弟豆豆，宋來慶，曹曉敏，胡 慧，張 碩，張學勇，姜中武,2，趙玲玲,2

（1 煙臺市農業(yè)科學研究院，山東 265500）（2 煙臺大學生命科學學院）

蘋果花葉病在我國各蘋果產區(qū)發(fā)生嚴重[1]。其中，山東、河南、山西、甘肅、陜西等地受害較為普遍[2]，在陜西省一些蘋果產區(qū)，病株率在30%以上，而山東省煙臺市的一些老果園病株率竟在80%～100%[1]。蘋果花葉病受溫度、光照等因素影響較大，春季至夏季葉片癥狀明顯，感病葉片出現花葉、褪綠黃化等癥狀，引起葉綠素降解，從而影響光合作用，進而影響樹勢、產量及果品質量[3-6]。據報道，蘋果花葉病在蘋果上的危害為慢性危害，潛育期長，最長可達8年才表現癥狀[1]，病株產量下降30%～40%[7]。

1933年，Bradford等在美國首次報道蘋果花葉病毒[8]。20世紀50 年代，我國發(fā)現了蘋果花葉病并開展其相關研究，80年代開始進行病毒的調查和鑒定[9-11]。近年來，研究人員發(fā)現蘋果花葉病毒（Apple mosaic virus，ApMV）并不是導致蘋果花葉病的唯一病原，李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV）、蘋果壞死花葉病毒（Apple necrotic mosaic virus，ApNMV）也可能會引起蘋果花葉病[12-13]。ApNMV基因組由3條RNA 組成，其中，RNA1和RNA2都是單順反子，分別編碼與病毒復制相關的酶類MET/HEL（methyltransferase/NTP-binding helicase）和RNA依賴的RNA聚合酶（RNA polymerase），RNA3編碼MP（Movement protein，MP）和CP（Coat protein，CP）?；贑P 和MP 氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，ApNMV屬于Ilarvirus屬的第3亞組[13-14]。

2017年，日本學者從表現花葉病的中國蘋果中首次檢測到ApNMV[13]。2018年，邢飛[14]克隆了6條ApNMV中國分離物全基因組序列，并且明確了ApNMV與我國蘋果花葉病癥狀高度相關。2019年，Hu 等測定了海棠的ApNMV 全基因組序列[15]。目前，NCBI共登錄10條ApNMV的RNA3全基因組序列，其中包括日本1條、中國陜西延安4 條、中國山東泰安3條、中國遼寧興城2條，而關于山東省煙臺市蘋果壞死花葉病毒分離物的研究尚未見報道。本研究利用RT-PCR技術對山東省煙臺地區(qū)ApNMV進行了鑒定和序列分析，以期為該病的防治、流行規(guī)律的判斷以及致病機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年5月，在煙臺市農業(yè)科學研究院采集表現花葉癥狀的植物樣品37個，其中，‘紅將軍’蘋果8個、‘長富2號’蘋果23個、海棠1個、月季2個、梨3個（圖版1），每株采集3～5片嫩葉片作為1個樣品，編號后置于冰盒中，帶回實驗室后立即放入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購于北京艾德萊公司（RN09），DH5α感受態(tài)細胞、PLB（lethd Based simple Fast Cloning Kit）和TIAN Gel Midi Purification Kit 購于天根生化科技（北京）有限公司；Thermo Scientific revertAid First Stand cDNA Synthesis Kit、Escherichia coli聚合酶和Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；rTaq、pMD18-T、Maker DL2000、ddH2O 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片總RNA 提取

葉片總RNA提取參照北京艾德萊公司的RNA提取試劑盒說明書進行，提取的總RNA溶解于40 μL ddH2O中，貯存于-70 ℃冰箱中備用。

1.2.2 RT-PCR 擴增

以提取的總RNA 為模板反轉錄成cDNA，反轉錄過程參照Thermo Scientific revertAid First Stand cDNA Synthesis Kit說明書進行。采用ApN-F1和ApN-R1[13]為第1輪擴增引物，以ApN-F2 和ApN-F2[14]為第2 輪擴增引物進行ApNMV 巢氏PCR（Nested RT-PCR）檢測。第1輪PCR 反應擴增體系：10×Buffer 2.5μL、dNTPs 1.6 μL、10 μmol/L 正反向引物各0.6 μL、cDNA 1μL、rTaq DNA聚合酶0.2 μL，補水至20μL。取0.25μL 第1輪PCR 產物為模板進行第2輪PCR 反應。反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72℃延伸50 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。為明確蘋果樣品中病毒復合侵染的情況，參照梁成林等[16]的方法進行蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）和蘋果銹果類病毒（ASSVd）的檢測[16]。檢測所用引物序列見表1。

表1 蘋果花葉病病毒檢測引物

1.2.3 ApNMV RNA3基因克隆測序

從‘紅將軍’和‘長富2號’中各隨機選取3個陽性樣品進行RNA3基因組序列克隆和測序。分別以ApNMV呈陽性的‘紅將軍’和‘長富2號’cDNA 樣品為模板，使用E.colipoly（A）Polymerase（NEB，北京）進行3′端加尾反應，反轉錄過程參照Thermo 反轉錄試劑盒說明書進行。

參考邢飛[14]設計合成特異性引物，以RNA3-mcf（5′-GTCGAAGTACTTTTCTGCCAAATG-3′）和RNA3-R1（5′-GATTGGGCATCTACTTTCGTA-3′）為引物進行第1輪PCR反應，以RNA3-mcf 和RNA3-R2（5′-GCTTCCCTAACGGGGCATCCAAT-3′）為引物，以第1 輪PCR 反應產物為模板進行Nested RT-PCR，擴增ApNMV RNA3 全長核苷酸序列，目的片段大小約為1 752 nt。25 μL PCR 反應擴增體系：5×Phusion HF Buffer 5μL、dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、10 μmol/L正反向引物各0.8μL、cDNA 1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（2 U/μL）0.3μL，補水至25μL。Nested RT-PCR反應體系：5×Phusion HF Buffer 5μL、dNTPs（10 mmol/L）1.6μL、10 μmol/L正反向引物各0.8μL、上述PCR 產物0.2μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（2 U/μL）0.3μL，補水至25μL。反應程序：98℃預變性50 s；98℃變性10 s，58℃（APNA1）或48℃（RNA3-R5）退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸8 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，在4 ℃條件下保存。

按照TIAN Gel Midi Purification Kit說明書回收DNA 目的片段，取3μL 純化后的目的片段連接PLB載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經藍白斑篩選，挑取白色菌落進行PCR 陽性克隆篩選。選取3～5個陽性克隆由生工生物工程（上海）有限公司進行序列測定。

1.2.4 陽性克隆序列多重比對

每個陽性樣品選取3～5 個陽性克隆進行測序，將測序結果在GenBank中進行BLAST 比對，利用DNAMAN（Version6.0）比較序列同源性。

1.2.5 ApNMV RNA3序列系統(tǒng)進化分析

將獲得的2 條分離物與GenBank 中已發(fā)表的10條ApNMV RNA3 序列，利用MEGA 7.0 軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ），以PNRSV（NC004346）為外群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap 值為1 000，其余參數為默認設置。

2 結果與分析

2.1 ApNMV RT-PCR檢測結果

RT-PCR結果（圖1）顯示，31份蘋果樣品中有27份檢測出了ApNMV，檢出率為87.1%。表明ApNMV與我國蘋果花葉病高度相關。

圖1 Ap NMV 在表現花葉病癥狀的蘋果樣品中的檢測結果

從表現花葉癥狀的海棠、梨和月季樣品中均擴增出440 nt 左右的目的條帶。將目的條帶序列測定后，明確海棠（H281）、梨（L16）、月季（Y6）中擴增到445、435、440 bp大小的ApNMV 特異片段（圖2）。

2.2 蘋果樣品病毒復合侵染情況

ASPV、ASGV、ACLSV是蘋果樹中3種主要的潛隱性病毒，ASSVd 是主要的非潛隱性類病毒。對31 份花葉樣品進行ASPV、ASGV、ACLSV 和ASSVd帶毒情況檢測結果顯示，31份花葉樣品的ApNMV、ACLSV、ASPV、ASGV和ASSVd 的檢出率分別為87.1%、70.9%、54.8%、61.3%和0.1%（圖3-a）；1種病毒和ApNMV復合侵染的樣品占33.1%（圖3-b）；2 種病毒和ApNMV 復合侵染的樣品占22.0%（圖3-c）；3 種及3種以上病毒和ApNMV復合侵染的樣品占41.0%（圖3-d）；ApNMV與ASPV、ASGV、ACLSV、ASSVd 總復合侵染率為96.1%。

圖3 花葉樣品中ApNMV 和其他4 種病毒的檢測與混合侵染情況

2.3 ApNMV RNA3 基因克隆測序及序列同源性分析

利用ApNMV RNA3引物（RNA3-mcf 和RNA3-R1、RNA3-R2）進行Nested-PCR，分別在‘紅將軍’和‘長富2號’中擴增得到大小約為1 780 bp大小特異片段，與目的條帶大小一致（圖4）。PCR產物純化后，連接到PLB 載體，轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，然后每個樣品隨機選取3～5個陽性克隆進行序列測定。最終獲得2 條長度為1 785 nt（YF515）和1 783 nt（YF31）的序列。

圖4 Ap NMV RNA3 基因的RT-PCR擴增圖譜

獲得的YF515和YF31核苷酸序列一致性為91.71%，與GenBank 中已報道的10條來自不同國家和地區(qū)的ApNMV RNA3核苷酸序列一致性為89.88%～96.64%。2條分離物與已發(fā)表序列在編碼區(qū)MP、CP 核酸序列相似性分別為89.09%～97.52% 和89.85%～96.21%，氨基酸序列相似性分別為91.79%～98.21%、90.02%～95.43%（圖5、圖6）；在非編碼IR區(qū)，與已發(fā)表序列核苷酸相似性為58.39%～91.26%，其中與日本分離物NC040470.1相似性最低，核苷酸序列相似性為58.39%（圖7）。

圖5 來自不同國家不同寄主Ap NMV 分離物MP氨基酸序列比對

圖6 來自不同國家不同寄主Ap NMV 分離物CP氨基酸序列比對

圖7 來自不同國家不同寄主Ap NMV分離物IR 區(qū)基因組序列比對

2.4 RNA3系統(tǒng)發(fā)育分析

RNA3基因系統(tǒng)進化分析結果表明，‘紅將軍’分離物YF31（MN911186）與中國陜西蘋果分離物（KY808390.1、KY808381.1、KY808378.1）、遼寧蘋果分離物（MG924901.1）和山東海棠分離物（MG924900.1）進化關系較近，聚于同一分支；‘長富2號’分離物YF515（MN911185）與陜西蘋果分離物（KY808393.1）進化關系最近，與日本蘋果分離物（NC040470.1）、遼寧蘋果分離物（MG924902.1）、山東蘋果分離物（KY808387.1）、陜西蘋果分離物（KY808393.1）聚在同一分支。分離物之間沒有表現出寄主特異性以及地域分布規(guī)律。

將蘋果、月季、海棠和梨上獲得的分離物序列構建系統(tǒng)進化樹，結果表明，梨、月季、海棠分離物均與蘋果（F411）聚在同一分支，親緣關系較近，而與ApMV、PNRSV關系較遠。其中，月季（Y6）分離物與蘋果（F411）關系最近，其次是梨（L16）分離物，與海棠分離物關系較遠（圖8）。

圖8 Ap NMV 不同分離物RNA3 核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹

3 討論與結論

關于蘋果花葉病的病原研究，目前研究結果表明，存在3種可能病原ApMV、PNRSV和ApNMV。本研究通過對31份蘋果花葉樣品進行帶毒情況檢測，發(fā)現ApNMV 的檢出率高達87.1%，而未檢出ApMV，表明ApNMV與煙臺地區(qū)花葉病高度相關，可能為蘋果花葉病的病原。該結果與邢飛[14]的研究結果基本一致。此外，本研究對31份花葉樣品中4種病毒ASPV、ASGV、ACLSV 和ASSVd 進行檢測，發(fā)現ApNMV與這4種病毒的復合侵染率高達96.1%，1 種病毒和ApNMV 復合侵染的樣品占33.1%；2 種病毒和ApNMV復合侵染的樣品占22.0%；3種及3 種以上病毒和ApNMV 復合侵染的樣品占41.0%。表明ApNMV與其他病毒復合侵染率高，而邢飛[14]的研究結果表明ApNMV與3種潛隱性病毒的復合侵染率為48%，這可能與樣品的采集種類、采集數量和采集方法有關。此外，還初步檢測到ApNMV與煙臺地區(qū)海棠、梨、月季中花葉病癥狀有關。

煙臺市是我國主要的蘋果產區(qū)，富士系為主栽品種，面積占全市蘋果面積的86%，分離‘紅將軍’和‘長富2號’2個品種蘋果花葉病原對本地區(qū)蘋果花葉病的防治具有非常重要的意義。本試驗從7個‘紅將軍’和20個‘長富2 號’ApNMV 花葉陽性樣品中隨機選取3個陽性樣品，對ApNMV RNA3序列進行克隆、測序結果完全相同，表明本研究獲得的2 條ApNMV RNA3分離物MN911186和MN911185可能為侵染煙臺地區(qū)‘紅將軍’和‘長富2 號’的ApNMV主要序列。對這2 條分離物進一步序列比對發(fā)現，這2條序列之間相似性為91.71%，與已報道的ApNMV RNA3核苷酸序列一致性為89.88%～96.64%。雖然，NCBI數據庫中已登錄4 條侵染富士蘋果的ApNMV RNA3序列，分別為陜西富士分離物2 條、山東蘋果分離物2 條。但是，本研究獲得的‘長富2 號’分離物MN911185與陜西富士分離物KY808390.1和KY808393.1、山東富士分離物KY808384.1 和KY808387.1 核苷酸一致性較低，分別為89.03%、85.71%、84.57%和85.66%，表明侵染煙臺地區(qū)富士蘋果為不同的ApNMV變體導致。

系統(tǒng)進化分析結果表明，‘長富2號’分離物MN911185 與陜西蘋果分離物KY808393.1 有更近的親緣關系，而與山東蘋果分離物KY808387.1、遼寧蘋果分離物MG924902.1的親緣關系較遠，這可能與不同地區(qū)蘋果引種或苗木運輸頻繁調運有關。因此，在苗木運輸過程中，必須加強病毒的檢疫工作。

綜上所述，本研究主要檢測了煙臺地區(qū)富士蘋果花葉病的病原，分析了序列特征，表明其為不同的ApNMV變體導致。此外，還初步檢測到ApNMV與海棠、梨、月季中花葉病癥狀有關。這些結果一方面豐富了我國ApNMV分離物的基因組序列信息和分子特性，并為進一步開展侵染性克隆載體的構建奠定了基礎。另一方面為研究ApNMV的遺傳多樣性和進化提供了參考和依據，也為蘋果花葉病防治及流行規(guī)律等研究提供了參考。