郭 艷，周小魏，呂佳欣，熊仁次，王振華

（1 煙臺市科技創(chuàng)新促進中心，山東264003）（2 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院）（3 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

櫻桃（Cerasusspp.），又名車厘子、英桃和鶯桃，是薔薇科（Rosaceae）櫻屬（CerasusMill.）植物。自古以來，櫻桃就是果中之珍品，果實色彩鮮艷、小巧玲瓏，為人們所喜愛[1]。中國櫻桃原產(chǎn)于我國，在我國有2 000 多年的栽培歷史，且分布廣泛，主要生長于山東、河南、江蘇、浙江、江西、四川等地[2]。櫻桃果實成熟期早，享有“早春第一果”的美譽，其色彩亮麗，汁多肉厚，營養(yǎng)豐富。果實性溫、味甜，有調(diào)氣活血、調(diào)中益脾、平肝祛熱之功效[3]。櫻桃中含有豐富的花色苷、p-香豆酸、沒食子酸、堪非醇、紫蘇醇、褪黑激素和槲皮素等天然的具有保健功能的成分[4]，具有抗氧化、緩解關(guān)節(jié)痛和痛風(fēng)、降低心血管疾病的風(fēng)險、防治癌癥、控制糖尿病及其并發(fā)癥、調(diào)節(jié)生理節(jié)律、提高睡眠質(zhì)量及大腦保健等作用[5]；另一方面，每百克櫻桃中含鐵多達59 mg，居于水果首位。櫻桃中具有保健功能的成分被分離、分析與鑒定，研究發(fā)現(xiàn)櫻桃具有相當高的抗氧化能力[6-8]。

本文通過分析山東省煙臺市及其周邊不同大櫻桃品種的營養(yǎng)成分，并探索大櫻桃粗提物對大鼠心肌細胞氧化損傷的保護作用，以期為大櫻桃的加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料購買于山東省煙臺市田園大櫻桃專業(yè)合作社，分別采摘成熟期的‘意大利紅’‘美早’‘先鋒’‘紅燈’‘水晶’‘拉賓斯’和‘薩米托’7個大櫻桃品種，每個品種各15 kg，用于測定營養(yǎng)成分和提取花色苷等。

檸檬酸（Sigma）、硫酸（煙臺雙水化學(xué)有限公司）、鉬酸銨（天津大茂有限公司）、冰乙酸（天津百世化工有限公司）、草酸（Sigma）、蒽酮（Sigma）、乙醇（山東禹王有限公司）等試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

JJ-2 組織搗碎勻漿機，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科興儀器廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5205（上海亞榮生化儀器廠），真空冷凍干燥機（北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司），AR2130電子天平（Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA），Micro 21R 高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific Inc)，酶標儀（Molecular Devices Corporation），F(xiàn)ACSAria 流式細胞儀（Becton Dickinson），恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO）。

1.3 試驗方法

1.3.1 營養(yǎng)指標的測定

總糖含量用蒽酮指示劑法測定，可滴定酸含量用酸堿滴定法測定，維生素C含量用鉬藍比色法測定，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G250 染色法測定，總酚含量采用Waterhouse方法測定，類黃酮含量采用直接測定法以黃酮類化合物為對照測定其含量，總花色苷含量采用pH示差法測定。

1.3.2 總花色苷的提取

酸化乙醇法提?。哼x果30個左右，洗凈、瀝水、稱重、去核，打漿放置于錐形瓶中，稱取10 g勻漿液，檸檬酸濃度8 g/L（溶劑為50%乙醇），料液比1∶3，時間3 h，乙醇濃度50%，溫度60 ℃，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，減壓濃縮至2～3 mL，膏狀，真空濃縮干燥，得到大櫻桃總花色苷提取物。

1.3.3 抗氧化能力的測定

（1）DPPH自由基清除試驗。DPPH自由基清除活性，制備提取液，將0.1 mL 稀釋至合適倍數(shù)的樣品提取液或標準品溶液與3.9 mL 60 mmol/L DPPH測定液混勻后避光室溫反應(yīng)2 h，測定515 nm處的吸光值。標準曲線為Trolox 用甲醇（含1%甲酸）落解并稀釋至25、50、75、100、125、150、175、200μg/mL 濃度梯度。DPPH自由基清除活性以mg Trolox/100 g 表示。

（2）羥基自由基清除試驗。Fenton反應(yīng)是生成羥基自由基的常用方法。分別取0.2 mol/L FeSO4溶液、2 mmol/L 水楊酸及稀釋的2 mg/L 不同提取液各1 mL 混合，編號1～7號，以中國毛櫻桃抗氧化提取物以及維生素C為對照，分別在8、9號管中加入1 mL 的2 mg/L 對照樣品混合。最后分別加入6 mmol/L H2O21.0 mL，以蒸餾水定容至10 mL 啟動反應(yīng)，空白以蒸餾水代替。37℃水浴反應(yīng)1 h后，在λ＝520 nm 下測定OD 值。

（3）超氧陰離子清除試驗。取試劑a（1 mol/L HCl 48.0 mL，Tris 36.6 g，EDTA 0.23 mL，加蒸餾水定容至100 mL）與試劑b（0.14 g 過硫酸銨加蒸餾水定容至100 mL），按照1∶4混合產(chǎn)生超氧自由基。1 min后，分別吸取2 mL 混合液至編號為1～8號的試管中，分別加入1 mL 稀釋的2 mg/L 的不同大櫻桃品種的抗氧化提取物，以維生素C為對照，分別在9、10 號管中加入1 mL 的2 mg/L 對照樣品?？瞻滓哉麴s水代替，加10 mmol/L 鹽酸羥氨胺0.4 mL混合，25℃反應(yīng)30 min。再加入17 mmol/L 的對氨基苯磺酸和7 mmol/L α-萘胺各2 mL，25℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)顯色后加入7.4 mL 的正丁醇，充分搖勻，靜置分層。取正丁醇相，在λ＝520 nm下測定OD值。

1.3.4 對心肌細胞的保護作用試驗

大鼠心肌細胞H9C2（購自中國科學(xué)院上海細胞庫）以1×106個/mL 密度接種于6 孔板中，待生長至80%～90%融合度時，加入30 μg/mg 濃度大櫻桃提取物（經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾除菌，空白組和模型組加入等量的DMEM培養(yǎng)基）孵育24 h后，再加入DCFH-DA探針孵育30 min 后，加入300 μmol/L 的H2O2溶液，處理2 h，488 nm、529/590 nm酶標儀熒光檢測活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 進行數(shù)據(jù)整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)成分的分析

由圖1可知，總糖含量，‘水晶’最高，為29.68%，其他6 個大櫻桃品種的總糖含量均為20.00%左右；可滴定酸含量，‘水晶’略低，為0.51%，其他6個大櫻桃品種的可滴定酸含量為0.60%～0.90%；維生素C含量，‘先鋒’最高，為400 mg/kg，其次為‘紅燈’和‘拉賓斯’，含量略高于其他品種；類黃酮含量，‘意大利紅’最高，達1.1 mg/g，而含量最低的‘水晶’為0.6 mg/g；總酚含量，‘先鋒’和‘拉賓斯’較高，分別為2.6、2.5 mg/g，‘美早’的總酚含量最低，為1.6 mg/g；蛋白質(zhì)含量，‘先鋒’最高，‘水晶’最低。

圖1 7個大櫻桃品種的營養(yǎng)成分

2.2 花色苷含量的比較

由圖2 可以看出，7個大櫻桃品種都含有一定量的花色苷，‘意大利紅’含量最高，為9.04 mg/L，‘水晶’的花色苷含量最低。

圖2 7 個大櫻桃品種的花色苷含量

2.3 抗氧化能力的測定

羥自由基清除率的大小可反映大櫻桃提取物的抗氧化能力。由圖3可以看出，‘意大利紅’‘水晶’和‘拉賓斯’3個大櫻桃品種有較強的羥自由基清除抗氧化能力，羥自由基清除率均超過了20%。在清除氧自由基的過程中，‘美早’和‘紅燈’2 個大櫻桃品種的清除率最高，這可能和其中的類黃酮、總酚以及花色苷等成分有一定的關(guān)系。通過檢測待測物質(zhì)和DPPH反應(yīng)后的吸光度，獲得反應(yīng)前后DPPH 的濃度變化，可判斷待測物質(zhì)的清除DPPH自由基能力。7個大櫻桃品種的提取物對DPPH 自由基都有一定的清除能力，其中‘拉賓斯’的清除能力最強。7個大櫻桃品種的提取物對H2O2引起的心肌細胞氧化作用都有一定的保護作用。通過對30 μg/mg 濃度的粗提物進行試驗，結(jié)果顯示，7個大櫻桃品種的提取物與空白組和對照組進行比較，DCF 熒光值較對照組有所降低。‘意大利紅’和‘美早’2個大櫻桃品種的提取物抗氧化能力略高于其他品種。

圖3 7 個大櫻桃品種體外抗氧化能力

3 結(jié)論

本研究通過測定7個大櫻桃品種的6 個營養(yǎng)成分，并從清除羥自由基、氧自由基、DPPH自由基和細胞ROS 角度評價了大櫻桃的體外抗氧化能力。在營養(yǎng)成分方面，‘水晶’的總糖含量最高，‘先鋒’和‘薩米托’的可滴定酸含量最高，‘先鋒’的維生素C含量最高，‘意大利紅’的類黃酮含量最高，‘先鋒’和‘拉賓斯’的總酚含量高于其他品種，‘先鋒’的蛋白質(zhì)含量最高，‘意大利紅’的花色苷含量最高。

此外，通過體外心肌細胞試驗，發(fā)現(xiàn)7個大櫻桃品種都有一定的抗氧化能力，‘意大利紅’清除能力最強。缺血性心臟病的發(fā)生和發(fā)展與氧化應(yīng)激所致的細胞損傷密切相關(guān)，缺血心肌再灌注后機體產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致機體氧化與抗氧化能力失衡，而線粒體作為ROS的主要產(chǎn)生場所，也是ROS最常攻擊的部位，過量的ROS會引起線粒體功能損傷[9-11]。大櫻桃中含有大量的花色苷類化合物，花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物[12-16]，花色苷對羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基等均有很好的清除作用，可防止大分子物質(zhì)的氧化損傷[17-19]。綜上，大櫻桃是一種營養(yǎng)豐富的功能性食品原料，對細胞氧化損傷產(chǎn)生的ROS也具有較強的清除能力，因而本研究的結(jié)果可為大櫻桃后期的食品加工利用提供一定參考。