劉佳斌，張 楊，王茗悅，黃劍眉，靖傳旭，宋小凱，徐立新，嚴(yán)若峰，李祥瑞

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

雞球蟲病(coccidiosis)是一種全球范圍內(nèi)流行的，寄生于雞的腸道引起的重要寄生性原蟲病，并且不同的艾美耳球蟲表現(xiàn)出高度的位點特異性[1-2]，其對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示雞球蟲病發(fā)病率高達(dá)50%～70%，死亡率可以達(dá)到20%～30%，急性病例中死亡率甚至高達(dá)80% 以上[4]。雞球蟲病每年在世界范圍內(nèi)對家禽養(yǎng)殖業(yè)所造成的經(jīng)濟(jì)損失約30億美元[5-6]，繼而引起全球性獸醫(yī)衛(wèi)生問題。目前世界上得到普遍公認(rèn)的雞球蟲種有7個，其中巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)、堆形艾美耳球蟲(E.acervulina)、柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、毒害艾美耳球蟲(E.nectrix)在世界范圍內(nèi)危害最為嚴(yán)重[4]。

雞的艾美耳球蟲具有嚴(yán)格宿主特異性，不同種的雞艾美耳球蟲對寄生部位也存在有特異性，如柔嫩艾美耳球蟲只專性寄生于雞的盲腸，而巨型艾美耳球蟲只專一寄生于雞的小腸中段，入侵并在腸上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)育。迄今為止已有大量的研究顯示微線蛋白(microneme,MIC)與雞艾美耳球蟲入侵宿主靶細(xì)胞的能力息息相關(guān)[7-11]。雞艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞時，最關(guān)鍵的就是特異性受體在恰當(dāng)?shù)臅r機(jī)與蟲體入侵相關(guān)細(xì)胞器(如微線體和棒狀體)常規(guī)分泌釋出的入侵相關(guān)蛋白的結(jié)合與脫離。鑒于微線蛋白在雞球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞過程中的重要性，及本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，巨型艾美耳球蟲的微線蛋白3(EmMIC3)能夠特異性結(jié)合小腸中段上皮細(xì)胞，且該蛋白對巨型艾美耳球蟲的入侵具有較好的免疫保護(hù)力，同時針對EmMIC3的5個微線蛋白黏附重復(fù)結(jié)構(gòu)域(microneme adhesive regions,MARR)的研究中發(fā)現(xiàn)，EmMAR2與雞小腸中段的結(jié)合能力最強，而EmMAR5與小腸中段的結(jié)合能力較弱。因此，本研究針對巨型艾美耳球蟲侵入過程中的關(guān)鍵蛋白EmMIC3，及其結(jié)構(gòu)域蛋白，開展動物免疫保護(hù)試驗，對比EmMIC3蛋白和結(jié)構(gòu)域蛋白的免疫保護(hù)效果，進(jìn)一步為研制雞球蟲亞單位疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與蟲株1日齡海蘭白蛋雞購自江蘇省海安市某雞場；新西蘭白兔購自江蘇省南京市某養(yǎng)殖場。本項研究中所有試驗方案符合南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理、福利等相關(guān)條例規(guī)定，符合江蘇省科技廳動物福利保護(hù)條例，許可證編號：SCXK(蘇)2014-0004。

巨型艾美耳球蟲江蘇分離株(JS strain)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲病實驗室分離、純化并保存于重鉻酸鉀(2.5%)溶液中，放置于4℃，每3個月復(fù)蘇1次，確保卵囊的活性。

1.2 主要試劑弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氨芐抗生素為南京生興公司產(chǎn)品；脫脂奶粉購自DSBIO公司；IPTG購自上海生工生物公司；山羊抗兔IgG(Y)抗體購自BioWorld公司；TMB購自Sigma公司；6×Protein Loading 購自Thermo scientific 公司；His標(biāo)簽蛋白純化鎳柱(HisTrapTMFF crude)為GE Healthcare公司產(chǎn)品。

1.3 EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將含有pET-32a-EmMIC3、pET-32a-EmMAR2、pET-32a-EmMAR5質(zhì)粒的菌液和pET-32a菌液(實驗室張楊博士提供)按1∶100的比例分別接種至含終質(zhì)量濃度為50 mg/L的氨芐青霉素的1 L培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期(D600≈0.6)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集菌體沉淀，用pH7.4 的PBS洗滌菌體3次，棄上清，用binding buffer 重懸沉淀，-20℃ 反復(fù)凍融3次，超聲破碎，7 500 r/min，離心15 min;上清轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管，上清用上清binding buffer重懸、沉淀用包涵體binding buffer重懸，4℃溶解過夜。分別取上清和包涵體，加入5×Protein loading buffer，沸水作用5～8 min，進(jìn)行SDS-PAGE。檢測上清和包涵體的表達(dá)情況，以確定蛋白的表達(dá)部位。

包涵體binding buffer溶解的蛋白沉淀于4℃7 500 r/min 離心15 min，收集上清，經(jīng)0.22 μm濾器過濾雜質(zhì)后進(jìn)行蛋白純化(若蛋白在上清，則直接用0.22 μm濾器過濾)。采用His標(biāo)簽蛋白純化柱(His-Trap FF)純化重組蛋白。

1.4 EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5重組蛋白多克隆抗體制備將純化后的pET-32a標(biāo)簽蛋白、pET-32a-EmMIC3、pET-32a-EmMAR2、pET-32a-EmMAR5重組蛋白(500 μg/只)分別免疫6周齡雄性健康新西蘭白兔制備抗血清，每種蛋白免疫2只新西蘭白兔。初次免疫時，加入等量的弗氏完全佐劑，在乳化儀中乳化10～15 min，采用背部多點注射法皮下注射。間隔2周后，加入等量的弗氏不完全佐劑混勻后充分乳化，加強免疫。每周免疫1次，5次免疫后采用心臟采血法收集血液，分離血清，獲得多克隆抗體。

1.5 多克隆抗體效價檢測用3種重組蛋白溶于0.05 mol/L碳酸鹽溶液(pH9.6)，調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)量濃度為50 mg/L。在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μL含50 mg/L重組蛋白的碳酸鹽包被液，放置4℃過夜；棄去包被液，用PBST洗3次，每次5 min；每孔加入200 μL含5%脫脂奶粉的PBST，37℃孵育封閉1 h；棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每次5 min；每孔加入100 μL，1∶50稀釋過的待測血清樣品，37℃孵育2 h；棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5 min；每孔添加100 μL封閉液稀釋過(1∶10 000)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)1 h(37℃)；棄去液體，用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔添加100 μL TMB，室溫避光5 min；每孔添加100 μL 2 mol/L 的H2SO4，終止反應(yīng)，放入酶標(biāo)儀中，測D450值。

1.6 巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊收集取2周齡海蘭白雞20只，每只雞經(jīng)口灌服2×104個孢子化卵囊，收集感染后5～8 d的糞便，采用飽和鹽水漂浮法從糞便中收集卵囊，存于2.5%重鉻酸鉀中并在28℃恒溫培養(yǎng)箱中孢子化，待孢子化率達(dá)到90%時，收集卵囊。

1.7 分組與免疫重組蛋白免疫：將體質(zhì)量差異不顯著，健康狀況良好的14日齡雛雞隨機(jī)分為6組，每組20只。其中3組分別用原核表達(dá)蛋白EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5免疫雛雞，并且設(shè)置pET32a載體蛋白、感染非免疫和非感染非免疫3個對照組。14日齡時進(jìn)行第1次免疫，腿部肌肉注射，1 200 μL/羽。21日齡時進(jìn)行第2次免疫，200 μL/羽，28日齡時進(jìn)行攻蟲，經(jīng)口感染1.0×105個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊，7 d后剖殺。

重組蛋白抗血清免疫：將體質(zhì)量差異不顯著，健康狀況良好的28日齡雛雞攻蟲，經(jīng)口感染1.0×105個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊，并隨機(jī)分為6組，每組20只。連續(xù)7 d進(jìn)行翅靜脈注射，每羽注射0.5 mL效價為212抗重組蛋白多抗血清，并且設(shè)置抗pET-32a標(biāo)簽蛋白多抗組、感染非免疫和非感染非免疫組，7 d 后剖殺。

1.8 免疫保護(hù)效果觀察巨型艾美耳球蟲致病性的程度與雞感染球蟲卵囊數(shù)和其他的指標(biāo)相關(guān)，通過觀察增體質(zhì)量效果、統(tǒng)計克腸內(nèi)容物卵囊數(shù)、卵囊減少率、肉眼腸道病變記分等指標(biāo)結(jié)合抗球蟲指數(shù)等，對此次動物試驗的免疫效果進(jìn)行全面的評價。

1.8.1增體質(zhì)量效果 每個試驗組逐只測體質(zhì)量、攻蟲時體質(zhì)量(m1)和剖殺時體質(zhì)量(m2)并記錄數(shù)據(jù)，計算平均增體質(zhì)量(W1)、增體質(zhì)量率和相對增體質(zhì)量率。參照索勛等[13]的計算方法進(jìn)行。

1.8.2克腸內(nèi)容物卵囊數(shù)(oocysts per gram feces，OPG) 使用麥克馬斯特法(McMaster’s method)計算每克腸道內(nèi)容物的卵囊數(shù)。

1.8.3卵囊減少率 參照索勛等[13]的方法計算卵囊的減少率。

1.8.4肉眼腸道病變記分 因為組織損傷產(chǎn)生于球蟲生活史的末期，致病性的跡象是短暫的出現(xiàn)，所以選擇在感染后6～7 d進(jìn)行觀察。巨型艾美耳球蟲病變位置為小腸中段。肉眼病變計分方法參照索勛等[13]。

1.8.5抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI) ACI是將存活率、增體質(zhì)量變化效果、腸道病變分值和卵囊數(shù)量等多項參數(shù)綜合進(jìn)行分析和評定，是判定球蟲耐藥性、藥物抗球蟲效力或球蟲疫苗免疫效果等的指標(biāo)。但是不同的研究者在不同的試驗研究中所采用的參數(shù)不同，本試驗所采用參數(shù)和判定公式如下：

ACI=(存活率+相對增體質(zhì)量率)-(病變值+卵囊值)。ACI ≥ 180，則保護(hù)效果明顯；160 ≤ ACI ≤ 179，則保護(hù)效果一般；ACI ≤ 160，則無保護(hù)效果。

1.8.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 使用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析，組間差異顯著性分析使用單因素鄧肯多重范圍檢驗的方差分析(ANOVA)。P>0.05為差異不顯著；P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異特別顯著；P<0.001為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化構(gòu)建成功的原核重組質(zhì)粒pET-32a-EmMIC3、pET-32a-EmMAR2、pET-32a-EmMAR5轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌，用誘導(dǎo)劑IPTG小量表達(dá)，以pET-32a為空載體對照，探索表達(dá)條件。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果如圖1。

A.SDS-PAGE分析pET-32a(+)-EmMIC3的時相表達(dá)；B.SDS-PAGE分析pET-32a(+)-EmMAR2的時相表達(dá);C.SDS-PAGE分析pET-32a(+)-EmMAR5的時相表達(dá)。M.蛋白Marker;1.pET-32a(+)在誘導(dǎo)表達(dá)0 h后的BL21裂解物;2.pET-32a(+)在誘導(dǎo)表達(dá)5 h 后的BL21裂解物;3～8.pET-32a(+)-EmMIC3(A)、EmMAR2(B)、EmMAR5(C)在誘導(dǎo)表達(dá)0～5 h后的BL21裂解1 EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

純化結(jié)果如圖2，在91，28，26 kDa附近出現(xiàn)單一條帶，純化效果良好。

A.純化后的EmMIC3重組蛋白；B.純化后的EmMAR2重組蛋白；C.純化后的EmMAR5重組蛋白；M.蛋白Marker

2.2 EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5重組蛋白兔抗血清效價檢測第5次免疫后間接ELISA法檢測兔血清中pET-32a-EmMIC3、pET-32a-EmMAR2、pET-32a-EmMAR5蛋白的效價分別為220，220，216。

2.3 重組蛋白EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5抗巨型艾美耳球蟲免疫保護(hù)效果

2.3.1增體質(zhì)量變化 平均增體質(zhì)量(表1)表示攻蟲前后每組雞的體質(zhì)量變化，用來評估重組蛋白對雞增體質(zhì)量的影響，感染非免疫與非感染組相比差異顯著，說明每組實驗動物成功感染巨型艾美耳球蟲。pET-32a標(biāo)簽蛋白組與感染非免疫組比較差異不顯著，說明其對感染球蟲雞的體質(zhì)量無顯著影響。每個試驗組雞的體質(zhì)量與感染非免疫組比較差異顯著，說明3種重組蛋白對感染雞巨型艾美耳球蟲具有保護(hù)效果。

2.3.2克腸內(nèi)容物卵囊數(shù)(OPG) 攻蟲后7 d取腸內(nèi)容物進(jìn)行卵囊計數(shù)(表1)，經(jīng)過分析比較發(fā)現(xiàn)pET-32a標(biāo)簽蛋白組與感染非免疫組比較卵囊差異不顯著，說明pET-32a標(biāo)簽蛋白沒有抗球蟲作用。每個試驗組雞的卵囊數(shù)與感染非免疫組比較顯著減少，說明重組蛋白免疫均能夠減少感染雞卵囊排出量。

2.3.3腸病變計分 腸道病變記分(表1)表示的是腸道受損傷程度。攻蟲后7 d觀察腸道病變，pET-32a標(biāo)簽蛋白組與感染非免疫組比較差異不顯著，說明pET-32a標(biāo)簽蛋白沒有抗球蟲作用。每個試驗組雞的病變記分與感染非免疫組比較差異顯著，說明重組蛋白對雞具有抗球蟲保護(hù)效果。

2.3.4ACI檢測 ACI是將存活率、增體質(zhì)量情況、病變記分值及卵囊值多項參數(shù)進(jìn)行綜合分析。從表1可以看出pET-32a標(biāo)簽蛋白組與感染非免疫組比較ACI差異不顯著,說明pET-32a標(biāo)簽蛋白沒有抗球蟲作用。其中試驗組EmMIC3、EmMAR2組ACI都在160以上，說明其對雞具有抗球蟲保護(hù)效果。EmMAR5組的ACI在160以下，說明其對雞不具有抗球蟲保護(hù)效果。

表1 免疫雞于巨型艾美耳球蟲攻蟲后的抗球蟲保護(hù)效果

2.3.5雞血清中抗重組蛋白特異性抗體水平 血清樣品于雛雞2次免疫后7 d采集，使用ELISA方法檢測血清中EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5特異性IgG濃度，試驗結(jié)果如圖3所示。重組蛋白EmMIC3免疫組血清特異性抗體水平在2次免疫后7 d均顯著高于各對照組(P<0.05)。試驗證實EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫。

圖3 雞血清中EmMIC3 EmMAR2 EmMAR5特異性IgG水平

2.4 重組蛋白EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5抗血清免疫保護(hù)效果

2.4.1增體質(zhì)量變化 感染非免疫與非感染組相比差異顯著(表2)，說明每組實驗動物成功感染巨型艾美耳球蟲。pET-32a標(biāo)簽蛋白血清組與感染非免疫組比較差異不顯著，說明其對感染球蟲雞的體質(zhì)量無顯著影響。每個試驗組雞的體質(zhì)量與感染非免疫組比較差異顯著，說明3種抗重組蛋白血清對感染雞巨型艾美耳球蟲具有保護(hù)效果。

2.4.2克腸內(nèi)容物卵囊數(shù)(OPG) 經(jīng)過分析比較發(fā)現(xiàn)抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清組與感染非免疫組比較卵囊差異不顯著(表2)，說明抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清沒有抗球蟲作用。每個試驗組雞的卵囊數(shù)與感染非免疫組比較顯著減少，說明抗重組蛋白血清免疫均能夠減少感染雞卵囊排出量。

2.4.3腸病變計分 攻蟲后7 d觀察腸道病變，抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清組與感染非免疫組比較差異不顯著(表2)，說明抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清沒有抗球蟲作用。每個試驗組雞的病變記分與感染非免疫組比較差異顯著，說明抗重組蛋白血清對雞具有抗球蟲保護(hù)效果。

2.4.4ACI檢測 從表2可以看出抗pET-32a標(biāo)簽蛋白血清組與感染非免疫組比較ACI差異不顯著,說明pET-32a標(biāo)簽蛋白沒有抗球蟲作用。其中試驗組抗重組蛋白EmMIC3、EmMAR2血清組的ACI都在160以上，說明其對雞具有抗球蟲保護(hù)效果?？怪亟M蛋白EmMAR5血清組的ACI在160以下，說明其對雞不具有抗球蟲保護(hù)效果。

表2 重組蛋白EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5抗血清免疫保護(hù)性效果

3 討論

雞球蟲病危害甚廣，呈世界性分布，其中巨型艾美耳球蟲感染雞的小腸中段，進(jìn)而使雞的生長性能和飼料消化率降低，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。在對球蟲防治方面，目前基本通過使用化學(xué)藥物進(jìn)行預(yù)防治療，然而，隨著耐藥性的產(chǎn)生和食品安全問題的日益突出，有效的疫苗預(yù)防措施備受關(guān)注[14]。BEACH等[12]首次報道了感染過的雞再次感染會產(chǎn)生抵抗力，此研究為現(xiàn)代雞球蟲疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。然而27年后第1個商品化的抗球蟲活疫苗CocciVac才在美國注冊成功并上市。在過去20年中，多項關(guān)于抗球蟲疫苗及其在家禽養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究被報道。雖然越來越多關(guān)于亞單位疫苗抗球蟲的可行性研究被發(fā)表，但是除了CoxAbic以外至今沒有其他任何商業(yè)化產(chǎn)品上市[15-22]。近年來，國外巨型艾美耳球蟲疫苗，主要有以色列雅貝克公司從巨型艾美耳球蟲的配子體中分離而得的亞單位疫苗 CoxAbic[23]，而國內(nèi)則相對缺少巨型艾美耳球蟲疫苗研發(fā)的信息。

因此本試驗從其入侵機(jī)制出發(fā)，依據(jù)巨型艾美耳球蟲的微線蛋白3，在子孢子侵入腸上皮細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，及其結(jié)構(gòu)域蛋白在子孢子侵入試驗中表現(xiàn)出的結(jié)合能力,選擇研究EmMIC3和EmMARS蛋白，嘗試將球蟲感染阻斷在入侵階段，利用重組蛋白及抗重組蛋白血清，使其產(chǎn)生抗球蟲免疫，以期得到良好的免疫保護(hù)作用，為亞單位疫苗篩選提供參考。

本試驗中，分別采用肌肉注射重組蛋白和翅靜脈注射抗重組蛋白血清2種方法評價重組蛋白EmMIC3、EmMAR2、EmMAR5對巨型艾美耳球蟲感染的免疫保護(hù)作用，重組蛋白免疫方面，感染非免疫組與pET-32a載體蛋白組的ACI值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于100，說明這2組未產(chǎn)生保護(hù)效果。而重組蛋白EmMIC3免疫組的ACI≥180，提示EmMIC3免疫雞，可以對巨型艾美耳球蟲的入侵提供優(yōu)秀的免疫保護(hù)力；重組蛋白EmMAR2免疫組的ACI為170，提示其免疫保護(hù)一般；重組EmMAR5免疫組的ACI<160,提示其無保護(hù)作用。

抗重組蛋白血清免疫方面，感染非免疫組與抗pET-32a載體蛋白血清組的ACI值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于100，說明這2組未產(chǎn)生保護(hù)效果。而抗rEmMIC3血清免疫組的ACI≥180，提示EmMIC3免疫雞，可以對巨型艾美耳球蟲的入侵提供優(yōu)秀的免疫保護(hù)力；抗rEmMAR2血清免疫組的ACI為165，提示其免疫保護(hù)一般；抗rEmMAR5血清免疫組的ACI<160，提示其無保護(hù)作用。

綜上，動物免疫保護(hù)數(shù)據(jù)顯示，EmMIC3和結(jié)構(gòu)域蛋白的免疫保護(hù)作用有所差異，且全蛋白表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)作用，結(jié)構(gòu)域蛋白的免疫保護(hù)能力與其同小腸上皮細(xì)胞的結(jié)合能力以及子孢子侵入能力有相關(guān)性，即在子孢子侵入試驗及細(xì)胞ELISA試驗中與小腸上皮結(jié)合能力最強的結(jié)構(gòu)域蛋白EmMAR2表現(xiàn)出較強的免疫保護(hù)作用，而結(jié)合能力較弱的EmMAR5則未顯示出免疫保護(hù)作用，二者免疫效果與EmMIC3全蛋白進(jìn)行比較，雖然某些結(jié)構(gòu)域具有較好的免疫保護(hù)效果，但是要發(fā)揮更好的抗球蟲感染的免疫作用，可能需要其他結(jié)構(gòu)域蛋白的共同作用。