汪艷平 韋正 蔣利榮 張鵬 陳海林 符益山 覃擁靈

摘要 [目的]運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)反向分子對接的原理，對山豆根抑癌作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測。[方法]篩選山豆根化學(xué)成分25個，通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫查找相關(guān)靶點(diǎn)，NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)的校正，利用DAVID數(shù)據(jù)庫篩選藥物的KEGG通路，運(yùn)用cytoscape建立山豆根的“藥材-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路-藥理作用-臨床應(yīng)用”多層次作用網(wǎng)絡(luò)圖。[結(jié)果]山豆根的25個化學(xué)成分可調(diào)控CTBP2、CDKN1B、ABL1等51個靶點(diǎn)，得到相關(guān)通路25條，涉及癌癥、炎癥、肝病、心血管病等疾病，其中10條通路與癌癥相關(guān)。[結(jié)論]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，預(yù)測了山豆根的抗癌作用機(jī)制，為深入研究山豆根的藥理作用提供方向。

關(guān)鍵詞 山豆根;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);抗癌;作用通路

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）17-0165-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.044

Abstract [Objective] To predict the antitumor mechanism of Sophora tonkinensis by using the principle of reverse molecular docking in network pharmacology.[Method]25 chemical constituents of Sophora tonkinensis were screened， and the related targets were searched through the pharmapper database， the targets were adjusted by NCBI database， the KEGG pathway of drugs was screened by DAVID database， and the multi-level action network diagram of “medicinal materials-chemical composition-target-action pathway-pharmacological action-clinical application” was established by using Cytoscape.[Result]The 25 chemical components of Sophora tonkinensis could regulate 51 targets such as CTBP2， CDKN1B and ABL1， and 25 related pathways were obtained， involving cancer， inflammation， liver disease， cardiovascular disease and other diseases.Ten of them are related to cancer.[Conclusion]The anti-cancer mechanism of Sophora tonkinensis is predicted by network pharmacology analysis method， which provides direction for further study on pharmacological action of Sophora tonkinensis.

Key words Sophora tonkinensis;Network pharmacology;Anti-cancer;Action pathway

山豆根是豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep）的根，又名苦豆根（《中藥材手冊》）、廣豆根、小黃連、三小葉山豆根、胡豆蓮、柔枝槐等，《經(jīng)驗(yàn)方》中記載其為黃結(jié)[1]。山豆根主要化學(xué)成分有苦參堿、氧化苦參堿、金雀花堿和甲基金雀花堿等生物堿;山豆根色滿二氫黃酮、槲皮素、蘆丁等黃酮類;羽扇豆醇、槐花二醇等三萜類和小分子酚性及其他化學(xué)成分，如麥芽酚、大黃素、β-谷甾醇、三葉豆紫檀苷等。2015年版《中華人民共和國藥典》中對山豆根記載是“有豆腥氣，味極苦，性寒，歸肺、胃經(jīng)”。《本草圖經(jīng)》中記載山豆根含服可治咽喉腫痛;《本草綱目》曰：“清肺熱，除痰咳”?，F(xiàn)代藥理研究表明，山豆根主要有抑癌、抑菌、抗炎、抗病毒、抗心律失常等藥理活性[2-3]。

山豆根的抗腫瘤作用越來越受到人們的關(guān)注。據(jù)報道山豆根多糖對腫瘤有一定的抑制作用[4]。山豆根生物堿中含量較高的苦參堿和氧化苦參堿在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及對分化和凋亡基因的調(diào)控上表現(xiàn)出一定的作用[5]，苦參堿與H22-TIM2瘤苗聯(lián)用對小鼠體內(nèi)移植瘤的抑制效果比單用更加明顯[6]。山豆根中金雀異黃素、槐屬二氫黃酮G、槲皮素、山豆根酮等12種黃酮對人腫瘤細(xì)胞株均有不同程度的抑制作用，二氫黃酮和黃酮醇是抗腫瘤作用的主要黃酮類型[7]。臨床中已有用山豆根治療癌癥的成功案例，國醫(yī)大師李濟(jì)仁就有用山豆根、魚腦石、射干、茜草等等10種藥材治療鼻咽癌的經(jīng)典良方[8]。中醫(yī)認(rèn)為，肺熱痰火及肝膽熱毒上擾為鼻咽癌發(fā)病主要原因，對痰濁凝聚型和火熱內(nèi)困型鼻咽癌采用含山豆根的藥方進(jìn)行治療[9]。中醫(yī)研究院廣安門醫(yī)院用山豆根、草河車、夏枯草自制生藥片，結(jié)合外用藥治療宮頸癌效果顯著。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建藥物分子-靶點(diǎn)生物網(wǎng)絡(luò)、分子-分子生物網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)-靶點(diǎn)生物網(wǎng)絡(luò)、疾病-疾病生物網(wǎng)絡(luò)、藥物分子-靶點(diǎn)-疾病生物網(wǎng)絡(luò)等，分析藥物、靶點(diǎn)、疾病三者在網(wǎng)絡(luò)中的聯(lián)系，研究思路與中醫(yī)藥研究理念、特性以及方劑原則存在一定的共性[10]。通過網(wǎng)絡(luò)挖掘關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)研究中藥“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)與中醫(yī)辨證論治的理念相符，已越來越多地應(yīng)用到中藥作用機(jī)制和中藥有效成分的篩選研究[11-12]。筆者以山豆根為研究對象，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討山豆根的藥效成分及其潛在作用靶點(diǎn)，并建立“藥材-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路-藥理作用-臨床應(yīng)用”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系模型，通過網(wǎng)絡(luò)分析認(rèn)識山豆根的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 化合物信息

前期建立了不同產(chǎn)地山豆根藥材指紋圖譜，并采用高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對山豆根中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，鑒定出化學(xué)成分47個，結(jié)合文獻(xiàn)報道，選取25個活性成分，包括苦參堿、氧化苦參堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿、臭豆堿、槐胺、槐定堿、5α-羥基槐果堿、8-甲雷杜辛、槲皮素、芒柄花素、山豆根色滿查耳酮A、山豆根色滿查耳酮B、山豆根色滿查耳酮C、山豆根色滿二氫黃酮A、山豆根色滿二氫黃酮C、山豆根色滿二氫黃酮D、水仙苷、β-谷甾醇、大黃素、大黃素甲醚、番石榴酸乙酯、麥芽酚、槐花二醇、三葉豆紫檀苷[13]。

1.2 搜尋其潛在的藥物靶標(biāo)

首先，應(yīng)用ChemBioDraw Ultra 12.0軟件畫出該化學(xué)成分的二維結(jié)構(gòu)式，以.mol格式保存，再通過應(yīng)用ChemBio3D Ultra 12.0軟件將該化學(xué)成分的二維結(jié)構(gòu)式轉(zhuǎn)換為三維立體結(jié)構(gòu)圖，并對其立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，另存為.mol2格式的文件。在PharmMapper（包含7 000余個重要靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的信息和藥效團(tuán)模型，涵蓋了349種生物功能和110種臨床適應(yīng)癥）中導(dǎo)入.mol2格式的文件，庫中各數(shù)值均設(shè)成100，選物種為人類，得到一個ID號，將ID號輸入“get result”，進(jìn)行Results Downloading，生成Excel，篩選出fit值大于4.5或者前20個的Target Name，得每種分子對應(yīng)的潛在藥物靶標(biāo)。

1.3 藥物靶標(biāo)的篩選和校正

使用美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫的Gene 基因搜索功能（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），將篩選出的分子-靶點(diǎn)匹配度（fit）大于4.5的Target Name輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，將符合要求的所有基因換為official symbol。經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲取與活性成分相關(guān)的基因信息。

1.4 潛在作用通路預(yù)測 利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）中功能注釋工具（Functional Annotion Tool），上傳搜索到的潛在藥物靶點(diǎn)的ID號（Submit the gene list），之后選擇KEGG-Pathway，選取P<0.05的所有通路，即可輸出所有靶點(diǎn)作用的體內(nèi)通路，化合物、靶點(diǎn)和通路之間用Tab鍵隔開，建立相應(yīng)的TXT格式文本文檔。

1.5 建立“藥材-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路-藥理作用-臨床應(yīng)用”網(wǎng)絡(luò)圖 利用Cytoscape軟件，畫出“藥材-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路-藥理作用-臨床應(yīng)用”的作用網(wǎng)絡(luò)圖，各部分用不同的顏色進(jìn)行區(qū)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 山豆根藥材-化學(xué)成分-靶點(diǎn)分析

通過文獻(xiàn)檢索得到了數(shù)十個山豆根化學(xué)成分，最終取25個化學(xué)成分，其中包括苦參堿、氧化苦參堿、N-甲基金雀花堿等生物堿類成分8個，山豆根色滿査耳酮A、B、C等黃酮類成分10個，以及其他類型化學(xué)成分7個。通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫，篩選每種成分對應(yīng)的潛在藥物靶點(diǎn)（分子-靶點(diǎn)匹配度（fit）≥4.5），落在作用通路上的靶點(diǎn)共有52個，每個化學(xué)成分對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)如表1所示。

2.2 山豆根靶點(diǎn)-作用通路分析

通過DAIVD進(jìn)行功能注釋和KEGG通路分析，得到25條信號通路（P<0.05）如表2所示，分別涉及癌癥、肝病、炎癥等相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。與癌癥有關(guān)的通路：Prostate cancer（hsa05215）、Pathways in cancer（hsa05200）、Chemical carcinogenesis（hsa05204）、Osteoclast differentiation（hsa04380）、Ras signaling pathway（hsa04014）、Adipocytokine signaling pathway（hsa04920）、ErbB signaling pathway（hsa04012）、Chronic myeloid leukemia（hsa05220）、Neurotrophin signaling pathway（hsa04722）、Cell cycle（hsa04110）;與抗炎作用有關(guān)的通路：Osteoclast differentiation（hsa04380）、Toxoplasmosis（hsa05145）、Adipocytokine signaling pathway（hsa04920）、Osteoclast differentiation（hsa04380）;與抗心律、降血脂和保肝有關(guān)的通路：PPAR signaling pathway（hsa03320）、Non-alcoholic fatty liver disease （hsa04932）、ErbB signaling pathway（hsa04012）;Non-alcoholic fatty liver disease（hsa04932）、Drug metabolism - cytochrome P450（hsa00982）、Tyrosine metabolism（hsa00350）、Metabolism of xenobiotics by cytochrome（hsa00980）、Purine metabolism（hsa00230）、cAMP signaling pathway（hsa04024）、ABC transporters（hsa02010）、Biosynthesis of antibiotics（hsa01130）、AMPK signaling pathway（hsa04152）、Chagas disease（hsa05142）、Dopaminergic synapse（hsa04728）、Metabolic pathways（hsa01100）、Platelet activation（hsa04611）。

根據(jù) KEGG 網(wǎng)站上的通路信息及相關(guān)文獻(xiàn)，對與癌癥相關(guān)的4條通路的生物學(xué)意義描述如下：

（1）Prostate cancer（hsa05215）。前列腺癌是男性最常診斷的癌癥，也是男性癌癥死亡的第二大原因。前列腺癌細(xì)胞的識別涉及生長因子信號通路中的NKX3.1、PTEN、p27和雄激素（AR）靶點(diǎn)，這幾個靶點(diǎn)對前列腺癌細(xì)胞表達(dá)起關(guān)鍵作用。NKX3.1和PTEN不足將導(dǎo)致p27水平的降低和減少細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生。山豆根中的化學(xué)成分槐定堿、山豆根色滿二氫黃酮A、大黃素甲醚等作用于該通路，推測這些成分與抗前列腺癌作用有關(guān)。

（2）Chemical carcinogenesis（hsa05204）。基因毒性致癌物攻擊DNA和RNA等生物大分子，通過影響新陳代謝直接或間接影響這些生物大分子的表達(dá)，形成DNA加合物。DNA加合物是化學(xué)毒物經(jīng)生物系統(tǒng)代謝并活化后的親電活性產(chǎn)物與DNA分子特異位點(diǎn)結(jié)合形成的共價結(jié)合物。如果DNA加合物逃避細(xì)胞修復(fù)機(jī)制和持續(xù)下去，他們可能會導(dǎo)致錯編密碼，從而形成永久性的突變。以上機(jī)制會誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生、免疫反應(yīng)的抑制和活性氧的形成，改變細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致超突變型和基因組不穩(wěn)定，形成細(xì)胞增殖失控等癌變特征。作用于該通路的山豆根中化學(xué)成分有山豆根色滿查耳酮B、β-谷甾醇、番石榴酸乙酯，推測這些化學(xué)成分可能與抗癌作用有關(guān)。

（3）Neurotrophin signaling pathway（hsa04722）。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一個家庭的營養(yǎng)因素，參與神經(jīng)細(xì)胞的分化和生存，通過接觸激酶或自我生成受體酪氨酸激酶受體（p75NTR）。p75NTR屬腫瘤壞死因子受體超家族成員，主要在神經(jīng)細(xì)胞的早期發(fā)育過程中豐富表達(dá)，通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)以神經(jīng)細(xì)胞為主的細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng)[13]。槐胺作用這條通路，推測槐胺可能具有促進(jìn)癌細(xì)胞分化和調(diào)亡的作用。

（4）Ras signaling pathway（hsa04014）。Ras GTPase 蛋白信號通路有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖開關(guān)、生存、生長、遷移、分化和細(xì)胞骨架活力的功能。GTPase通常行使腫瘤抑制基因的功能，促進(jìn) Ras活化蛋白水解，抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。在山豆根藥物中槲皮素作用該通路，推測槲皮素對腫瘤的抑制有一定的效果。

山豆根通過通路調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子、細(xì)胞分化、細(xì)胞調(diào)亡等機(jī)理起到抑癌作用。Prostate cancer（hsa05215）通過NKX3.1、PTEN和p27蛋白調(diào)控藥理作用;Ras signaling pathway（hsa04014）通過GTPase行使腫瘤抑制基因的功能，促進(jìn) Ras活化蛋白水解，抑制腫瘤的發(fā)生;Neurotrophin signaling pathway（hsa04722）通過腫瘤抑制因子和細(xì)胞分化促進(jìn)癌細(xì)胞分化和調(diào)亡。

2.3 山豆根“藥材-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路-藥理作用-臨床應(yīng)用”網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建 整合山豆根的化學(xué)成分、靶點(diǎn)和通路信息，結(jié)合文獻(xiàn)報道的山豆根藥理作用和臨床應(yīng)用，得到“藥材-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路-藥理作用-臨床應(yīng)用”的作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。

3 結(jié)論與討論

通過對山豆根作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)，主要與癌癥、炎癥、肝病、心血管病等藥理作用有關(guān)，其中Prostate cancer（hsa05215）、Pathways in cancer（hsa05200）等10條通路與癌癥相關(guān)。針對山豆根25種化學(xué)成分進(jìn)行分析，其中有20種成分作用于上述藥理作用相關(guān)通路，各自調(diào)控不同的基因，包括苦參堿、氧化苦參堿、臭豆堿、槐胺、槐定堿、山豆根色滿二氫黃酮 A、山豆根色滿二氫黃酮 C、8-甲雷杜辛、山豆根色滿查耳酮A、山豆根色滿查耳酮B、山豆根色滿查耳酮C、槲皮素、水仙苷、槐花二醇、麥芽酚、番石榴酸乙酯、大黃素、大黃素甲醚、β-谷甾醇、三葉豆紫檀苷，其中山豆根色滿二氫黃酮A的作用最為廣泛， 涉及了癌癥、炎癥、心血管疾病、肝病及血脂水平的調(diào)控;參與對癌癥調(diào)控的成分主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐胺、槐定堿、臭豆堿、番石榴酸乙酯、山豆根色滿二氫黃酮 A、山豆根色滿二氫黃酮 C、山豆根色滿查耳酮A、山豆根色滿查耳酮B、山豆根色滿查耳酮C、槲皮素、水仙苷、大黃素、大黃素甲醚、β-谷甾醇、麥芽酚、三葉豆紫檀苷。山豆根色滿二氫黃酮A、槐胺、水仙苷3種化學(xué)成分對炎癥有調(diào)控作用;對心血管病的調(diào)控有槐花二醇、山豆根色滿二氫黃酮A、β-谷甾醇、大黃素甲醚、山豆根色滿查耳酮A、槐定堿;涉及肝病的有大黃素甲醚、山豆根色滿二氫黃酮A和槐定堿。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來尋找、優(yōu)化和確認(rèn)中藥作用靶點(diǎn)，通過建立“藥材-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路-藥理作用-臨床應(yīng)用”網(wǎng)絡(luò)模型，構(gòu)建起完整的網(wǎng)絡(luò)圖。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，探討中醫(yī)藥的藥效成分及其潛在的藥理作用和臨床應(yīng)用，為新藥研發(fā)和藥物作用機(jī)制的研究提供了新思路。

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