王俏琦 章元兵 張子恒 周爽 劉冀瓏

2020年10月7日，2020年度諾貝爾化學獎授予德國馬克斯·普朗克病原學研究室的生物化學家沙彭蒂耶（E. Charpentier）和美國加州大學伯克利分校的生物化學家杜德納（J. A. Doudna），以表彰兩人“開發(fā)了一種基因組編輯方法”。她們是第6位和第7位獲得諾貝爾化學獎的女性。

沙彭蒂耶1968年出生于法國，1995年在巴黎巴斯德研究所獲得博士學位，過去20年在5個不同國家9所不同大學工作過，已獲得10項久負盛名的科學獎項，目前是德國馬克斯·普朗克病原學研究所所長。杜德納1964年出生于美國，1989年從哈佛醫(yī)學院畢業(yè)獲得博士學位，曾在2016年獲得世界杰出女科學家成就獎，目前是加州大學伯克利分校教授、霍華德·休斯醫(yī)學研究所研究員。

當細菌和病毒入侵人體，人體的免疫系統(tǒng)就會反擊。同樣，細菌在漫長的進化過程中，也形成了一套防御病毒入侵的“免疫系統(tǒng)”——CRISPR/Cas系統(tǒng)，CRISPR是成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的縮寫，Cas是CRISPR相關（CRISPRassociated）基因的縮寫。病毒侵入細菌后把自身的基因整合到細菌基因組中，利用細菌細胞復制自己的基因，而細菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識別病毒的基因，并將其從自己的基因組上切除。

CRISPR/Cas基因編輯技術就是由一段相當于GPS可精準定位基因組目的序列的向導RNA，將“上帝的手術刀”核酸內切酶Cas9指引到特定目的序列處，由核酸內切酶Cas9將基因組DNA切出缺口，然后利用機體自身的DNA雙鏈斷裂修復機制，產生插入（或）刪除的突變來實現(xiàn)基因敲除，或者利用外源模板序列進行同源重組修復。

沙彭蒂耶發(fā)現(xiàn)了一種之前未知的分子——tracrRNA，而它則是細菌古老免疫系統(tǒng)CRISPR/Cas的一部分，它可通過裂解病毒DNA來對付病毒的入侵。沙彭蒂耶與杜德納合作，又成功地再造了細菌的基因剪刀，簡化了剪刀的分子組成，并對基因剪刀重新編程，使其可以被控制，可以在一個預定位置切斷DNA分子。

利用CRISPR/Cas9技術可極其精確地改造動物、植物和微生物的DNA，它對生命科學產生了革命性的影響。比如，構建動物疾病模型，為癌癥治療提供新思路，使治愈遺傳性疾病的夢想成為現(xiàn)實，甚至提供了創(chuàng)造新物種的可能性。

CRISPR研究的歷程

一般認為CRISPR系統(tǒng)是在1987年被首次發(fā)現(xiàn)的。日本納卡塔（A. Nakata）研究組在分析大腸桿菌基因組中與磷酸鹽代謝相關基因的過程中，偶然發(fā)現(xiàn)了位于堿性磷酸酶同工酶（iap）基因的3’端有一段長度為29個堿基對的短序列會重復出現(xiàn)，當時他們對這個特征序列本身并沒給予過多關注，甚至論文里也僅僅是提到這一序列，但并未將其命名[1]。

CRISPR系統(tǒng)被真正作為研究對象是在1993年。莫伊察（F. Mojica）在西班牙阿里坎特大學攻讀博士學位期間發(fā)現(xiàn)：地中海富鹽菌（Haloferax mediterranei），一種在西班牙圣波拉港口被發(fā)現(xiàn)的極度耐鹽的古菌，其限制性內切酶會受到培養(yǎng)基中鹽濃度的影響，而以不同方式切割自身的基因組。在研究這種現(xiàn)象時，莫伊察發(fā)現(xiàn)了一段與微生物中已知序列都不同的長約30個堿基的重復的近似回文的序列，這個固定序列之間由大約36個堿基間隔開。之后，莫伊察又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，在與地中海富鹽菌親緣關系近的沃氏富鹽菌（Haloferax volcanii），以及與其親緣關系較遠的嗜鹽古菌中，也有類似的保守序列。很快，莫伊察意識到這段序列與1987年納卡塔研究組發(fā)表的文獻中的細菌特征序列之間的聯(lián)系，他認為在不同種微生物中，都存在這樣一段序列，并且它們發(fā)揮著重要的作用，最終將其命名為短規(guī)律性間隔重復序列（short regularly spaced repeats）。到2000年，莫伊察已在20種微生物中發(fā)現(xiàn)這段重復序列。之后兩年內，研究者們迅速將對這個基因座的研究拓寬到與這段序列有關的特定基因。2002年，詹森（R. Jansen）實驗室發(fā)表論文，首次將這段序列命名為CRISPR，將與其相關的特定基因命名為Cas基因。

但是，這段特別序列的功能在很長一段時間里一直沒有弄清楚。2003年莫伊察作為CRISPR領域的新領導者，開始將注意力放在將此重復序列隔開的間隔子（spacer）上。由于間隔子序列具有種內保守的特點，莫伊察將不同的間隔子序列進行大量比對，最終發(fā)現(xiàn)有一種間隔子的序列與感染大腸桿菌的P1噬菌體基因組某段序列相吻合。此后，他又通過一系列比對發(fā)現(xiàn)，CRISPR中的間隔子序列來自外源噬菌體或者質粒。值得注意的是，博洛廷（A. Bolotin）首次提出CRISPR基因座會通過反義RNA來抑制噬菌體基因的表達，雖然之后這個假說被證實是錯誤的，但它率先賦予了CRISPR在免疫學方面的意義。

CRISPR在細菌免疫系統(tǒng)中的作用是由霍瓦特（P. Horvath）揭示的。在克服困擾工業(yè)生產的噬菌體感染時，霍瓦特致力于開發(fā)基于DNA的菌株鑒定技術，并使用CRISPR對菌株進行基因分型。2004年，他同樣注意到間隔子與細菌對噬菌體抗性之間的聯(lián)系。2005年，霍瓦特及其同事試圖證實CRISPR是一種細菌的適應性免疫系統(tǒng)。2007年，霍瓦特描述了一種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）在被噬菌體入侵后，鏈球菌基因組內會整合進來自噬菌體基因組的間隔子序列，當該鏈球菌再次被同樣的噬菌體入侵時，鏈球菌就可產生抗性，而如果改變這段間隔子序列，則會影響該鏈球菌的抗性。同時還發(fā)現(xiàn)，鏈球菌獲得這種抗性需要Cas7蛋白的參與（但維持抗性不需要Cas7蛋白），而Cas9蛋白——其序列包含兩種類型核酸酶結構域（HNH和RuvC）——及其產物，可能會切割核酸，它對抵抗噬菌體是必需的，所以，Cas9蛋白被認為是細菌免疫系統(tǒng)的活性成分。

科學家們很快開始進一步研究CRISPR/Cas的作用機理，第一個關鍵研究來自范德歐斯特（J. van der Oost）團隊。他們通過將一種大腸桿菌的CRISPR系統(tǒng)插入另一種缺乏內源性CRISPR系統(tǒng)的大腸桿菌菌株中，從生化角度驗證了該系統(tǒng)是由5種Cas蛋白組成的復合物，并將其命名為級聯(lián)復合物（cascade）。然后通過依次敲除級聯(lián)復合物每個組分，證明級聯(lián)復合物對于切割從CRISPR基因座轉錄而來的前體CRISPR RNA（crRNA）是必要的，最終切割產物是具有61個堿基的crRNA，它由上一個重復序列最后8個堿基、完整間隔子序列和下一個重復序列的起始部分組成，可將Cas蛋白引導至目的DNA上。隨后，范德歐斯特通過分別構建反義方向（與mRNA和編碼鏈DNA的序列互補）和順義方向（僅與另一條DNA互補）兩種CRISPR序列，使得其可以靶向到λ噬菌體的必需基因上。他們的研究結果暗示了CRISPR不是作用于RNA，而是作用于DNA。

同年，瑪拉菲尼（L. Marraffini）和松特海默爾（E. Sontheimer）證實了CRISPR的作用靶標是DNA。兩年后，即2010年，穆瓦諾（S. Moineau）等人發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9在目的DNA的原間隔子鄰近基序（protospacer adjacent motif， PAM）上游3個堿基對處進行切割，產生雙鏈斷裂缺口（double-strand break， DSB）。

而與此同時，沙彭蒂耶正著力于研究病原體化膿性鏈球菌是如何實現(xiàn)基因調控的。2011年，沙彭蒂耶等對鏈球菌內大量小RNA進行定位研究，發(fā)現(xiàn)其堿基序列非常接近已揭示的CRISPR基因座，一系列研究證實，一種未知的RNA分子對于CRISPR系統(tǒng)的功能實現(xiàn)具有重要作用，遂將其命名為反式激活的CRISPR RNA，簡稱tracrRNA（trans-activating crRNA），tracrRNA通過與crRNA形成雙鏈體，將Cas9引導至靶標。

由于之前從未接觸過CRISPR系統(tǒng)，沙彭蒂耶在一次參加在波多黎各召開的會議上，遇到來自美國加州大學伯克利分校的杜德納博士，沙彭蒂耶邀請杜德納進行合作研究，杜德納欣然接受。杜德納的同事們通過數(shù)字會議為合作制定了計劃，此前他們猜測細菌中的Cas9最終執(zhí)行切割DNA的作用，但在體外并沒有得到驗證。

2012年，她們將重組表達的Cas9與體外轉錄的crRNA和tracrRNA聯(lián)合使用，成功構建出可體外切割純化DNA的CRISPR/Cas系統(tǒng)：通過成熟的crRNA與tracrRNA形成雙鏈RNA結構，引導Cas9蛋白靶向結合目的DNA片段，通過切割引起DNA雙鏈斷裂，從而使得CRISPR/Cas系統(tǒng)具有編輯基因的可能[2]。

在沙彭蒂耶和杜德納的工作啟發(fā)下，美國哈佛大學丘奇（G. Church）研究組與張鋒研究組率先在哺乳動物中實現(xiàn)了基因編輯[3，4]。其后，在短短幾年內這項技術風靡世界各地的實驗室，成為生物學界最流行的基因編輯工具。

2013年，世界各地先后已經有多家實驗室使用 CRISPR/Cas9，在包括人細胞系和多種模式生物中，比如斑馬魚、酵母、線蟲、果蠅、小鼠、大鼠等，實現(xiàn)了對目的基因的編輯[5]。2015年CRISPR技術被美國《科學》周刊評為年度最佳科學突破。

2016年，張鋒課題組率先將一種稱為C2c2（也稱Cas13a）的酶，用于CRISPR系統(tǒng)中，成功地對RNA進行了編輯。同年10月份，又有科學家首次利用CRISPR/Cas9編輯過的細胞開展人體臨床試驗，他們從患有轉移性非小細胞肺癌患者血液中分離出的免疫細胞，通過CRISPR/Cas9技術特異性地敲除其中的PD-1基因，然后經體外擴增培養(yǎng)，再回輸入患者體內，以期達到治愈癌癥的目標。

2017年，美國邁阿密大學的課題組設計了CRISPR-RNA-靶向（CRISPR-RNA-targeting， CRISPR-RT）系統(tǒng)，對RNA編輯做出了很大貢獻。此外，除了Cas13a，Cas13b和Cas13d的發(fā)現(xiàn)也推動了CRISPR系統(tǒng)的應用與發(fā)展。同年，劉如謙團隊將tRNA腺嘌呤脫氨酶的蛋白定向進化后，與CRISPR/ Cas9系統(tǒng)融合，在不引起DNA鏈斷裂的情況下實現(xiàn)了A-T到G-C的轉換，且其在人體細胞中的編輯效率超過50%。為治療多種單堿基突變遺傳疾病提供了有效工具[6]。

基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯新工具層出不窮，2018年，劉如謙團隊又進化出一種能夠識別多種PAM序列的Cas9變體，提高了CRISPR/Cas9的剪輯效率。同年，杜德納發(fā)布了CRISPR/Cas14系統(tǒng)。2019年，杜德納成功地對Cas9蛋白的活性進行了改造，使之僅在特定組織中具有活性。張鋒也開發(fā)出CRISPR/Cas12b系統(tǒng)，極大豐富了用于基因組編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)。

2020年初，新型冠狀病毒肺炎爆發(fā)，科學家基于CRISPR/Cas13a技術開發(fā)了用于檢測和定量SARSCoV-2病毒RNA的試劑盒，它無需對RNA進行反轉錄，而是直接對病毒RNA進行檢測。正如沙彭蒂耶所說：“CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經突破了界限，使基因工程技術更加地通用、有效和易操作。它的應用似乎真的沒有什么限制[7]?！?/p>

CRISPR的工作原理

在噬菌體或質粒等外源DNA入侵宿主后，外來核酸被加工成短片段，并被作為新的間隔子整合到宿主染色體內的CRISPR重復間隔子序列中，這個過程相當于宿主的一次“免疫記憶”。在外源核酸上鄰近間隔子序列下游有一段極其保守的基序（PAM），它對于間隔子序列的選擇加工非常重要。當入侵者再次入侵時，CRISPR序列的轉錄產物被核酸內切酶加工為成熟crRNA。crRNA的5’端包含被整合進宿主基因組的間隔子序列，它可與外源序列互補配對，而3’端包含一段CRISPR的重復序列，與tracrRNA結合形成雙鏈結構。帶有Cas內切酶的crRNA-tracrRNA組裝成核糖核蛋白復合體，通過間隔子序列與入侵核酸互補，進行特異性的破壞，從而實現(xiàn)宿主（細菌）的“二次免疫應答”[8]。

根據CRISPR基因座的不同，CRISPR系統(tǒng)可分為6種類型（Ⅰ-Ⅵ），它們有著不同的crRNA模式和特定的Cas蛋白[9]。與利用復雜的多Cas蛋白復合物進行crRNA結合和靶序列降解的Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)不同，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)采用單一核酸內切酶Cas9來識別雙鏈DNA的靶位點，核酸內切酶Cas9的兩個結構域（HNH和RuvC）分別切割兩條DNA鏈。這兩個不同結構域在PAM上游3個堿基對處剪接雙鏈DNA，HNH結構域負責切割與crRNA互補的DNA鏈，RuvC結構域負責切割另一條DNA鏈。其間，tracrRNA與crRNA中的重復序列堿基互補配對，形成獨特的雙鏈RNA結構。這個雙鏈RNA分子中約20個堿基靶向與其序列互補的DNA序列，并由Cas9進行DNA位點特異性切割，產生平末端的雙鏈斷裂缺口。然后，通過機體自身的DNA修復機制進行修復。一種是極易出錯的非同源末端連接修復（nonhomologous end joining， NHEJ），在切割位點產生短的隨機插入和（或）缺失；一種是通過高保真的同源重組修復（homology directed repair， HDR），在同源修復模板指導下，對DSB位點進行精確的修復。后來，通過人為地將crRNA和tracrRNA進行組合，形成單條RNA進行轉錄表達，得到嵌合的單鏈向導RNA（singleguide RNA， sgRNA），就極大地簡化了CRISPR基因編輯方法。

CRISPR的優(yōu)勢

基因編輯技術從本質上來講，是對DNA雙鏈斷裂損傷和修復機制的應用。外在因素如輻射和內在因素如細胞代謝產物，都會使DNA產生不同程度的損傷，DNA雙鏈斷裂是真核細胞中常見的一種DNA損傷類型，DNA雙鏈斷裂后，機體會通過兩種修復機制進行及時修復：非同源末端修復和同源重組修復[10]。截至目前，基因編輯技術已經過三代更迭，從鋅指核酸酶（zinc finger nucleases， ZFNs）技術，轉錄激活子樣效應子核酸酶（transcription activator like effector nucleases， TALENs）技術，再到CRISPR/Cas技術[11]。

ZFNs是融合蛋白，由鋅指蛋白和細菌的FokⅠ限制酶組成。鋅指蛋白包括串聯(lián)的鋅指結構域，它們屬于DNA結合結構域。每個鋅指結構域識別3個堿基，串聯(lián)的鋅指結構域使得ZFNs可潛在地結合到長的核苷酸序列上。使用時需成對設計，一個切割位點在側翼的正義鏈，另一個切割位點在側翼的反義鏈。當切割位點兩側的ZFNs結合后，F(xiàn)okⅠ限制酶在該位點發(fā)生二聚化并進行切割，造成具5’突出端的雙鏈斷裂。ZFNs技術使得DSB不必依賴自然發(fā)生，從而為基因工程發(fā)展奠定了基礎。

TALENs的構造與ZFNs類似，由串聯(lián)的轉錄激活因子樣效應子（TALE）的DNA結合結構域和FokI限制酶組成。與ZFNs不同的是，每個TALE蛋白識別單個特異性核苷酸，因此其結構更復雜，但設計更簡單。然而，ZFNs和TALENs技術操作難度大、構建組裝時間長，容易在細胞中積累，產生細胞毒性，動物實驗已證明它們會引發(fā)機體的免疫反應。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由向導RNA和Cas核酸酶組成，向導RNA結合到目的基因上，引導Cas蛋白切割目的序列產生雙鏈斷裂，根據不同實驗目的選擇不同Cas蛋白。通過修飾向導RNA的序列，就可以切割所選的任何靶序列。類似于ZFNs和TALENs系統(tǒng)，CRISPR/ Cas系統(tǒng)可用于通過非同源末端連接修復方式，在DNA切割位點處引入隨機突變，也可通過共同注射與DNA同源的工程化DNA載體，通過同源重組修復方式引入特定突變或插入。CRISPR/Cas系統(tǒng)使基因定點修飾變得更加高效。

與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)有很多優(yōu)勢：①設計簡單。CRISPR-Cas系統(tǒng)不像ZFNs和TALENs是依賴于蛋白與靶DNA之間的識別，而是由向導RNA和靶DNA之間形成核糖核苷酸復合物，利用核糖核苷酸識別靶向基因。②效率高，成本低。如創(chuàng)建突變小鼠時，僅需要將編碼Cas蛋白和向導RNA的RNA直接注射到小鼠胚胎中，相較轉染和選擇小鼠胚胎干細胞注射小鼠、再進行同源重組的方法，可節(jié)省幾個月甚至幾年時間。③可同時進行多基因突變操作。Cas9蛋白單體可與任意數(shù)量不同序列的特異性向導RNA組合，輕松實現(xiàn)用CRISPR/Cas9文庫進行多重基因組編輯。

CRISPR的應用與展望

在短短不到10年時間里，CRISPR得到了前所未有的高速發(fā)展，基于CRISPR的各類技術已在科研、醫(yī)療、農業(yè)等諸多方面得到廣泛應用。研究人員可以精確編輯引發(fā)疾病的突變基因，以使從根源上治愈此前束手無策的疾病。比如，通過特殊的病毒將CRISPR系統(tǒng)遞送到特定細胞中，針對性地修復致病的突變基因，目前這已在鐮刀型貧血癥、杜氏肌萎縮癥等疾病中成功驗證，并尋求臨床實驗[12]。在農業(yè)基因育種上，CRISPR技術可以對農作物基因組進行更便捷而又精確的修飾，以獲得更好的遺傳性狀，比如增強農作物抗性、改善農產品品質、提高產量。

CRISPR盡管其在基因編輯上展示出了巨大的潛力，但也存在不可忽視的風險。自CRISPR技術問世以來，關于其造成脫靶（即可能切割非目的序列的風險）的討論就從未停止過，盡管也在不斷地進行優(yōu)化，降低脫靶率，但至今尚未從根本上解決問題，錯誤地修飾其他基因可能會造成一系列無法想象的嚴重后果，這是CRISPR應用所面臨的一大障礙。

基因編輯導致的倫理問題，除了在醫(yī)療方面有待進一步討論和解決外，還有對于基因改造的倫理問題，比如用于強化人的某些生理機能，甚至造出一個“定制人”，都是需要我們認真思考和對待的?，F(xiàn)今在人類胚胎上的應用應當受到嚴格管控，在關注其帶來的增益效果時，其帶來的風險一樣應是每個人必須深思熟慮。

管控風險、避免違反倫理道德，并將其合理應用到生活中，是人類共同的責任。我們要在風險和倫理問題上時刻保持警惕和謹慎，也期待CRISPR在將來為人類帶來更多的意想不到的驚喜。

[1]Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product. J Bacteriol， 1987， 169（12）： 5429-5433.

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[12]Xu Y Y， Li Z J. CRISPR-Cas systems： overview， innovations and applications in human disease research and gene therapy. Comput Struct Biotechnol J， 2020， 18： 2401-2415.

關鍵詞：諾貝爾化學獎 基因編輯 CRISPR 修復 ■