張曉

摘要：高效液相色譜（HPLC）是以液體作為流動相，利用樣品各組分在流動相和固定相中分配系數(shù)或吸附系數(shù)的差異來實現(xiàn)不同組分分離的色譜分析技術(shù)。該技術(shù)具有實用、快速、靈敏、效率高等特點，在醫(yī)藥、環(huán)保、石化、生命科學(xué)、食品工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜儀在使用過程中常會出現(xiàn)一些影響分析結(jié)果的問題，包括鬼峰、保留時間漂移、峰前延、峰拖尾、峰變寬、負峰以及無色譜峰出現(xiàn)等，本文結(jié)合筆者多年HPLC操作經(jīng)驗，談?wù)勆鲜龈鞣N問題產(chǎn)生的原因及其相應(yīng)的解決方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜技術(shù);常見問題;解決方法

1 常見問題及解決方法

1.1 鬼峰

在液相色譜的洗脫過程中有時會出現(xiàn)實際測試樣品中不存在的色譜峰，此類色譜峰稱之為鬼峰。鬼峰時有時無，不具備規(guī)律性，但它們對目標(biāo)峰的準(zhǔn)確判斷產(chǎn)生極大干擾。一般來說，鬼峰產(chǎn)生的原因可能有3個，即樣品前處理不當(dāng)、流動相污染以及測試過程中的樣品殘留，分述如下。

1.1.1 樣品前處理不當(dāng)

樣品前處理不當(dāng)可能會產(chǎn)生鬼峰，一般源于兩個途徑：一是所用試劑被污染;二是測試容器不干凈。鑒別起來比較簡單：使用試劑稀釋樣品，如果待測樣品出峰明顯減小而鬼峰變化不大，則鬼峰源自試劑污染。如果潔凈容器后重新檢測鬼峰消失，則鬼峰源自容器的污染。

1.1.2 流動相污染

鬼峰的產(chǎn)生更多是由流動相污染所致，包括水相、有機相以及添加劑的污染。水相長時間放置或是多次使用沒有更換，易滋生細菌等微生物而污染，甚至?xí)芙饪諝庵袘腋〉念w粒和有機物，引入新的污染物。有機相和添加劑如果純度不夠含有雜質(zhì)，每次補充流動相時以直接補給的方式，沒有對貯液瓶進行清洗更換，富集的污染物就會進入到儀器流路中產(chǎn)生鬼峰。

1.1.3 測試樣品的殘留影響

測試樣品的殘留也會產(chǎn)生鬼峰。殘留物通常來源于三個方面：進樣口端污染、測試樣品濃度過載殘留以及色譜柱和儀器管路中污染物的富集。

在不改變測試條件情況下，如果鬼峰每次有規(guī)律地出現(xiàn)在色譜圖的相同位置，則污染很可能來自于自動進樣器端。這時可將自動進樣針和針座拆下，分別用甲醇、丙酮和環(huán)己烷進行超聲清洗。

1.2 保留時間漂移

保留時間是HPLC分析的重要依據(jù)。同一種物質(zhì)在相同色譜條件下，如果前后兩次的保留時間之差超過30s，就可認(rèn)為保留時間發(fā)生了漂移，此時就無法對該物質(zhì)進行準(zhǔn)確的定性定量分析。導(dǎo)致保留時間漂移的因素包括流動相混入空氣、系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定、色譜柱的性質(zhì)變化以及環(huán)境溫度不穩(wěn)定等。

1.2.1 流動相混入空氣

儀器流路中連續(xù)混入氣泡，樣品的保留時間會發(fā)生無規(guī)律的變化。混入氣泡的原因可能有2個，一是在線脫氣機脫氣不完全，流動相中仍存有大量的空氣。這種情況可預(yù)先將流動相進行超聲脫氣處理，然后再裝入儲液瓶中待用。二是由于水相和有機相的物理化學(xué)性質(zhì)存在差異，兩者在相互混合時，增加了空氣在兩種流動相中的溶解度。對于這種情況的等度洗脫實驗，可提前將流動相按所需比例配置好，然后超聲脫氣待用。

1.2.2 系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定

系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定直接影響了物質(zhì)的出峰時間。其中，樣品與流動相相容性差、流動相混合器故障、單向閥故障、泵密封墊損壞、儀器管路接口松動及損壞是造成系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定的常見因素。

在選擇待測組分的溶劑時首先要考慮流動相與樣品的相溶性，如沒有特殊原因，一般選擇流動相作為待測組分的溶劑，以降低由于待測樣品在流動相中溶解性差引入的空氣量。

液相色譜儀采用動態(tài)混合器和靜態(tài)混合器將不同通道出來的流動相混合均勻。一旦混合器發(fā)生故障，待測樣品的洗脫效果不一，系統(tǒng)就無法達到平衡，導(dǎo)致壓力不穩(wěn)基線不平。此時應(yīng)立即停止實驗，查明原因，確認(rèn)是否需要更換部件。

單向閥工作時液體呈單向流動，如果長時間使用緩沖鹽作為流動相，少量沒被洗脫的緩沖鹽結(jié)晶會阻塞單向閥的閥門，降低閥的流通性，導(dǎo)致流路流速改變，甚至還會發(fā)生單向閥漏液，進而造成系統(tǒng)壓力不穩(wěn)。遇到這種情況，處理辦法是取出入口和出口單向閥的閥芯，依次在水、甲醇中超聲清洗15min以上。如果單向閥的白色濾頭顏色加深變黑，就要直接更換。假如以上方法還不能解決問題，則要檢查密封墊圈或者單向閥有否磨損，一旦磨損要及時更換。

1.3 峰變寬

峰變寬會導(dǎo)致相近的兩個色譜峰相互重疊，僅以一個峰出現(xiàn)在譜圖中，不利于樣品的分離檢測。出現(xiàn)此類情況，可采取以下措施：（1）改變流速。適當(dāng)加大流速，可明顯改善由流速過低引起的峰變寬現(xiàn)象。（2）重新進樣。系統(tǒng)未達到平衡就開始做測試，峰形會發(fā)生無規(guī)則的變化，可待系統(tǒng)平衡穩(wěn)定后重新進樣。（3）更換柱子。移除色譜柱前端的保護柱，根據(jù)峰形變化來判斷是保護柱還是色譜柱受到污染。如峰形有明顯改善，則需更換保護柱的濾芯。反之，則需清洗或更換色譜柱。（4）調(diào)節(jié)流動相的比例或者重新選用合適的流動相。

1.4 負峰

負峰在液相色譜圖中出現(xiàn)十分頻繁，分為以下兩種情況：所有峰均為負峰和出現(xiàn)個別負峰。

當(dāng)色譜圖上所有的峰都為負峰時，十之八九是儀器的線路出了問題。這時應(yīng)檢查連接線路，看數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)信號的線是否接反，或記錄儀、檢測信號極性接反。

液相色譜圖中出現(xiàn)一個或多個負峰，原因可能有3個：（1）樣品中的溶劑與流動相不一致。如果溶劑的紫外吸收弱于流動相，就會減弱色譜圖中某一位移處的信號，溶劑峰呈負峰形式。解決方法是使用流動相作為樣品的溶劑。（2）樣品前處理中混入了其他雜質(zhì)。假如雜質(zhì)的紫外吸收弱于溶劑和流動相，當(dāng)一定濃度的該類物質(zhì)流出時，就可能出現(xiàn)負峰。但如果負峰不影響待測組分出峰，就不必對樣品作進一步純化處理。（3）流路中存在氣泡。當(dāng)流路中殘留的氣泡經(jīng)過流通池時，色譜圖上某一位移處的紫外吸收特別弱，就會出現(xiàn)負峰。碰到這種情況，只有將流路中的氣泡排盡才能消除負峰對測試的影響。

2 結(jié)語：

高效液相色譜儀是一種操作要求嚴(yán)、技術(shù)含量高、實踐領(lǐng)會強的大型精密分析儀器，我們只有加強日常維護，在使用中認(rèn)真應(yīng)對，及時發(fā)現(xiàn)異常，找出原因并予以解決，才能延長儀器的使用壽命，保證檢測的準(zhǔn)確性，讓儀器的功能和特點得到最大限度的發(fā)揮和利用。