毛 源, 鄭江南, 封 順*, 田瑞軍*

(1.西南交通大學生命科學與工程學院, 四川 成都 610031; 2.南方科技大學理學院化學系, 廣東 深圳 518055)

分泌蛋白質組(secretome)是指細胞、組織等分泌的全部蛋白質,廣義的分泌蛋白組還包括從細胞膜表面脫落(ectodomain shedding)的細胞質膜蛋白[1]。許多分泌蛋白,如細胞因子、生長因子和激素等,在細胞間信號轉導等過程中發(fā)揮著關鍵的功能。分泌蛋白的動態(tài)變化通常反映了細胞的生長情況和病理狀態(tài)。分泌蛋白構成了很大一部分藥物靶標,同時也是重要的生物標志物[2]。細胞的條件培養(yǎng)基是分泌蛋白質組研究的重要樣本。目前,基于生物質譜的蛋白質組學分析可以實現(xiàn)對分泌蛋白的系統(tǒng)研究[3]。分析培養(yǎng)基中的分泌蛋白的主要問題在于條件培養(yǎng)基中的分泌蛋白濃度較低[4-7],培養(yǎng)基中的血清、氨基酸和添加劑等的存在可能會干擾后續(xù)的蛋白質分析。常規(guī)的分泌蛋白質組分析使用無血清細胞培養(yǎng)以降低樣品的復雜性,一般先采用超濾、透析、凍干和三氯乙酸(TCA)或丙酮沉淀進行蛋白質的濃縮、純化和除鹽,然后進行酶解和質譜分析。這一分析流程無法實現(xiàn)特異性的富集分泌蛋白,從而導致分泌蛋白的鑒定數(shù)目較少。此外,長時間無血清培養(yǎng)細胞也容易導致其活性狀態(tài)的意外改變。而基于生物正交的富集方式則可以有效避免這個問題。

近年來,含有生物正交基團(如疊氮基)的非天然糖已被用于代謝標記糖基化蛋白質[8,9],從而實現(xiàn)對糖蛋白的細胞成像或選擇性富集并用于蛋白質組學分析。該策略分為兩個步驟:疊氮基糖類似物被添加到細胞培養(yǎng)基中,通過細胞內的聚糖生物合成途徑引入到糖蛋白上;然后通過點擊化學反應特異性地與成像探針或親和探針進行共價標記。由于分泌蛋白通常是糖蛋白,這種糖代謝標記已被用于分泌蛋白的標記和富集[10]。N-疊氮乙酰半乳糖胺(GalNAz)、N-疊氮乙酰葡萄糖胺(GlcNAz)和N-疊氮乙酰甘露糖胺(ManNAz)是最經典的疊氮基糖類似物[8,11,12],有研究對比了它們對細胞質膜蛋白的標記效果,然而,目前只有ManNAz被用來進行分泌蛋白的代謝標記,尚未報道其他兩種糖類似物用于標記分泌蛋白。

本文通過結合糖代謝標記、點擊化學和基于質譜的蛋白質組學,系統(tǒng)地評估了ManNAz、GalNAz和GlcNAz 3種非天然糖對分泌蛋白的標記情況。通過無標定量(LFQ)蛋白質組學分析,探索最適合的分泌蛋白的糖代謝標記方法。這項工作提供了一種對細胞分泌蛋白進行全局、位點特異性以及定量研究的手段,并為分泌蛋白的糖代謝標記方法的選擇提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Easy-nLC 1000色譜系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific);Orbitrap Fusion質譜儀(Thermo Fisher Scientific)。

高糖DMEM(達爾伯克改良伊格爾,dulbecco’s modified eagle’s medium)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Corning公司。胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司。GalNAz、GlcNAz、ManNAz、三(3-羥丙基-三唑甲基)胺(THPTA)購自Click Chemistry Tools公司。0.22 μm一次性無菌過濾器、Amicon Ultra超濾管(15 mL,截止相對分子質量3 kD)購自Millipore公司。鹽酸氨基胍、五水硫酸銅、三氟乙酸(TFA)購自阿拉丁試劑有限公司。鏈霉親和素(streptavidin)瓊脂糖微球購自Thermo Scientific。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)購自Amresco公司。苯基甲磺酰氟(PMSF)購自Auragene公司。乙腈(ACN,色譜純)購自BCR國際貿易公司。甲醇(色譜純)購自Merck公司。十二烷基硫酸鈉(SDS)購自Biosharp公司?？箟难徕c、氯乙酰胺(CAA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、碳酸氫銨、尿素、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)購自Sigma-Aldrich公司。胰蛋白酶(測序級)購自Promega公司。Lys-C(測序級)購自Wako公司。炔基生物素探針由本實驗室合成。

1.2 實驗步驟

1.2.1細胞培養(yǎng)與代謝標記

將HeLa細胞置于37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中,在含(10%, v/v)FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細胞生長至覆蓋培養(yǎng)皿底部面積的60%時,用PBS洗滌細胞3次,然后分別向無血清DMEM培養(yǎng)基中添加0.1 mmol/L ManNAz、GalNAz和GlcNAz進行代謝標記,細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后完成代謝標記過程。

1.2.2條件培養(yǎng)基的收集

收集條件培養(yǎng)基,以300 g的轉速離心5 min,取上清液再以3 000 g的轉速離心10 min,以去除細胞碎片和死細胞。之后收集上清液,用0.22 μm濾膜過濾。在濾液中加入1 mmol/L EDTA-Na2、10 mmol/L CAA和0.1 mmol/L PMSF,然后使用3 kDa超濾管于4 ℃、4 000 g條件下將條件培養(yǎng)基濃縮至約600 μL。向超濾管中加入12 mL PBS,再將其超濾濃縮至約600 μL,重復此過程3次,使分泌蛋白樣品置換到PBS中。使用Pierce 660蛋白測定試劑測定蛋白質濃度。

1.2.3利用點擊化學探針進行銅催化的點擊反應

制作硬顆粒飼料過程中的水分調控涉及混合機處水分調控、調質過程的水分調控和顆粒冷卻過程的水分調控，是一項系統(tǒng)工程。實施這一系統(tǒng)工程的目標應當是：①使粉料在調質過程得到良好的調質質量，即達到理想的水分、熟化程度和流變學特性；②獲得較高的制粒產量、成品率、生產效率和較低的電耗；③得到理想的顆粒堅實度（耐久性）；④得到較好的成品儲存特性指標，包括安全水分、低水分活度，均勻的水分分布；⑤獲得好的動物生產性能。本文就如何實現(xiàn)這一系統(tǒng)工程技術進行綜合論述，以期為相關企業(yè)和人員進行這類操作提供借鑒。

銅(Ⅰ)催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(CuAAC)[13,14]是應用最廣泛的點擊反應。將超濾后的樣品通過CuAAC點擊反應[15]與炔基化試劑進行反應。我們在每個樣品中依次加入100 μmol/L炔基生物探針、13.5 mmol/L鹽酸氨基胍和催化劑(0.675 mmol/L硫酸銅、3.38 mmol/L THPTA和新制的16.9 mmol/L抗壞血酸鈉的預混溶液)(均為加入后的濃度),在常溫下振蕩反應2 h。通過氯仿-甲醇蛋白沉淀法去除多余的探針。之后將蛋白沉淀溶解于尿素緩沖液(8 mol/L尿素,200 mmol/L Tris, pH 7.4)中。

1.2.4生物素化蛋白的富集與酶解

將1.2.3中得到的蛋白溶液與15 μL Streptavidin瓊脂糖微球置于旋轉混勻儀上于4 ℃孵育2 h。依次使用0.4 mL尿素緩沖液(6 mol/L尿素、0.1% SDS、10 mmol/L Tris, pH 7.4)和0.4 mL 1 mol/L氯化鈉溶液各洗滌3次。然后向樣品管中加入300 μL的烷基化反應緩沖液(5 mmol/L TCEP、50 mmol/L CAA、0.2 mol/L碳酸氫銨、0.5 mol/L氯化鈉),于37 ℃振蕩孵育30 min。之后向樣品管中分3次加入0.4 mL的20%(v/v)乙醇水溶液洗滌。微球用胰蛋白酶(酶與底物質量比為1∶200)在50 mmol/L碳酸氫銨和37 ℃條件下酶解12 h。將微球懸濁液離心后,收集上清液。之后用PNGase F(酶與底物質量比為1∶200)酶解12 h;將微球懸濁液離心后收集上清液。將上清液用三氟乙酸(TFA)酸化至pH<3后使用StageTips進行脫鹽。

1.2.5液相色譜-串聯(lián)質譜分析

液相色譜柱為C18毛細管填充柱(15 cm×100 μm, 粒徑1.9 μm,孔徑12 nm, Dr.Maisch公司)。流動相A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液;B相為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液。流速為250 nL/min。色譜有效梯度為7%B在100 min提高至22%B; 22%B在100～120 min提高至35%B。質譜使用數(shù)據(jù)依賴采集模式,循環(huán)時間為3 s,一級質譜離子掃描的m/z范圍為350～1 550,分辨率為120 000,自動增益控制(AGC)為2×105,最大注入時間(IT)為100 ms,分離窗口1.6 Da,離子價態(tài)限定為2～4,動態(tài)排除時間為30 s。二級質譜檢測器類型為離子阱,碎裂模式為HCD,最大IT為35 ms,歸一化碰撞能(NCE)為30。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

質譜數(shù)據(jù)使用MaxQuant[16]和UniProtKB人類蛋白質組數(shù)據(jù)庫(2020年1月發(fā)布,74 823個條目,附加188個高豐度牛血清蛋白序列)對質譜原始數(shù)據(jù)進行檢索。酶的特異性設置為Trypsin/P,最多允許兩個酶切遺漏點。固定修飾設置為半胱氨酸烷基化,可變修飾設置為甲硫氨酸氧化和天冬酰胺脫酰胺化。LFQ分析使用“Match between runs”功能,蛋白質和多肽鑒定的假陽性率(FDR)控制在1%以內。

使用Perseus軟件(1.6.17.0版)[17]進行統(tǒng)計分析。過濾掉反庫序列、僅靠位點鑒定的蛋白和污染蛋白。鑒定的蛋白質至少在一組(每組3次生物學獨立重復)中有>1個unique肽段并且擁有3個有效值的蛋白質數(shù)據(jù)被保留做定量分析。LFQ強度進行l(wèi)og2變換,缺失值依據(jù)正態(tài)分布替換width(替換區(qū)間寬度): 0.3, downshift(替換位置下調度): 1.8。通過雙側t檢驗分析兩組之間的差異性(基于置換檢驗的(permutation-based)FDR<0.05, S0=2)。使用DAVID(6.8版)[18,19]進行基因本體(GO)富集分析,分類的p值<0.05。對于N-糖基化位點分析,僅保留符合N-X-S/T/C(X≠P)序列的肽段,并篩選出位點定位得分≥50、定位概率≥0.8的數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與討論

2.1 實驗設計與可行性討論

圖1 基于質譜分析的分泌蛋白富集

因此,我們選擇使用ManNAz、GalNAz和GlcNAz 3種最常用的疊氮基糖類似物對HeLa細胞的分泌蛋白進行代謝標記。收集條件培養(yǎng)基中的疊氮標記的分泌蛋白,通過CuAAC與炔基生物素反應,再用Streptavidin微球富集生物素化的蛋白質。使用胰蛋白酶(trypsin)對富集到的蛋白質進行酶解,再將酶解下來的肽段進行LC-MS檢測。之后通過N-糖酰胺酶F(PNGase F)酶切釋放微球上保留的N-糖肽,將得到的去糖基化肽段進行質譜分析,以獲得N-糖基化位點信息(見圖1b)。

2.2 不同糖類似物標記的細胞中分泌蛋白的鑒定分析

將基于3種糖類似物標記的方法在3次重復實驗中富集到的蛋白質組和特異性肽段(unique peptide)篩選出來進行對比分析。GalNAz組鑒定到了1 487個蛋白和11 520個特異性肽段;GlcNAz組鑒定到了1 462個蛋白和11 612個特異性肽段;ManNAz組鑒定到了1 591個蛋白以及12 187個特異性肽段(見圖2a)。進一步對各平行實驗進行定量重復性評估,各平行實驗間的皮爾遜相關系數(shù)都大于0.94,表現(xiàn)出了良好的生物學重復性(見圖2b)。3組實驗鑒定到的共有蛋白超過了80%。我們將3組實驗中鑒定到的蛋白與Uniprot的蛋白數(shù)據(jù)庫進行對比,結果表明ManNAz組檢測到的1 591個蛋白中有282個蛋白被Uniprot注釋為分泌蛋白,224個蛋白被注釋為細胞質膜蛋白;GalNAz組鑒定到的1 487個蛋白中有271個蛋白被注釋為分泌蛋白,204個蛋白被注釋為細胞質膜蛋白;GlcNAz組鑒定到的1 462個蛋白中有276個蛋白被注釋為分泌蛋白,192個蛋白被注釋為細胞質膜蛋白(見圖2c與圖2d)。我們也使用傳統(tǒng)方法對無血清培養(yǎng)的HeLa細胞條件培養(yǎng)基進行了直接分析,3次重復實驗中共鑒定到了1 473個蛋白,其中249個為分泌蛋白。將傳統(tǒng)方法與3種糖代謝標記方法鑒定到的分泌蛋白進行LFQ intensity的對比,可以看出,基于直接分析的傳統(tǒng)方法,經過3次重復實驗鑒定到的所有分泌蛋白的總LFQ強度(3次重復實驗的平均值)顯著低于代謝標記方法(見表1)。該結果表明,基于代謝標記的方式可以鑒定到更多的分泌蛋白。其中基于ManNAz的代謝標記在分泌蛋白質的富集中具有一定的優(yōu)勢,其富集到的分泌蛋白質數(shù)與細胞質膜蛋白質數(shù)多于其他兩組,三者間的總體差異不大。共有的分泌蛋白質數(shù)為261個,在3組中的占比超過了90%;共有的細胞質膜蛋白數(shù)為179個,在3組中的占比超過了70%。

圖2 基于3種糖類似物的分泌蛋白質分析結果

表1 直接鑒定與基于代謝標記方式的富集結果

2.3 分泌蛋白的定量分析與糖基化位點鑒定分析

對3組糖類似物鑒定到的蛋白質進行進一步的無標定量分析。ManNAz組在分泌蛋白的定量富集中鑒定到的LFQ強度值相比于GalNAz組與GlcNAz組分別提高了130%與67.2%;在細胞質膜蛋白的定量富集中鑒定到的LFQ強度值相比于其他兩組分別提高了273.3%與148.7%(見圖3a)。三者在分泌蛋白和細胞質膜蛋白的定量富集中存在著顯著的差異。分析其原因可能是因為分泌蛋白在進行糖基化修飾時通常更多地利用唾液酸進行修飾,而ManNAz在進入細胞后會轉化為N-乙酰疊氮唾液酸,從而被有效地結合到分泌蛋白上。

圖3b展示了3種糖類似物分別鑒定到的糖蛋白、糖肽以及糖基化位點的結果。ManNAz組鑒定到352個糖蛋白、754個糖肽以及846個糖基化位點;GalNAz組鑒定到290個糖蛋白、460個糖肽以及512個糖基化位點;GlcNAz組鑒定到302個糖蛋白、511個糖肽以及563個糖基化位點。ManNAz組的糖蛋白、糖肽與糖基化位點數(shù)目相比于GalNAz組分別提高了21.4%、63.9%以及65.2%;相比于GlcNAz組則分別提高了16.6%、47.6%以及50.3%。N-糖肽與N-糖基化位點的顯著差異結果進一步表明ManNAz組定量富集分泌蛋白的優(yōu)勢可能來源于ManNAz對糖基化位點的高效標記。

圖3 分泌蛋白的定量富集與糖基化鑒定結果(n=3)

2.4 分泌蛋白的差異化分析

對GalNAz、GlcNAz與ManNAz 3個實驗組中鑒定到的分泌蛋白質進行差異化分析,其結果以火山圖的形式表現(xiàn)。相比于GalNAz組,ManNAz組存在著1 018個顯著增加的蛋白與9個顯著減少的蛋白,其中有141個被鑒定為顯著增加的分泌蛋白(紅點表示)(見圖4a);相比于GlcNAz組,ManNAz組存在著121個顯著增加的蛋白,其中有18個被鑒定為分泌蛋白(見圖4b)。上述結果表明,ManNAz相比于GalNAz與GlcNAz具有更好的標記分泌蛋白的能力。圖4c展示了GalNAz與GlcNAz之間的差異蛋白火山圖,可以看出兩種糖之間并無顯著性差異的分泌蛋白,這可能是由于二者可以在細胞內相互轉化,能夠以相同的形式標記到蛋白質上,從而導致了它們的標記效率沒有明顯差異[20,21]。之后對圖4中ManNAz組中顯著增加的1 018個蛋白做了GO分析。結果表明,這些差異化的蛋白主要分布在細胞外區(qū)域,與分泌蛋白的分布情況相符(見圖4d)。上述結果表明ManNAz組相比于其他兩組對分泌蛋白的定量富集具有高選擇性。

圖4 差異化蛋白分析

3 結論

分泌蛋白是許多疾病發(fā)生過程中的重要標志物,對于分泌蛋白的系統(tǒng)研究是目前的難點與熱點。在這項工作中,我們將3種糖類似物(GalNAz、ManNAz和GlcNAz)進行了系統(tǒng)的比較,結合代謝標記、點擊化學以及質譜檢測對分泌蛋白進行了富集與分析。實驗結果表明ManNAz對于分泌蛋白及相關蛋白的定量富集效果顯著強于另外兩種糖類似物。我們還發(fā)現(xiàn)基于ManNAz的代謝標記能鑒定到更多的糖基化位點,體現(xiàn)了ManNAz在分泌蛋白糖基化修飾過程中的巨大優(yōu)勢。本研究結果證明了ManNAz是研究基于糖代謝標記與點擊化學相結合的分泌蛋白質組學的優(yōu)秀工具,為分泌蛋白高選擇性富集和系統(tǒng)分析提供了有益的對比分析和新技術策略。