鄭世茂 齊文武 陳曉云 白云昇 龐欣

摘?要：目的：探究模擬空間誘變處理后，生長速率提高的釀酒酵母細胞的誘變機制。方法：采用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術對模擬空間誘變處理前后的釀酒酵母進行定量蛋白質組學研究，探討對照組與誘變組在蛋白質組表達水平上的差異，以及受影響的生物功能。結果：共鑒定到764個差異蛋白，占檢測蛋白總數(shù)的15.54%。其中，上調(diào)差異表達蛋白378個、下調(diào)差異表達蛋白386個，主要涉及細胞核、線粒體、核糖體和質膜等重要細胞器和細胞結構。結論：提高重要代謝的效率、降低DNA修復功能與環(huán)境防御能力，可能是模擬空間誘變提高釀酒酵母細胞生長速率的重要機制之一。

關鍵詞：模擬空間誘變;釀酒酵母;蛋白質組學;iTRAQ

空間誘變育種是近年來興起的一種新型誘變技術?？臻g環(huán)境能夠影響微生物的生物學形態(tài)和表型，是微生物誘變育種的有效方法[1]，但現(xiàn)階段實施空間誘變?nèi)杂兄T多限制，此時模擬空間誘變就成為一個非常好的選擇。釀酒酵母是與人類關系最廣泛的一種酵母，傳統(tǒng)上它用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，是發(fā)酵中最常用的菌株。同位素標記相對與絕對定量（iTRAQ）技術是研究蛋白質組學的重要技術之一，該方法幾乎可以對任何蛋白樣品進行定量分析，具有可定量、高精度、高通量等特點，可在一次試驗中對8個樣品進行定量比較，已經(jīng)廣泛地應用于微生物、植物、動物、人體細胞定量蛋白質組學的研究[2-5]。但是，目前針對模擬空間誘變前后的酵母蛋白組學分析與研究國內(nèi)外鮮見報道。本試驗采用iTRAQ技術對模擬空間誘變后樣品與對照組樣品進行定量蛋白質組學研究，通過對鑒定到的蛋白質進行差異比對，進行GO功能注釋、KEGG Pathway代謝通路分析、KOG注釋與亞細胞定位預測，比較模擬空間誘變前后釀酒酵母在蛋白質組表達水平的差異，進而分析引起誘變后酵母生長速率提高的可能的機制。

1?材料與方法

1.1?材料

出發(fā)菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AS 2.430，誘變菌株為出發(fā)菌株在模擬空間誘變環(huán)境參數(shù)（包括但不限于真空、振動、加速度等）下篩選出的生長速率提高12.27%的菌株S.c_11。YPD液體培養(yǎng)基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%。

島津LC-20AB液相系統(tǒng)（分離柱為5 μm 4.6 mm×250 mm Gemini C18柱）;Thermo公司UltiMate 3 000 UHPLC、trap柱、自裝C18柱（75 μm內(nèi)徑，3 μm>粒徑，25 cm柱長）;質譜儀Q-Exactive HF X。SDSL3、含EDTA的蛋白酶抑制劑Cocktail、DTT、丙酮、碘乙酰胺溶液、Tissue lyser、考馬斯亮藍G-250、乙醇、乙酸、胰蛋白酶、iTRAQ Reagents -?8plex kits 異丙醇、TRAB溶液、流動相A（5%ACN，pH 9.8）、流動相B（95% ACN，pH 9.8）、流動相C（2% ACN，0.1%FA）、流動相D（98%ACN，0.1% FA）。

1.2?蛋白質提取

將酵母菌出發(fā)菌株和誘變菌株于斜面試管培養(yǎng)后分別接種于YPD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，各設置4個平行樣，在32 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)24 h得對照組與誘變組發(fā)酵液。將發(fā)酵液經(jīng)低溫離心后收集酵母細胞，用滅菌預冷的PBS洗滌3次，獲得8個菌體樣品。提取蛋白過程中如未特殊說明，試驗則在4 ℃下進行操作。稱取適量樣品，加500 μL含SDSL3的Cocktail，靜置反應 5 min，加入終濃度10 mmol/L DTT溶液;超聲、離心取上清液;加入5倍體積預冷丙酮，-20 ℃冰箱放置過夜，離心去上清液獲取沉淀;風干沉淀，加入適量的Cocktail溶解蛋白;離心后取上清液;加終濃度為10 mmol/L的DTT溶液，56 ℃中水浴1 h，保證充分反應;加入終濃度55 mmol/L的碘乙酰胺溶液，暗室放置45 min;加入5倍體積預冷丙酮，-20 ℃冰箱放置2 h，離心獲取沉淀;風干沉淀，加入適量的Cocktail溶解蛋白，離心后取蛋白質上清液[6]。

1.3?蛋白定量

采用Bradford定量方法定量[7]：在96孔酶標板A1～A10位置依次加入標準蛋白 （0.2 μg/μL BSA）0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μL，之后依次加入純水20、18、16、14、12、10、8、6、4、2 μL，之后各孔加入考馬斯亮藍G-250定量工作液180 μL。用酶標儀測量OD595，依據(jù)OD595與蛋白濃度制作線性標準曲線。稀釋待測蛋白質溶液若干倍，在20 μL蛋白溶液中加入180 μL定量工作液，讀取OD595。依據(jù)標準曲線以及樣品OD595計算樣品蛋白濃度。其中，對照組4個生物重復樣品為S.c_1、S.c_2、S.c_3、S.c_4，誘變組4個生物重復樣品為S.c_11_1、S.c_11_2、S.c_11_3、S.c_11_4。

1.4?蛋白酶解

8個樣品各取100 μg蛋白溶液;按蛋白∶酶=40∶1的比例加入胰蛋白酶2.5 μg，37 ℃酶解4 h;加酶循環(huán)1次，37 ℃繼續(xù)酶解8 h;肽段除鹽并真空抽干。

1.5?肽段標記

取出一定量iTRAQ標簽試劑并恢復至室溫，各管試劑加入50 μL異丙醇，渦旋振蕩混勻后低速離心;用0.5 mol/L TEAB溶解肽段樣品，并加入到對應iTRAQ標簽試劑中，不同樣品肽段選用不同的iTRAQ標簽，靜置2 h充分反應。

1.6?肽段分離

采用島津LC-20AB液相系統(tǒng)對樣品進行液相分離。用2 mL流動相A復溶抽干的肽段樣品并進樣，以1 mL/min的流速梯度洗脫：5%流動相B 10 min，20%流動相B 40 min，95%流動相B 1 min，流動相B持續(xù)3 min，5%流動相B平衡10 min。在214 nm波長下監(jiān)測洗脫峰并每分鐘收集1個組分，結合色譜洗脫峰圖合并樣品得到20個組分，然后冷凍抽干[8]。

1.7?納升高效液相分離

將抽干的肽段樣品用流動相C復溶，20 000 g離心10 min后，取上清進樣。通過HPLC進行分離。樣品首先進入trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C18柱串聯(lián)，以300 nL/min流速通過如下有效梯度進行分離：0～5 min，5% 流動相D;5～45 min，流動相D從5%升至25%;45～50 min，流動相D從25%升至35%;50～52 min，流動相D從35%升至80%;52～54 min，80%流動相D;54～60 min，5%流動相D。

1.8?質譜檢測

經(jīng)過HPLC分離的肽段離子化后進入到與之串聯(lián)質譜儀Q-Exactive HF X進行DDA（data-dependent acquisition）模式檢測。

1.9?蛋白質鑒定與定量分析

使用軟件Mascot 2.3.02進行蛋白鑒定，質譜數(shù)據(jù)與UniProt數(shù)據(jù)庫比對搜索得到最終的蛋白鑒定結果。篩選包含至少1個可信的特異性肽段的蛋白。采用IQuant軟件[9]以Mascot Percolator算法[10]進行iTRAQ數(shù)據(jù)定量。分別在譜圖/肽段水平與蛋白質水平上進行1% FDR的過濾（PSM-level FDR≤0.01），從而獲得顯著性鑒定的譜圖和肽段列表。利用肽段進行蛋白組裝，并產(chǎn)生一系列的蛋白組。

1.10?生物信息學分析

對差異表達蛋白進行GO、KEGG Pathway富集分析與KOG注釋，使用WoLF PSORT軟件[11]實現(xiàn)蛋白質的亞細胞定位預測。

2?結果與分析

2.1?蛋白質定量結果

對照組與誘變組經(jīng)Bradford定量法定量，結果見表1。

2.2?蛋白質鑒定結果

質譜數(shù)據(jù)經(jīng)Mascot 2.3.02利用UniProt數(shù)據(jù)庫比對鑒定樣本中的蛋白質。對照組4個生物重復樣品與誘變組4個生物重復樣品，共進行1次重復試驗。對有生物重復的比較而言，在生物重復配對情況下，最終差異蛋白需至少在1次配對重復中被定義為差異蛋白。此次試驗共鑒定到4 916個蛋白質，包含764個差異蛋白質，占檢測蛋白總數(shù)的15.54%。其中，上調(diào)蛋白數(shù)目378個、下調(diào)蛋白數(shù)目386個。鑒定到的所有蛋白的分子量分布情況見附圖，其中X軸為蛋白質分子量范圍（kDa），Y軸為相應蛋白比例。

2.3?生物信息學分析

2.3.1?差異蛋白基因本體論（GO）富集分析?GO富集分析給出了差異蛋白顯著富集的GO條目，對差異蛋白涉及的分子功能、細胞組分、生物過程進行分析。檢測到的764個差異蛋白，參與的分子功能有10個，其中主要功能有催化活性、結合、結構分子活性、轉運活性、分子功能調(diào)節(jié)等;參與構成的細胞組分有12個，主要有細胞、細胞組分、細胞器、細胞器組分、大分子復合物等;參與的生物過程有19個，主要有細胞過程、代謝過程、細胞成分組織或生物發(fā)生、生物調(diào)節(jié)、定位、應激反應、生物過程調(diào)控等（表2、表3）。

2.3.2?差異蛋白KEGG Pathway富集分析?KEGG數(shù)據(jù)庫中主要的數(shù)據(jù)庫有4個，分別為Pathway、Genes、Ligand、Brite[12]，其中KEGG Pathway以圖形代替文字直觀地描述各種代謝途徑以及各途徑之間的關系。經(jīng)KEGG Pathway分析，本次試驗有658個差異蛋白參與了111條生物信號通路（表4）。

2.3.3?差異蛋白KOG注釋分析?KOGs數(shù)據(jù)庫是一種常用的蛋白功能注釋數(shù)據(jù)庫，每個KOG條目都包含一系列直系同源蛋白或旁系同源蛋白。此次KOG注釋分析將所有鑒定到的差異蛋白BLAST比對KOG數(shù)據(jù)庫，得到相應的KOG注釋結果。750個顯著差異蛋白參與了能量產(chǎn)生與轉化，氨基酸轉運和代謝，糖類運輸和代謝，脂質轉運和代謝，核苷酸轉運與代謝，DNA的復制、重組和修復、轉錄、翻譯，RNA加工和修飾，輔酶運輸與代謝，無機離子的運輸與代謝，次級代謝產(chǎn)物的生物合成、運輸和分解代謝，信號轉導等重要生物反應過程（表5）。

2.3.4?差異表達蛋白亞細胞定位預測?蛋白質合成后，經(jīng)信號引導轉運被分泌到細胞外部、細胞質基質或者進入特定的細胞器中，翻譯后的蛋白只有到達正確的部位才能發(fā)揮其功能，參與細胞的各種生命活動。因此，進行蛋白質的亞細胞定位是對差異蛋白功能注釋的重要部分。本次試驗采用WoLF PSORT軟件實現(xiàn)蛋白質的亞細胞定位預測。764個差異蛋白被預測出現(xiàn)在12個亞細胞結構中，其中最主要的結構有細胞核（34.82%）、細胞液（27.23%）、線粒體（18.98%）、細胞外（5.37%）、質膜（4.58%）等。

3?結論

經(jīng)過模擬空間誘變，釀酒酵母的差異表達蛋白主要分布在細胞核、線粒體、核糖體和質膜等主要細胞結構中，涉及氨基酸、蛋白質、糖類、脂類、核苷酸、核酸等重要代謝過程;通過提高DNA復制，mRNA轉錄，蛋白質翻譯、加工、轉運，信號轉導，細胞骨架結構維持等代謝過程效率。Rad50是一種參與DNA雙鏈斷裂修復的蛋白質，對于DNA雙鏈斷裂修復非常重要。Rad50蛋白在模擬空間誘變后的菌種中含量提升，這可能是釀酒酵母經(jīng)模擬空間環(huán)境篩選出的優(yōu)勢菌株，但是在正常生產(chǎn)條件下并無輻射等誘變因素使得DNA雙鏈斷裂，因此，Rad50蛋白含量的增加對正常生產(chǎn)條件下的釀酒酵母菌株影響并無積極影響[13]。蛋白HSM3與DNA裂解酶APN1分別在DNA錯配修復與切除修復中起重要作用，這兩種蛋白的下調(diào)可能會引起突變率的提高，但同時減少了DNA修復時間，使得DNA復制速率有所提高[14]。海藻糖作為酵母重要的抗逆因子具有重要的抗逆作用，生物合成海藻糖的關鍵酶是海藻糖-6-磷酸合成酶TPS1[15]。誘變后酵母細胞TPS1下調(diào)，其抗逆能力也隨之下降。由此可見，細胞是通過降低其對DNA復制后的修復能力與環(huán)境防御能力來提高生長速率的。但是誘變后的釀酒酵母有關DNA修復和環(huán)境防御部分的相關蛋白含量下調(diào)，這一變化對其突變與生長的意義及所帶來的影響還需要進一步研究。

4?討論

從20世紀60年代開始，國內(nèi)外研究人員就利用返回式衛(wèi)星或飛船搭載微生物菌種，獲得了多種地面難于得到的優(yōu)良菌株[16]。實驗室近些年通過模擬空間誘變獲得了一些生長速率加快的菌株，但均停留在現(xiàn)象研究上，深入的機理研究十分匱乏。本研究檢測到的764個差異表達蛋白，涉及的多為較重要細胞結構物質、能量代謝與信號過程。上調(diào)蛋白涉及細胞核中染色質、核仁核孔復合體等重要成分，還有細胞質與細胞核中核糖體的大亞基與小亞基成分、內(nèi)質網(wǎng)膜重要成分、高爾基體膜組成成分、細胞骨架成分、細胞質膜等，這些蛋白的上調(diào)為釀酒酵母的快速生長提供了物質基礎。上調(diào)蛋白還涉及線粒體中線粒體雙層膜結構、膜間空間、呼吸鏈中電子傳遞的酶復合物、V-型與F-型質子泵等重要成分，這些蛋白上調(diào)為釀酒酵母的快速生長提供了能量基礎。上調(diào)蛋白中涉及的重要生物過程包括糖類代謝過程、氨基酸合成過程、核苷酸代謝過程、脂類的合成與轉運、輔助因子與中間產(chǎn)物生物合成、產(chǎn)能代謝過程;蛋白質轉錄、翻譯、折疊、轉運的正調(diào)節(jié)，其中包括組蛋白乙酰化與H2B泛素化的正調(diào)控相關蛋白，組蛋白乙?；琀2A、H2B、H3、H4的10個以上的賴氨酸修飾位點[17]，組蛋白H2B泛素化是RNA聚合酶轉錄Ⅱ所必需的[18];DNA復制，RNA加工處理，細胞骨架形成與維持，信號轉導途徑過程;cAMP合成過程，Ras蛋白信號轉導、G蛋白偶聯(lián)的信號傳導途徑。

下調(diào)蛋白包括轉錄負調(diào)控蛋白、染色質沉默過程相關蛋白;DNA修復蛋白，含切除修復與錯配修復等相關蛋白，如蛋白HSM3與DNA裂解酶APN1，DNA修復相關蛋白減少，這可能是誘變后酵母DNA復制過程中以犧牲復制準確率為代價來快速復制DNA的機制;細胞骨架的解聚過程相關蛋白，有助于維持細胞骨架結構、細胞形態(tài)以及保證各種細胞器與生物大分子分布正常;環(huán)境防御相關蛋白如TPS1。這些蛋白涉及的生物過程與細胞的生存有關，但是并非細胞所必需，這可能是釀酒酵母細胞為應對模擬空間誘變這一逆境而啟動的生物效應。

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