楊靜 張怡 何素芬 李雪 曹巧玲 王振

摘要：植物組織培養(yǎng)過程中，滅菌與消毒是防止微生物污染最基本的、最重要的環(huán)節(jié)，也是組培成功與否的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)以香石竹為培養(yǎng)材料，選用必潔仕牌二氧化氯消毒劑，對(duì)培養(yǎng)瓶、房間和外植體進(jìn)行消毒殺菌，再進(jìn)行接種培養(yǎng)，觀察其消毒殺菌效果，以及對(duì)外植體分化效果，為二氧化氯消毒劑應(yīng)用于植物組培快繁提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，供同行們參考。

關(guān)鍵詞：二氧化氯 消毒劑 香石竹 開放式組培

在植物組織培養(yǎng)過程中，防止和消除細(xì)菌、真菌及其他微生物的感染，除了培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶、接種工具用品必須嚴(yán)格消毒外，外植體表面消毒處理是非常重要的一環(huán)，也是外植體材料從帶菌狀態(tài)轉(zhuǎn)為無菌狀態(tài)的關(guān)鍵步驟。目前植物組培中最常用的消毒劑為氯化汞和次氯酸鈉等，汞為重金屬元素，對(duì)環(huán)境和人體都有極大的負(fù)面影響，同時(shí)國家嚴(yán)禁汞消毒廢液排入下水道，無害化處理操作繁瑣。次氯酸鈉殺菌效果常因植物種類不同，同一植物取材部位、取材時(shí)間不同而不同。我們以必潔仕牌二氧化氯消毒劑替代升汞和次氯酸鈉產(chǎn)品，在花卉香石竹組培過程中，用于外植體消毒試驗(yàn)探索，取得了一定的效果，但由于試驗(yàn)次數(shù)有限，試驗(yàn)結(jié)果僅供同行參考。

1.試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

香石竹莖段：選擇剪取當(dāng)年生長(zhǎng)健壯無病蟲害感染的香石竹莖干，剪掉葉片，再剪成帶兩個(gè)葉節(jié)的莖段。

1.2藥劑與用品

必潔仕牌二氧化氯消毒劑、次氯酸鈉、酒精、洗衣粉、新潔爾滅、無菌水、剪刀、鑷子、不銹鋼盤、培養(yǎng)皿等。

2.試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)采取單因子試驗(yàn)，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，6-BA、NAA用量不變，消毒劑處理方法和時(shí)間不變，只變動(dòng)消毒劑用量，分別為100㎎/L、80㎎/L、60㎎/L三個(gè)水平，用2%次氯酸鈉作對(duì)照，試驗(yàn)?zāi)康模Y選不同用量必潔仕消毒劑對(duì)香石竹外植體殺菌效果以及對(duì)芽分化的影響。

3.操作方法與步驟

3.1房間消毒

按1片A劑加5mLB劑，熏蒸5立方米房間，如果房間污染較嚴(yán)重的，可使用3片A劑加15mLB劑，熏蒸5立方米房間。

3.2培養(yǎng)瓶浸泡消毒

取必潔仕消毒劑母液（1200㎎/L），按1：30比例將母液稀釋，倒入一個(gè)塑料盆中，將培養(yǎng)瓶和瓶蓋放入消毒藥液中浸泡5分鐘，用毛巾在消毒液中浸濕后，擦拭工作臺(tái)面，除塵消毒，再用75%酒精噴霧臺(tái)面，把培養(yǎng)瓶和瓶蓋從消毒液中撈起，瓶口、瓶蓋向下倒扣在工作臺(tái)桌面上。剪刀、鑷子等接種工具，經(jīng)高壓或干熱滅菌后取出直接放入75%酒精瓶中備用。

3.3培養(yǎng)基及配制

MS+6-BA2-3㎎/L+NAA0.1-0.2㎎/L+瓊脂7g/L+蔗糖28-30g/L

依次從配好的母液中量按需取出大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物營(yíng)養(yǎng)液和6-BA、NAA于燒杯中，稱瓊脂、蔗糖，加水熬溶化后，倒入營(yíng)養(yǎng)液混合煮沸定溶，調(diào)整pH值為5.8-6.0，加入抗菌劑，煮沸2-3分鐘，分裝培養(yǎng)瓶，待凝固后備用。

3.4外植體表面清洗與消毒

3.4.1外植體選擇

選擇生長(zhǎng)健壯無病蟲害感染的當(dāng)年生香石竹莖段，剪去葉片，再剪成帶兩個(gè)葉節(jié)的小段。

3.4.2表面清洗與消毒

表面清洗與消毒，外植體取回來后，用自來水清洗表面，入三角瓶中加水和少許洗衣粉，振蕩洗滌1-2分鐘，自來水沖洗后，再加少許新潔爾滅振蕩洗滌后，在自來水下流水沖洗30-60分鐘，倒掉水后，加入75%酒精搖動(dòng)5-8秒，倒出酒精，用無菌水洗兩次，再把外植體材料放在60㎎/L-100㎎/L濃度必潔仕牌二氧化氯消毒劑溶液中振蕩消毒15分鐘。

3.5接種與培養(yǎng)

3.5.1接種方法

用浸泡培養(yǎng)瓶的消毒液擦拭工作臺(tái)，肥皂洗干凈雙手，再用75%酒精擦拭工作臺(tái)和雙手，打開瓶蓋，從75%酒精瓶中取出剪刀和鑷子，適當(dāng)剪去外植體莖段的兩端，用經(jīng)過滅菌的無菌紙吸去水多余的液滴，把外植體插入培養(yǎng)基中，蓋緊瓶蓋。

3.5.2室內(nèi)培養(yǎng)

有固定培養(yǎng)室的，把接種的培瓶擺放在培養(yǎng)架上，調(diào)控室內(nèi)溫度在25（±2）℃，光照2000-2500XL，也可利用自然光源在室內(nèi)培養(yǎng)。

4.試驗(yàn)觀察與統(tǒng)計(jì)

4.1污染統(tǒng)計(jì)

接種后3天起至12天結(jié)束觀察，三個(gè)不同濃度的二氧化氯消毒劑對(duì)外植體消毒效果，分別為60∠100∠80，最好的是80㎎/L，最差的是60㎎/L。污染和外植體死亡癥狀主要有三種情況：一是在外植體及其轉(zhuǎn)圍培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出白色或灰白色毛和黑色塊狀物;二是在培養(yǎng)基上形成紅色或白色菌斑，培養(yǎng)基變稀變臭;三是外植體葉或莖變白后死亡。其中濃度100污染較輕，變白致死的比例較重些，濃度為80、60的污染較重，變白致死較輕。對(duì)照試驗(yàn)的污染輕，但外植體變白死亡程度重。

4.2芽萌發(fā)與分化

外植體側(cè)芽萌發(fā)與叢生芽分化，接種第7天開始至20天觀察結(jié)束，二氧化氯消毒劑處理的外植體發(fā)芽早，接種7天開始萌芽，20天以后叢生芽數(shù)量顯著增多，叢生芽密集，弱苗細(xì)苗無效苗多，有玻璃化苗出現(xiàn)?？傮w表現(xiàn)：側(cè)芽萌發(fā)早（7天開始發(fā)芽）、多（平均1-12個(gè)），從生芽生長(zhǎng)弱，葉片細(xì)長(zhǎng)，葉色淡，有卷曲狀。對(duì)照材料發(fā)芽遲，接種15天后才有側(cè)芽萌發(fā)，叢生芽分化少，25天后叢生芽才分化，平均只有1-3個(gè)。

5.分析與討論

5.1在外植體及其轉(zhuǎn)圍培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出白色或灰白色毛和黑色塊狀物，多為真菌或其他老霉菌引起的污染?？赡茉?，接種環(huán)境和空氣帶菌，消毒不干凈;工作人員操作不熟練，不規(guī)范，敝開瓶口和材料暴露時(shí)間過久，被空氣中雜菌感染所致。

5.2在培養(yǎng)基上形成紅色或白色菌斑，培養(yǎng)基變稀變臭，多為細(xì)菌引起的污染?？赡茉?，工作臺(tái)、接種工具用具用品消毒不干凈，接種人員操作不規(guī)范，接種時(shí)工具與工作臺(tái)，瓶外壁觸碰，將菌源帶入所致;還有可能是材料自身體內(nèi)毒素向外溢出造成培養(yǎng)基污染。

5.3外植體變白后壞死，可能原因，消毒劑使用濃度過高，浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，外植體材料剪口破損，消毒液浸入材料內(nèi)部造成細(xì)胞組織受藥害導(dǎo)致中毒害死亡。

5.4外植體消毒不徹底，抗菌劑成分與配量沒達(dá)到最佳，材料體內(nèi)帶毒，表面消毒不能徹底消除體內(nèi)菌源，在培養(yǎng)過程中不斷產(chǎn)生出霉菌體并漫延所致。

5.5討論

必潔仕牌二氧化氯消毒劑，殺菌廣譜、能夠高效殺菌;無毒、無殘留、對(duì)人身體沒有傷害、對(duì)皮膚無刺激性;使用方法靈活多樣，即可以熏蒸對(duì)空間消毒，又可以配制成稀釋液，既可以對(duì)培養(yǎng)瓶浸泡殺菌，還可代替升汞作為外植體消毒，操作方便，省工省時(shí)，可大提高勞動(dòng)效率。

但由于植物生長(zhǎng)環(huán)境和材料本身差異，以及取材時(shí)間、部位不同，各種植物表面攜帶菌類和內(nèi)生菌種類均不同，所以不同種類的外植體消毒方法、使用濃度、處理時(shí)間均有待進(jìn)一步探索試驗(yàn)。

作者簡(jiǎn)介：

楊靜（1981-）女 碩士研究生 園林工程師 研究方向 園林工程與植物組織培養(yǎng)技術(shù)