚酸樣品提取過程中不可避免會帶入其他黃酮類成分，研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸、肉桂酸與大果山楂中的黃酮糖苷出峰時間很容易重合或非常接近，進(jìn)一步調(diào)整流動相組成、柱溫和流速等參數(shù)，結(jié)果顯示提高流動相水溶液中的酸濃度和柱溫可顯著改善樣品的酚酸與黃酮糖苷的分離效果。綜合考慮色譜柱的使用壽命和樣品的分離效果，優(yōu)化后的色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）;流動相為1.5%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序（0～25 min，10%～35% B;25～45 min，35%～45% B;45～48 min，45% B）;柱溫35 ℃;流速1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量20 μL。

采用以上優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行液相分析，混合酚酸對照品及大果山楂果實酚酸提取物樣品的色譜圖見圖1，八種酚酸的保留時間分別為原兒茶酸9.6 min、綠原酸14.6 min、二氫咖啡酸16.0 min、咖啡酸17.9 min、根皮酸22.7 min、p-香豆酸25.0 min、阿魏酸27.8 min、肉桂酸45.1 min，各酚酸之間的色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以樣品中的主成分綠原酸色譜峰計算大于3 000，基線平整，峰形好，表明本檢測分析方法可以對大果山楂果實中的八種酚酸類成分進(jìn)行定性與定量分析。1. 原兒茶酸; 2. 綠原酸; 3. 二氫咖啡酸; 4.咖啡酸; 5. 根皮酸; 6. p-香豆酸; 7. 阿魏酸; 8. 肉桂酸。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量下限 從表2中可以看出，八種酚酸對照品在線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.997 7～0.999 5，檢出限 0.08～0.20 μg·mL-1，定量下限0.27～0.67 μg·mL-1，表明本方法檢測靈敏度較高，能夠?qū)崿F(xiàn)樣品中低濃度酚酸的定量分析。

2.2.2 精密度測定 同一樣品連續(xù)進(jìn)樣得到的峰面積越接近，說明儀器的精密度越好，試驗結(jié)果越精準(zhǔn)。本方法的精密度試驗顯示酚酸對照品的RSD值分別為原兒茶酸1.07%、綠原酸1.11%、二氫咖啡酸2.59%、咖啡酸2.14%、根皮酸0.85%、p-香豆酸2.60%、阿魏酸2.11%、肉桂酸1.46%，最大的變異系數(shù)為2.59%，表明精密度良好，符合測定要求。

2.2.3 穩(wěn)定性測定 樣品在放置的時間段內(nèi)，測得的峰面積變化越小，說明樣品越穩(wěn)定，試驗結(jié)果則越準(zhǔn)確。本方法不同濃度對照品的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性測定結(jié)果如表3所示，各種酚酸在日內(nèi)的變異系數(shù)均小于4.62%， 日間的變異系數(shù)均小于4.99%，表明對照品日間和日內(nèi)的穩(wěn)定性良好，符合穩(wěn)定性要求。

2.2.4 重復(fù)性測定 同樣的大果山楂樣品進(jìn)行酚酸提取和預(yù)處理，測得的峰面積越接近，表明試驗在操作過程中出現(xiàn)的誤差越小，試驗結(jié)果則越準(zhǔn)確。本研究方法的重復(fù)性試驗顯示樣品中各個酚酸的RSD值分別為原兒茶酸3.16%、綠原酸1.19%、二氫咖啡酸3.37%、咖啡酸1.48%、根皮酸3.08%、p-香豆酸1.71%、阿魏酸1.96%、肉桂酸2.09%，最大的變異系數(shù)為3.37%，表明該方法的重復(fù)性較好，符合實驗要求。

2.2.5 加標(biāo)回收率的測定 本方法大果山楂果實樣品加標(biāo)回收率結(jié)果如表4所示，八種酚酸的平均加標(biāo)回收率在99.3%～103.3%之間，RSD值均小于3.45%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，可以用于對大果山楂果實酚酸含量的檢測。

2.3 不同產(chǎn)地大果山楂果實酚酸含量的比較分析

10個不同產(chǎn)地大果山楂果實中測定的八種酚酸含量見表5，樣品中均檢出原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、阿魏酸和肉桂酸七種酚酸，其中二氫咖啡酸、根皮酸、阿魏酸在大果山楂果實中首次檢出（趙帥等，2020），p-香豆酸雖存在于大果山楂葉中（Zhao et al.， 2015），但本研究的所有樣本中均未檢出，表明果實中可能不存在這種酚酸或含量極其微量，不在檢測范圍內(nèi)。進(jìn)一步的單因素方差分析可知，不同產(chǎn)地果實的酚酸總含量以及各酚酸之間的含量均存在明顯差異，七種酚酸總含量在10 187.8～15 583.9 μg·g-1之間，綠原酸均為最主要的酚酸類成分（8 410.2～13 826.7 μg·g-1），占總酚酸80%以上，廣西百色靖西和桂林恭城產(chǎn)的果實，其總酚酸和綠原酸含量相對較高，分別大于15 000、13 500 μg·g-1;其余六種酚酸含量都遠(yuǎn)低于綠原酸，分別為咖啡酸471.6～850.5 μg·g-1、原兒茶酸184.3～487.8 μg·g-1、二氫咖啡酸102.6～391.5 μg·g-1、肉桂酸81.2～520.1 μg·g-1、阿魏酸57.8～423.4 μg·g-1、根皮酸24.2～230.8 μg·g-1，根皮酸為含量相對較少的酚酸成分，整體水平最低。以上結(jié)果表明，大果山楂果實中酚酸類成分種類和含量豐富，這為今后對大果山楂果實的開發(fā)利用提供了方向和依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

本文建立了HPLC法測定大果山楂果實中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、肉桂酸、p-香豆酸、阿魏酸、二氫咖啡酸和根皮酸的方法，該方法不僅可以實現(xiàn)同時檢測這八種酚酸，而且與以往三種酚酸的檢測方法相比（Wen et al.， 2016），酚酸之間分離度好，酚酸與干擾峰之間得到有效分離， 基線平整，準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，符合檢測分析的要求，因此定性和定量更為準(zhǔn)確。色譜條件為ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），以甲醇/1.5%甲酸水溶液（v/v）為流動相，梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長280、320 nm，進(jìn)樣量20 μL。

大果山楂果實中酚酸組成和含量豐富，共檢出原兒茶酸、綠原酸、二氫咖啡酸、咖啡酸、根皮酸、阿魏酸和肉桂酸七種酚酸，二氫咖啡酸、根皮酸、阿魏酸在大果山楂果實中首次檢出;果實中總酚酸及酚酸之間的含量差異明顯，七種酚酸總的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10 187.8～15 583.9 μg·g-1之間，以綠原酸為主（8 410.2～13 826.7 μg·g-1），占總酚酸的80%以上，廣西百色靖西和桂林恭城的果實總酚酸和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均相對較高，分別大于15 000、13 500 μg·g-1，綠原酸含量為同屬植物蘋果的3～180倍（Feliciano et al.， 2010; 李鑫，2015;韓明虎等，2018），在后續(xù)的品種選育、原料選擇和加工利用方面值得關(guān)注。

酚酸類化合物是高等植物中普遍存在的一類次生代謝產(chǎn)物，也是合成木質(zhì)素的中間產(chǎn)物（陳志杰等，2018;高媛等，2018），果實中的酚酸組成和含量除了與品種、產(chǎn)地有關(guān)外，也與果實采摘時的成熟度和貯藏條件等密切相關(guān)（Seraglio et al.， 2018; 匡鳳元等，2019），進(jìn)一步研究不同時期酚酸類成分的變化規(guī)律更有利于準(zhǔn)確評估不同產(chǎn)地大果山楂果實中的酚酸類組成和含量。本研究結(jié)果能為以上這些后續(xù)研究提供檢測方法和研究方向。

參考文獻(xiàn)：

CHOI K， SON Y， HWANG J， et al.， 2017. Antioxidant， anti-inflammatory and anti-septic potential of phenolic acids and flavonoid fractions isolated from Lolium multiflorum [J]. Pharm Biol， 55（1）： 611-619.

CHEN DD， GUO XF， ZHAO L， et al.， 2019. Stimultaneous determination of four flavone C-glycosides in bamboo leaves of Phyllostachys by HPLC [J]. Chem Ind For Prod， 39（5）： 108-114. [陳丹丹， 郭雪峰， 趙蕾， 等， 2019. HPLC法同時檢測剛竹屬竹葉中4種黃酮碳苷的含量 [J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)， 39（5）： 108-114.]

CHEN ZJ， WU JQ， MA Y， et al.， 2018. Biosynthesis， metabolic regulation and bioactivity of phenolic acids in plant food materials [J]. Food Sci， 39（7）： 321-328. [陳志杰， 吳嘉琪， 馬燕， 等， 2018. 植物食品原料中酚酸的生物合成與調(diào)控及其生物活性研究進(jìn)展 [J]. 食品科學(xué)， 39（7）： 321-328.]

DENG BA， WANG KJ， WANG F， et al.， 2017. Determination of nine phenolic acids in different Atractylodes macrocephala koidz extracts using HPLC [J]. Food Ind， 38（8）： 277-280. [鄧寶安， 王科杰， 王芳， 等， 2017. 采用HPLC法同時檢測白術(shù)中酚酸類物質(zhì) [J]. 食品工業(yè)， 38（8）： 277-280.]

DENG JG， WEI SJ， 2007. Authentic medicines of Guangxi [M]. Beijing： China Traditional Chinese Medicine Press： 24-31. [鄧家剛， 韋松基， 2007. 廣西道地藥材 [M]. 北京： 中國中醫(yī)藥出版社： 24-31.]

DENG Y， CHEN YS， WANG X， et al.， 2018. HPLC simultaneous determination of four phenolic acids in Herba Glechomae [J]. Chin J Pharm Anal， 38（4）： 643-647. [鄧渝， 陳友生， 王茜， 等， 2018. HPLC法同時測定連錢草中4個酚酸類成分的含量 [J]. 藥物分析雜志， 38（4）： 643-647.]

Food and Drug Administrationof Guangxi Autonomous Region， 2011. Quality standard of Zhuang medicine of Guangxi Autonomous Region [M]. Vol. 2（2011 ed）. Nanning： Guangxi Science & Technology Press： 26-27. [廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局， 2011. 廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) [M]. 第二卷（2011版）. 南寧： 廣西科學(xué)技術(shù)出版社： 26-27.]

FELICIANO RP， ANTUNES C， ROMOS A， et al.， 2010. Characterization of tradition andexotic apple varieties from Portugal. Part 1-Nutritional， phytochemical and sensory evaluation [J]. J Funct Food， 2（1）： 35-45.

GAO Y， MA S， DAI M， et al.， 2018. Progress in research on the biosynthesis pathway and metabolic regulation of phenolic acids [J]. Food Sci， 39（9）： 286-293. [高媛， 馬帥， 代敏， 等， 2018. 果蔬酚酸生物合成及代謝調(diào)控研究進(jìn)展 [J]. 食品科學(xué)， 39（9）： 286-293.]

GUO T， BAI XL， CHEN YN， 2019. Effect of drying treatment methods on the drying rate and quality characteristics of big fruit hawthorn [J]. Food Mach， 35： 122-125. [郭婷， 白向麗， 陳益能， 等， 2019. 干燥方式對大果山楂粉干燥速率及品質(zhì)的影響 [J]. 食品與機(jī)械， 35： 122-125]

HAN MH， WANG CL， HU HB， et al.， 2018. Analysis of compostion and content of polyphenols in Qingyang Red Fuji Apple [J]. Sci Technol Food Ind， 39（20）： 244-248. [韓明虎，王春林，胡浩斌，等，2018. 慶陽紅富士蘋果中多酚類成分組成及含量分析 [J]. 食品工業(yè)科技，39（20）： 244-248.]

HUANG XX， 2015. Study on the anti-oxidant activity andhypolipemic effect of Malus doumeri （Bois） Chev. flavonoid extract [D]. Nanning： Guangxi University. [黃欣欣， 2015. 大果山楂黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化性和降血脂功能研究 [D]. 南寧： 廣西大學(xué).]

HUANG XX， YE ZQ， GUO BB， et al.， 2015. Reflux extraction process optimization of total flavonoids from Malus doumeri （Bois） Chev. fruits by response surface methodology [J]. J S Agric， 46（6）： 1089-1095. [黃欣欣， 葉志青， 郭兵兵， 等， 2015. 響應(yīng)面法優(yōu)化回流提取大果山楂總黃酮工藝 [J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 46（6）： 1089-1095.]

KUANG FY， WU GB， ZHANG K， et al.， 2019. Simultaneous determination of 5 phenolic acids of phenylpropanoid pathway in postharvest wax apple [Syzygium samarangenese （Blume） Merrill & L.M. Perry] fruit by high performance liquid chromatography [J]. Food Sci， 40（8）： 165-170. [匡鳳元， 吳光斌， 張珅， 等， 2019. HPLC法同時測定采后蓮霧果實木質(zhì)素代謝途徑中5種酚酸的含量 [J]. 食品科學(xué)， 40（8）： 165-170.]

LI MH， WANG ZM， YANG J， et al.， 2019. Advances in monolithic columns technology in HPLC [J]. Chem Bull， 82（1）： 18-26. [李旻昊， 王澤溟， 楊杰， 等， 2019. 高效液相色譜整體柱技術(shù)研究進(jìn)展 [J]. 化學(xué)通報， 82（1）： 18-26.]

LI X， 2015. Polyphenolic compounds determination and bioactivity evaluation of different apple （Malus pumila Mill.） cultivars＼[D＼]. Hangzhou： Zhejiang University. [李鑫，2015. 不同品種蘋果多酚組分分析及其相關(guān)生物活性研究 [D]. 杭州： 浙江大學(xué).]

LI Y， CHEN DQ， YE ZB， 2018. Determination of the composition and content of phenolic acids in Dendrobium officinale by HPLC [J]. Food Res Dev， 39（7）： 174-179. [李巖， 陳德泉， 葉澤波， 2018. HPLC法測定鐵皮石斛中酚酸類物質(zhì)組成及含量 [J]. 食品研究與開發(fā)， 39（7）： 174-179.]

LUO CY， WANG XX， GAO G， et al.， 2013. Identification and quantification of free， conjugate and total phenolic compounds in leaves of 20 sweetpotato cultivars by HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS/MS [J]. Food Chem， 141（3）： 2697-2706.

QU YQ， MARAT T， ZHENG DY， et al.， 2019. HPLC determination of phenolic acids in tea [J]. Acta Tea Sin， 60（2）： 69-74. [屈艷勤， MARAT T， 鄭德勇， 等， 2019. 高效液相色譜法測定茶葉酚酸化合物的含量 [J]. 茶葉學(xué)報， 60（2）： 69-74.]

SERAGLIO SKT， SCHULZ M， NEHRING P， et al.， 2018. Nutritional and bioactive potential of Myrtaceae fruits during ripening [J]. Food Chem， 239： 649-656.

WANG LH， YANG JX， ZHENG YH， et al.， 2012. Modeling of geographic distribution of Malus doumeri [J]. J NE For Univ， 40（9）： 15-18. [王雷宏， 楊俊仙， 鄭玉紅， 等， 2012. 臺灣林檎[Malus doumeri （Bois） Chev.]地理分布模擬 [J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 40（9）： 15-18.]

WANG XM， YU Y， WANG XL， et al.， 2016. Simultaneous determination of 5 salvianolic acid constituents in the roots and rhizomes of Salvia deserta Schang by HPLC [J]. Chin J Pharm Anal， 36（5）： 805-810. [王曉梅， 余妍， 王新玲， 等， 2016. HPLC法同時測定新疆鼠尾草中5個酚酸類成分的含量 [J]. 藥物分析雜志， 36（5）： 805-810.]

WEN LR， 2016. Study on the bioactive chemical constituents and their antioxidantive and anti-proliferative activities of Crataegus pinnatifida and Malus doumeri fruits [D]. Guangzhou： South China University of Technology. [溫玲蓉， 2016. 北山楂和大果山楂的活性成分及其抗氧化與抗增殖活性研究 [D]. 廣州： 華南理工大學(xué).]

WEN LR， ZHENG GQ， YOU LJ，et al.， 2016. Phytochemical profiles and cellular antioxidant activity of Malus doumeri （Bois） chevalier on 2， 2′-azobis （2-amidinopropane ） dihydrochloride （ ABAP）-induced oxidative stress [J]. J Funct Foods， 25： 242-256.

ZHANG Q， CHEN CX， CHEN ZL， et al.， 2018. Research of compositions and antioxidant activity during natural fermentation of Malus domeri （Bois） Chev. enzyme drink [J]. Food Res Dev， 39（22）： 15-19. [張巧， 陳春喜， 陳振林， 等， 2018. 大果山楂酵素發(fā)酵過程中組分及抗氧化性研究 [J]. 食品研究與開發(fā)， 39（22）： 15-19.]

ZHAO S， HAO EW， DU ZC， et al.， 2020. Advance in studies on chemical constituents， pharmacology and quality control of Malus doumeri [J]. Chin Trad Patent Med， 42（1）： 169-175. [趙帥， 郝二偉， 杜正彩， 等， 2020. 廣山楂的化學(xué)成分、藥理作用與質(zhì)量控制研究進(jìn)展 [J]. 中成藥， 42（1）： 169-175.]

ZHAO HD， HU X， CHEN XQ， et al.， 2015. Analysis and improved characterization of minor antioxidants from leaves of Malus doumeri using a combination of major constituents knockout with high-performance liquid chromatography-diode array detector-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry [J]. J Chromatogr A， 1398： 57-65.

ZHU K， HUANG GB， XIE J， et al.， 2019. Preventive effect of flavonoids from Wushan Shencha （Malus doumeri leaves） on CCI4-induced liver injury [J]. Food Sci Nutr， 7（11）： 3808-3818.

ZENG YH， TANG CM， ZHOU YT， et al.， 2014. Study of characteristics and utilization value of Malus doumeri in Guangxi [J]. For Invest Des， 170（2）： 85-88. [曾勇豪， 唐初明， 周云濤， 等， 2014. 廣西風(fēng)味小野果澀梨的特點(diǎn)及開發(fā)利用價值研究 [J]. 林業(yè)勘查設(shè)計， 170（2）： 85-88.]

（責(zé)任編輯 李 莉）