李曉青，張 雷，趙雅欣，孫 睿，雷 雨*

(1.廣東潤良藥業(yè)有限公司，廣東 珠海 519000；2.北京市密云區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)，北京 101500；3.北京聯(lián)合大學(xué) 應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100083)

咽炎在中醫(yī)說法中為“喉痹”、“慢火喉痹”等，是耳鼻喉科常見病之一[1]。慢性咽炎因諸多因素導(dǎo)致，大多為臟腑虛損、咽喉失養(yǎng)、痰凝血瘀，結(jié)聚咽喉[2]。近年來，隨著空氣質(zhì)量的持續(xù)惡化和人們生活習(xí)慣的改變，咽喉極易受到影響而引起一系列問題，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。開發(fā)安全有效的清咽功能保健食品迫在眉睫。中醫(yī)藥主張未病先治的理論符合現(xiàn)代人保健養(yǎng)生的需要。某清咽產(chǎn)品將藤茶及牛蒡子進(jìn)行配伍，其中藤茶(Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang)又名顯齒蛇葡萄葉，性味苦、微澀、涼，常用于清熱利濕，平肝降壓，活血通絡(luò)。牛蒡子(Fructusarctii)性味辛、苦、寒，歸胃經(jīng)，對(duì)于治療咳嗽痰多，咽喉腫痛，痄腮丹毒，癰腫瘡毒有顯著效果。咽炎患者血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白水平(CRP)明顯高于正常情況，且三者水平均與疾病嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)，均可作為咽喉癥狀早期預(yù)測(cè)的參考性指標(biāo)[3-4]。為進(jìn)一步開發(fā)以該配伍為主要原料的清咽功能保健食品，設(shè)計(jì)此試驗(yàn)探究其對(duì)致炎鼠消炎程度的影響，并結(jié)合ELISA技術(shù)探究該配伍對(duì)棉球致炎大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量(185±15)g，10周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008)；SPF級(jí)BALB/c雌雄性小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，6周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測(cè)中心SPF級(jí)動(dòng)物室(許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0038)。維持飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008)生產(chǎn)。分籠飼養(yǎng)，控制室溫(25±2)℃，自由攝食、飲水。各劑量組均給予維持飼料。

1.2 試驗(yàn)藥物藤茶(批號(hào)：20180620，購自貴州江口梵凈山云峰野生植物開發(fā)有限公司)；牛蒡子(批號(hào)：171101，購自安國市深豪藥業(yè)有限公司)；藤茶牛蒡子濃縮液：取混合樣品105.0 g(藤茶63.0 g，牛蒡子42.0 g)，常壓、溫度80℃，加1 050 mL無菌水浸泡30 min，提取2次，將提取液合并濃縮至70 mL，以下簡稱“受試物”。

1.3 主要試劑與儀器乙醚(批號(hào)：20180119，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；碘伏(批號(hào)：15111，山東利爾康牌醫(yī)療科技股份有限公司)；致炎劑1%葡聚糖4萬(批號(hào)：17027002，北京拜耳迪生物技術(shù)有限公司)；二甲苯(批號(hào)：20190118，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；大鼠TNF-α 酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(批號(hào)：202009，賽默飛世爾科技公司)；大鼠IL-6 ELISA試劑盒(批號(hào)：202009，賽默飛世爾科技公司)；大鼠CRP ELISA試劑盒(批號(hào)：202009，賽默飛世爾科技公司)；BS223S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；T1000電子天平(常熟衡器工業(yè)公司)；XR-YLS-25A電動(dòng)耳腫打孔器(上海欣軟信息科技有限公司)；足趾容積測(cè)量儀(成都泰盟軟件有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；微量加樣器(哈美頓實(shí)驗(yàn)器材有限公司)。

1.4 試驗(yàn)分組與處理將96只SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)平均分成4組，以生藥計(jì)分別設(shè)定空白對(duì)照組、受試物低劑量組(0.38 g/kg)、受試物中劑量組(0.75 g/kg)、受試物高劑量組(2.25 g/kg)，用于棉球植入試驗(yàn)及足趾腫脹試驗(yàn)。將60只SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠隨機(jī)平均分成4組，分別設(shè)定空白對(duì)照組、受試物低劑量組(0.75 g/kg)、受試物中劑量組(1.50 g/kg)、受試物高劑量組(4.50 g/kg)，用于小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1大鼠棉球植入肉芽腫凈質(zhì)量的測(cè)定 經(jīng)口給予大鼠受試物36 d，試驗(yàn)結(jié)束前8 d，用脫毛器脫去大鼠兩側(cè)腹股溝處的毛，乙醚麻醉大鼠，碘伏消毒，在無菌條件下切開大鼠兩側(cè)腹股溝皮膚，植入經(jīng)高壓滅菌并烘干、稱質(zhì)量的棉球，縫合切口，繼續(xù)給予受試物。試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，給受試物1 h后，斷頸處死大鼠，在原縫合處剪開皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，置于已稱質(zhì)量潔凈平皿中，恒溫干燥箱60℃開蓋干燥1 h后稱質(zhì)量，計(jì)算肉芽腫凈質(zhì)量。

1.5.2大鼠足趾腫脹率的測(cè)定 經(jīng)口給予大鼠受試物36 d，試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天給1次受試樣品，1 h后，用足趾容積測(cè)量儀測(cè)量各組大鼠右后足趾的容積，作為0 h足趾容積。然后在大鼠右后足趾皮下注入等量1%葡聚糖4萬，分別于1，2，4，6 h測(cè)量大鼠足趾的容積，同一部位測(cè)量3次，取平均值。以不同時(shí)間所測(cè)足趾容積與致炎劑作用前的足趾容積之差為腫脹值，計(jì)算各個(gè)時(shí)間段的足趾腫脹率。

1.5.3小鼠耳廓腫脹率的測(cè)定 經(jīng)口給予小鼠受試物36 d，試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，汲取二甲苯20 μL，滴加在小鼠右耳外側(cè)面耳廓的中央，讓其自由擴(kuò)散，30 min 后，將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用9 mm直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱質(zhì)量，以兩耳質(zhì)量之差為耳廓腫脹值，計(jì)算耳廓腫脹率。

1.5.4大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP的測(cè)定 斷頸處死末次給藥棉球植入大鼠前，自大鼠眼底靜脈叢取血，分離血清，低溫冰箱冷凍保存。冷凍血清室溫下融化，測(cè)定方法參照賽默飛世爾科技公司相應(yīng)ELISA試劑盒操作說明。

1.6 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)小鼠20只，雌雄各半，試驗(yàn)前禁食4 h，自由飲水。試驗(yàn)期間，動(dòng)物自由攝食和飲水，末次灌胃后繼續(xù)禁食2 h。小鼠灌胃受試物1次，灌胃劑量為30 g/kg (以生藥計(jì))。連續(xù)觀察14 d，觀察并記錄動(dòng)物的一般狀態(tài)、體質(zhì)量變化、中毒體征以及死亡情況等。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)受試動(dòng)物一般狀態(tài)和體質(zhì)量的影響受試動(dòng)物精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、攝食攝水等均未見明顯異常。給予受試物前后，大、小鼠的體質(zhì)量在各劑量組與空白對(duì)照組間比較差異均無顯著性。

2.2 受試物對(duì)大鼠棉球植入肉芽腫凈量的影響由表1可見，經(jīng)口給予大鼠受試物36 d后，與空白對(duì)照組比較，中劑量組和高劑量組大鼠肉芽腫凈量降低，其中中劑量組具有顯著性差異(P<0.05)，高劑量組具有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 大鼠棉球植入試驗(yàn)肉芽腫凈量

2.3 受試物對(duì)棉球植入大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP含量的影響經(jīng)口給予大鼠不同劑量受試物36 d后，與空白對(duì)照組比較，中、高劑量組TNF-α含量明顯降低，高劑量組的IL-6含量降低，有極顯著性差異(P<0.01)。與空白對(duì)照組比較，各劑量組血清CRP含量均顯著性降低，且有極顯著性差異(P<0.01)，大鼠的CRP水平受樣品的影響呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。

表2 大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP含量水平 ng/L

2.4 受試物對(duì)大鼠足趾腫脹率的影響由表3及圖1可見，經(jīng)口給予大鼠受試物36 d后，與空白對(duì)照組比較，各劑量組大鼠注射致炎劑后不同檢測(cè)時(shí)間均可見足趾容積降低，且各劑量組部分時(shí)間差異具有顯著性。其中高劑量組注射致炎劑1%葡聚糖4萬后4 h內(nèi)足趾腫脹率顯著降低，有極顯著性差異(P<0.01)。低、中劑量組注射致炎劑1%葡聚糖4萬后2 h內(nèi)大鼠足趾腫脹率具有顯著性差異(P<0.05)。各劑量受試組均能降低注射致炎劑1%葡聚糖4萬導(dǎo)致的足趾腫脹率，注射后6 h達(dá)到與空白大鼠足趾腫脹率一致。

表3 注射致炎劑1%葡聚糖4萬后1～6 h大鼠足趾腫脹率

2.5 受試物對(duì)小鼠耳廓腫脹率的影響由表4及圖2可見，經(jīng)口給予小鼠受試物36 d后，各劑量組小鼠耳廓腫脹率與空白對(duì)照組比較均有降低，且差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)。

2.6 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)在觀察期14 d內(nèi)，動(dòng)物狀態(tài)正常，無中毒體征和死亡等異常情況，15 d小鼠大體解剖檢查，主要臟器未見明顯異常。所有小鼠經(jīng)口急性耐受劑量均大于30 g/kg，按急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]評(píng)價(jià)，該受試樣品屬實(shí)際無毒。

圖1 注射致炎劑1%葡聚糖4萬后1～6 h大鼠足趾腫脹率

表4 小鼠耳腫脹試驗(yàn)耳廓腫脹率

圖2 小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)耳廓腫脹率

3 討論

咽炎屬于中醫(yī)學(xué)“喉痹”范疇，最早見于《皇帝內(nèi)經(jīng)》，其中《素問·陰陽別論》“一陰一陽結(jié)，謂之喉痹”，以“虛火喉痹”居多[5-6]。隨著城市的快速發(fā)展，大中型城市的空氣污染問題日益嚴(yán)重，霧霾等極端天氣首當(dāng)攻擊人體的呼吸系統(tǒng)。本試驗(yàn)研究藤茶及牛蒡子配伍對(duì)動(dòng)物清咽功能的影響，其主要成分藤茶分布較廣，適應(yīng)性強(qiáng)，資源豐富，主要產(chǎn)自我國湖北、湖南、貴州、福建、江西等山區(qū)[7-8]。它具有較強(qiáng)的抗氧化作用，有清熱解毒、利咽護(hù)嗓、保肝護(hù)肝、降血脂、降血糖、抗菌消炎、解酒毒、活血化瘀、抗病毒、抗腫瘤，以及免疫增強(qiáng)等功效[9]。牛蒡子中主要含有牛蒡子苷、牛蒡子苷元、羅漢松脂素、牛蒡酚A～H等木脂素類成分和揮發(fā)油及油脂類成分[10]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，牛蒡子具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎、抗病毒、抗菌等作用[11]。牛蒡子為清咽保健食品常用中藥，筆者運(yùn)用中醫(yī)藥配伍理論，結(jié)合對(duì)藤茶和牛蒡子清咽作用機(jī)制的報(bào)道進(jìn)行分析，藤茶與牛蒡子配伍應(yīng)用能夠緩解咽部不適。

本研究中，經(jīng)口給予大鼠本藤茶牛蒡子配伍樣品36 d后，高劑量組大鼠肉芽腫凈重及其血清中TNF-α、IL-6、CRP水平，以及1～4 h足趾腫脹率顯著低于空白對(duì)照組。高劑量組小鼠耳腫脹率均顯著低于空白對(duì)照組。該樣品對(duì)大、小鼠體質(zhì)量增長均無不良影響，小鼠經(jīng)口急性耐受劑量均大于30 g/kg,該受試品屬于實(shí)際無毒。

綜上試驗(yàn)結(jié)果表明，該藤茶及牛蒡子配伍樣品在動(dòng)物致炎模型中發(fā)揮了消炎作用，能有效降低致炎大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP水平，共同協(xié)同達(dá)到清咽的目的，各組動(dòng)物臟器均未見明顯病變，可為臨床兩者配伍治療咽喉癥狀提供試驗(yàn)依據(jù)。