王婷梅 龍秋儀 李成 林錦雄 冉亞妮

摘 要：近年來，人們對防曬化妝品使用效果的要求逐漸增加，防曬產(chǎn)品中防曬劑由單一添加配方逐漸變成復(fù)配使用為主，那么，多種防曬劑的復(fù)合使用是否安全，會帶來哪些潛在風(fēng)險，這是消費者也是研究人員十分關(guān)注的問題。體外安全性評價法由于測試時間短，試驗效率有所提高，同時避免了動物試驗成本高、周期長、重復(fù)性差及人體安全等問題，所以現(xiàn)在各企業(yè)和研究人員會優(yōu)先考慮體外評價法。文章主要介紹通過3D皮膚模型刺激性試驗、眼刺激試驗等體外方法對防曬產(chǎn)品進行安全性評價的原理。

關(guān)鍵詞：防曬產(chǎn)品;安全性評價;體外方法;3D皮膚模型刺激性試驗;眼刺激試驗

中圖分類號：R542.22 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-1064（2021）01-074-02

DOI：10.12310/j.issn.1674-1064.2021.01.032

隨著人們生活水平逐漸提高，具有美白、祛斑、抗氧化等功效的化妝品在人們?nèi)粘Ｉ钪械氖褂迷絹碓蕉?，防曬化妝品逐漸成為化妝品行業(yè)的重要產(chǎn)品之一?；瘖y品中加入防曬劑，是為了吸收或阻擋紫外線，使人體皮膚免受紫外線的損害。紫外線光譜有UVB、UVA、UVC三種。三者中，UVA和UVB對人體有直接危害;UVC的波長最短，但其能量最高，由于大氣層的作用，幾乎沒有到達地球表面的概率。白天的日照光含有大量UVB，其大部分會被大氣層吸收，只有極少量能到達地球表面，長時間照射會令皮膚產(chǎn)生黑色素，并會導(dǎo)致皮膚紅腫甚至蛻皮。白天的日照光中含有的UVA大部分能穿過大氣層到達地球表面，它對人體產(chǎn)生的危害是最大的，會破壞人體皮膚中的一些纖維組合物，對皮膚的傷害是累積且不可逆的。由此可見，人們對防曬化妝品的需求逐漸增加是非常必要的。

防曬化妝品是指隔絕或吸收陽光中的UVA和UVB，以防護人體皮膚免受或減少紫外線所引起的不良反應(yīng)為目的的化妝品。防曬化妝品中防曬劑的使用種類與使用量，不得超過規(guī)定要求的最大允許使用濃度，以確保防曬產(chǎn)品的使用安全性。

近年來，隨著消費者對防曬化妝品提出的使用要求或使用效果的增多，防曬產(chǎn)品中防曬劑的使用種類由原本僅添加一種逐漸增加到三至五種，一些企業(yè)為了達到其宣稱的更好的防曬效果，添加的防曬劑種類甚至更多。目前來說，圍繞多種防曬劑一起使用是否有相互產(chǎn)生作用的研究還不多，那么多種防曬劑的復(fù)合使用是否安全，會帶來什么潛在風(fēng)險，這也是消費者和研究人員十分關(guān)注的問題。

目前，我國在安全性評價方面的方法有很多，其中，體外安全性評價法由于測試時間短，試驗效率有所提高，同時避免了動物試驗成本高、周期長、重復(fù)性差及人體安全等問題，所以現(xiàn)在各企業(yè)和研究人員會優(yōu)先考慮體外評價法。

1 安全性評價體外方法

1.1 3T3中性紅攝取光毒性試驗

作為動物皮膚光毒性試驗的一種體外替代方法，我國體外3T3中性紅攝取光毒性試驗的技術(shù)已通過國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的測試，試驗技術(shù)日臻成熟，試驗步驟容易操作，測試費用低，測試周期短。

3T3中性紅攝取光毒性試驗結(jié)果是通過比較細胞毒性來判斷的，該試驗中的細胞毒性表現(xiàn)為在試驗樣品被模擬陽光輻射后的18～24小時，活性染料中性紅（NR）攝取的濃度來呈現(xiàn)的。NR是一種深綠色結(jié)晶性粉末、弱的陽離子染料，其在常溫常壓下穩(wěn)定，是一種活體及細胞的染色劑。當(dāng)細胞質(zhì)的pH值接近中性時，NR不帶電，而是變成帶正電并困在低pH的溶酶體腔內(nèi)。低pH的溶酶體腔的維持，需要ATP，并且依賴于溶酶體膜的完整性。光毒素可通過形成活性氧（ROS）等機制誘導(dǎo)細胞損傷，導(dǎo)致溶酶體膜通透性增加、pH梯度降低等逐漸形成的變化是不可逆的。這種情況引起的變化會導(dǎo)致NR的攝取和結(jié)合的減少，因此有可能區(qū)分活細胞和受損或死亡細胞。

秦美蓉等[1]通過對3T3中性紅攝取光毒性試驗的驗證研究，驗證了3T3成纖維細胞中性紅攝取試驗檢測化學(xué)物質(zhì)光毒性試驗方法的可行性。

1.2 3D皮膚模型刺激性試驗

3D皮膚模型是將特定細胞從人體活體皮膚組織中獲取并分離出來，后將細胞培養(yǎng)于特定的培養(yǎng)液上而得到的具有高度模擬人體皮膚模型。因為跟人體有相似的保護系統(tǒng)，因此可以避免因種間差異造成的試驗結(jié)果偏差。市場上常用的三維皮膚模型包括3D黑素皮膚模型（有我國的MelaKutis、美國的MelanoDerm等）、3D表皮模型（EpiKutis）、3D全層皮膚模型（有美國的EpiDrmFT、我國的FulKutis等）。皮膚刺激性試驗適用的皮膚模型是體外重組表皮模型EpiKutis、EpiDerm等。

皮膚模型體外刺激性評價主要包括皮膚刺激性單點試驗（SIT）和時間毒性（ET50）試驗。SIT試驗是將防曬化妝品或原料與表皮模型反應(yīng)，沖洗干凈，于特定條件的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，用MTT法對反應(yīng)后的表皮模型進行細胞活性的測試。根據(jù)皮膚表面組織活力來定性評價防曬化妝品或原料有無刺激性，組織活力大于50%判為無刺激性（NI）;組織活力小于50%判為有刺激性（I）。對于部分溫和的防曬化妝品或原料，需要延長樣品在模型的表面的停留時間，按照不同時間點進行暴露，以時間毒性（ET50）進一步評價不同防曬化妝品或不同原料之間的刺激性強弱。以不同時間點組織活力下降曲線來判定，ET50越小，表示模型對防曬化妝品或原料的耐受時間越短，則防曬化妝品或原料的時間毒性越強，因此時間毒性試驗特別適用于原料或配方與時間相關(guān)的刺激性進行比較。

Kandárová[2]等使用EpiDerm SIT驗證皮膚模型在皮膚刺激性中的可行性，可以區(qū)分有無刺激性。簡而言之，使用3D皮膚模型評價防曬化妝品或原料的皮膚刺激性，試驗周期短，相對于動物模型和臨床試驗，因其操作簡單、評價指標(biāo)直觀、測試成本減少、測試費用減少等特點，日益受到研究人員和企業(yè)的青睞。

1.3 眼刺激試驗

1.3.1 短時暴露試驗

短時暴露試驗采用的是兔角膜上皮細胞（SIRC），在培養(yǎng)板培養(yǎng)，然后將測試樣本暴露后，采用CCK-8細胞毒性測試法定量檢測細胞存活率。暴露后的細胞與CCK-8試劑反應(yīng)，活細胞線粒體中的脫氫酶會將CCK-8試劑還原成橙黃色的甲臜染料，存活細胞越多，被還原成的染料就越多，這時候，不同的顏料顏色與存活的細胞數(shù)量有線性關(guān)系。測定波長450 nm時的吸光度值，計算細胞的生存率，最終判斷樣品的眼刺激性程度。細胞的存活率大于70%，可判定樣品為無刺激或具有輕微刺激性;細胞的存活率小于或等于70%，需進行刺激性確認試驗，刺激性確認試驗后，如果細胞的存活率大于30%，證明樣品為中等眼刺激的樣品，如果細胞的存活率小于或等于30%，證明樣品為強眼刺激的樣品。

細胞培養(yǎng)是指將組織用胰蛋白酶等處理分離出來，于模仿人體體內(nèi)生長環(huán)境等條件下培養(yǎng)。其要在一定的生理條件下才能存活，對生存條件比較嚴苛。細胞培養(yǎng)現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于我國的細胞學(xué)、化妝品等各個領(lǐng)域，成為基礎(chǔ)研究科學(xué)的重要組成部分。黃瓊[3]等研究基因轉(zhuǎn)染家兔角膜上皮細胞，通過破裂解法提取質(zhì)粒、細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染結(jié)果的免疫組化檢測等試驗步驟，證實了外源基因可以轉(zhuǎn)移至兔角膜上皮細胞內(nèi)，為提高外源基因的靶向性和轉(zhuǎn)移效率提供了研究方向。

1.3.2 體外重組人角膜上皮模型試驗

體外重組人角膜上皮模型是由正常人角質(zhì)細胞的非角質(zhì)化上皮構(gòu)成，能夠模擬多層角膜上皮。據(jù)研究，SkinEthicTM和EpiOculaTM在眼刺激性試驗中具有良好的重復(fù)性。該試驗是將防曬化妝品或原料涂布作用于三維重組類似人角膜上皮組織模型，一定時間暴露后經(jīng)過清洗、孵育等步驟，通過MTT試驗測試組織細胞生存率，從而判定樣品的刺激性。相對于陰性對照組織，樣品平均組織活性大于60%時，判定該防曬化妝品或原料無眼刺激性（NI）;樣品平均組織活性小于或等于50%，判定該防曬化妝品或原料具有眼刺激性（I）。

劉小勇[4]等成功探討了人羊角膜上皮細胞誘導(dǎo)分化為角膜上皮細胞的可塑性及其重建角膜上皮的可行性，利用角膜基質(zhì)作為載體誘導(dǎo)HAECs分化，得到了在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及在角膜上皮特異性表面標(biāo)志蛋白CK3/12表達上，均類似角膜上皮細胞的細胞，進一步證明角膜基質(zhì)微環(huán)境在調(diào)控角膜上皮細胞的分化過程中起重要作用。

2 結(jié)語

物理防曬劑是不吸收紫外線的，它只起到物理阻擋及反射、散射紫外線的作用，是不改變自身的一個成分，相對于化學(xué)防曬劑來說比較穩(wěn)定。而化學(xué)防曬劑會吸收紫外線能量，大多化學(xué)防曬劑是可被皮膚吸收，然后進入皮下組織、血液循環(huán)系統(tǒng)等，而被皮膚吸收的成分是否存在潛在風(fēng)險仍是未知數(shù)。由于目前企業(yè)或機構(gòu)對于多種化學(xué)防曬劑一起使用是否有相互作用的研究不多，在試驗防曬產(chǎn)品的復(fù)配中，沒有控制多種化學(xué)防曬劑濃度的限度，種種因素疊加，可能給使用防曬化妝品的消費者帶來一定的風(fēng)險。

參考文獻

[1] 秦美蓉.3T3中性紅攝取光毒性試驗的驗證研究[J].今日藥學(xué)，2012，22（11）：687-689.

[2] Kandárová H，Hayden P，Klausner M，et al.An In Vitro Skin Irritation Test（SIT）using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal（RHE）Model[J].Electrophoresis，2009，（29）：1366.

[3] 黃瓊，胡燕華，姜發(fā)綱，等.脂質(zhì)體介導(dǎo)TGF-β1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家兔角膜上皮細胞的實驗研究[J].眼視光學(xué)雜志，2002，4（2）：103-105，108.

[4] 劉小勇，陳劍，周清，等.人羊角膜上皮細胞體外培養(yǎng)重建角膜上皮的實驗研究[J].中國病理生理雜志，2012，28（4）：689-693.