李 康，徐加利，孫 靜，宋厚輝，程昌勇

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一種革蘭陽性菌，同時(shí)也是一種食源性病原菌[1],廣泛分布在環(huán)境中，易污染經(jīng)加工的即食、冷藏肉類和乳制品等高風(fēng)險(xiǎn)食品[2]。LM易感染免疫低下的人群，可導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)流產(chǎn)，新生兒出現(xiàn)腦膜炎，老年人出現(xiàn)致命菌血癥[1,3]。

LM在入侵宿主的過程中為了免受宿主免疫系統(tǒng)的清除，會使用多種具有抗氧化應(yīng)激功能的蛋白(一些小相對分子質(zhì)量的化合物和酶)[4]。目前已報(bào)道LM中含有2套巰基依賴性氧化還原系統(tǒng)，一個(gè)是硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)系統(tǒng)[5]，另一個(gè)是谷氧還蛋白(glutaredoxin,Grx)系統(tǒng)[6]。Grx系統(tǒng)由NADPH、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽(GSH)和谷氧還蛋白(Grx)組成[7]。GSH是一種低相對分子質(zhì)量的硫醇，并且在細(xì)菌許多的生物活動(dòng)進(jìn)程中有重要作用[7]。Grx可以利用GSH通過其自身兩種截然不同但在功能上互相聯(lián)系的反應(yīng)機(jī)制(即谷胱甘肽化和去谷胱甘肽化機(jī)制)還原目標(biāo)蛋白的二硫鍵，以此來調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)[8]。Grx具有硫氧還蛋白超家族特有的活性位點(diǎn)氨基酸基序Cys-XX-Cys，可以特異性的催化蛋白質(zhì)硫醇與GSSG/GSH之間可逆的硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)，可以保護(hù)蛋白質(zhì)硫醇免受不可逆的氧化作用，并且是細(xì)胞信號傳導(dǎo)和維持胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的至關(guān)重要的氧化還原酶[9]。此外，LM毒力調(diào)控因子PrfA可以通過與GSH結(jié)合被激活[10-12]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)grx缺失株在氧化劑肼(diamide)應(yīng)激條件下的抗氧化脅迫能力顯著增強(qiáng)，在小鼠肝和脾組織中的定植能力也增強(qiáng)[6]。在4 mmol/L diamide應(yīng)激條件下的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，篩選出了與氧化應(yīng)激相關(guān)的滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因opuCA、opuCB、opuCC、opuCD。

LM中存在3個(gè)滲透轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Gbu、OpuC、BetL)，受到外界刺激后能大量表達(dá)并攝取環(huán)境中的相容性溶質(zhì)(甘氨酸、甜菜堿和肉堿)，參與細(xì)菌抗?jié)B透壓脅迫[13-14]。OpuC滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)分別由opuCA/B/C/D基因編碼的ATP結(jié)合蛋白OpuCA、跨膜蛋白OpuCB、胞外底物結(jié)合蛋白OpuCC和跨膜蛋白OpuCD組成，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)相容性溶質(zhì)肉堿[15]。

本研究將通過熒光定量PCR和綠色熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)來探究Grx與滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)OpuC之間的調(diào)控關(guān)系，為后續(xù)進(jìn)一步探索Grx是否參與調(diào)控滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提高LM的抗氧化應(yīng)激能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及培養(yǎng)條件LM野生株EGD-e、大腸桿菌DH5α、溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7、整合型質(zhì)粒pAM401和熒光蛋白質(zhì)粒pFL251，均來自本實(shí)驗(yàn)室冷凍庫；LM培養(yǎng)于BHI(Brain Heart Infusion)培養(yǎng)基，大腸桿菌DH5α培養(yǎng)于LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑BHI(Brain Heart Infusion)培養(yǎng)基購自O(shè)XOID公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司；PCR Master Mix-Blue、ReverTra Ace qPCR RT Kit和 Ligation high Ver.2.0購自TOYOBO公司；GoldView染料購自北京艾德萊生物科技有限公司；質(zhì)粒快速提取試劑盒購自上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司；GEL/PCR Purification Kit購自FAVORGEN公司；TRIzol Reagent試劑購自Thermo Fisher公司；柱式細(xì)菌總RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程公司。

1.3 引物本試驗(yàn)所用引物均由杭州有康生物科技有限公司合成，詳見表1。

1.4grx缺失株重組質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選以LM標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e基因組(GenBank序列號為NC_003210.1)為模板，下載谷氧還蛋白基因grx(lmo2344)前后共5個(gè)基因序列，并通過生物信息學(xué)網(wǎng)站www.biocyc.org查詢基因grx前后基因的啟動(dòng)子區(qū)域并選取上下游同源臂，使用Snapgene軟件在開放閱讀框兩側(cè)分別設(shè)計(jì)引物Δgrx-up-EcoRⅠ-fwd/Δgrx-up-rev和Δgrx-down-fwd/Δgrx-down-PstⅠ-rev擴(kuò)增上下游同源臂。將上下游片段通過Overlap PCR方法連接獲得目的片段，雙酶切目的片段和載體質(zhì)粒pKSV7，隨后使用DNA連接酶將酶切回收后的質(zhì)粒和片段進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，隨后挑選單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將疑似正確的陽性轉(zhuǎn)化子送往杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序成功的菌株進(jìn)行重組質(zhì)粒抽提，并將grx缺失株命名為pSL1618,構(gòu)建路徑如圖1所示。

表1 本試驗(yàn)所用引物信息

圖1 grx缺失株重組質(zhì)粒pSL1618構(gòu)建路徑

1.5grx缺失株的構(gòu)建和篩選制備LM EGD-e感受態(tài)細(xì)胞，并將已構(gòu)建好的grx缺失株重組質(zhì)粒pSL1618取1.5 μg電轉(zhuǎn)至LM EGD-e感受態(tài)。將菌液涂布至含有10 mg/L氯霉素的BHI固體平板上，挑選單菌落進(jìn)行PCR鑒定。PCR驗(yàn)證結(jié)果正確，隨后接種陽性單克隆至BHI液體培養(yǎng)基，42℃振蕩培養(yǎng)箱連續(xù)傳代至PCR鑒定同源臂雙交換整合至EGD-e基因組，完成同源重組后挑選陽性單克隆在不含抗生素的BHI液體培養(yǎng)基中30℃振蕩搖床內(nèi)連續(xù)傳代至質(zhì)粒消除，并使用引物Δgrx-a-front/Δgrx-down-PstⅠ-rev進(jìn)行PCR鑒定。

1.6 熒光定量PCR檢測OpuC滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對opuC在野生株EGD-e和Δgrx中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載基因opuCA/B/C/D和內(nèi)參基因16S rRNA (lmor01)的序列，根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)規(guī)則使用Primer3Plus網(wǎng)站設(shè)計(jì)基因opuCA/B/C/D定量引物(表1)。根據(jù)柱式細(xì)菌總RNA抽提試劑盒說明書對野生株EGD-e和Δgrx進(jìn)行總RNA提取，隨后使用ReverTra Ace qPCR RT Kit將抽提的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試驗(yàn)[6]，收集試驗(yàn)數(shù)據(jù)并使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7 綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選通過生物信息學(xué)網(wǎng)站www.biocyc.org查詢得知基因opuCA/B/C/D共用1個(gè)啟動(dòng)子，以EGD-e為模板，選取約300 bp作為基因opuCA/B/C/D啟動(dòng)子。通過Snapgene軟件設(shè)計(jì)引物PopuC+GFP-a-BamHⅠ-fwd/PopuC+GFP-b-rev擴(kuò)增基因啟動(dòng)子,以pFL251為模板用引物PopuC+GFP-c-fwd/PopuC+GFP-d-SalⅠ-rev擴(kuò)增gfp3序列。將啟動(dòng)子和gfp3序列通過Overlap PCR方法連接，雙酶切目的片段和載體質(zhì)粒pAM401，隨后使用DNA連接酶將酶切回收后的質(zhì)粒和片段進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，隨后挑選單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將疑似正確的陽性轉(zhuǎn)化子送往杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序成功的菌株進(jìn)行重組質(zhì)粒抽提，并將opuC熒光報(bào)告基因的重組質(zhì)粒命名為pSL2511，構(gòu)建路徑如圖2所示。

圖2 opuC熒光報(bào)告基因重組質(zhì)粒pSL2511的構(gòu)建路徑

1.8 GFP報(bào)告系統(tǒng)檢測OpuC滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平將pSL2511重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化到野生株EGD-e和Δgrx，獲得攜帶gfp3報(bào)告基因菌株。通過檢測綠色熒光的釋放量來評價(jià)opuC基因轉(zhuǎn)錄水平，熒光強(qiáng)度越大轉(zhuǎn)錄水平越高，反之則轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平越低。挑選含有g(shù)fp3熒光報(bào)告基因的EGD-e和Δgrx單克隆菌落至5 mL BHI液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。收集菌體，使用10 mmol/L PBS調(diào)整菌液D600值至0.6左右。取10 μLD600值0.6的菌液滴于無菌載玻片正中央，將無菌蓋玻片從一側(cè)緩慢放下，封片固定待觀察。另取200 μLD600值0.6 的菌液至96孔板中，使用多功能酶標(biāo)儀測量菌液的熒光釋放強(qiáng)度(Em/Ex=535/485 nm)，收集數(shù)據(jù)用Graphpad Prism軟件進(jìn)行結(jié)果分析，選取菌株相應(yīng)標(biāo)本片，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建grx缺失株P(guān)CR試驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示，上、下游同源臂片段分別526，494 bp，與預(yù)期結(jié)果一致；通過Overlap PCR擴(kuò)增出約為995 bp (圖3B)的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)酶連產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)后，進(jìn)行菌落PCR及測序驗(yàn)證，測序結(jié)果顯示插入片段為Overlap PCR擴(kuò)增得到的目的片段，表明grx缺失株重組質(zhì)粒pSL1618構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pSL1618電轉(zhuǎn)至LM EGD-e感受態(tài)中，42℃連續(xù)連續(xù)傳13代后，通過引物Δgrx-a-front/Δgrx-down-PstⅠ-rev進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約1 120 bp片段(圖3C)，說明發(fā)生同源重組。30℃連續(xù)傳代后，用引物Δgrx-a-front/Δgrx-down-PstⅠ-rev擴(kuò)增菌落條帶為1 120 bp，而以野生株EGD-e為模板擴(kuò)增出約1 348 bp片段；隨后利用pKSV7質(zhì)粒通用引物M13-fwd/M13-rev進(jìn)行驗(yàn)證，菌落無條帶則說明pKSV7質(zhì)粒已丟掉。將此菌株送往杭州有康生物科技有限公司測序驗(yàn)證，測序結(jié)果正確，表明grx缺失株構(gòu)建成功，命名為Δgrx。

A.上下游同源臂片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B.Overlap PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；C.PCR驗(yàn)證Δgrx源臂重組情況(1～4.EGD-e/pSL1618);D.PCR驗(yàn)證grx基因缺失情況( 1.Δgrx;2.EGD-e;3.ddH2O;4.Δgrx利用引物M13-fwd/M13-rev進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增)。M.DL2000 DNA Marker

2.2 Grx負(fù)調(diào)控滲透轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因opuC的表達(dá)水平通過分析qRT-PCR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Δgrx在4 mmol/L diamide應(yīng)激條件下，滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因opuCA/B/C/D轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平相較于野生株EGD-e，分別上升60.58,50.69,72.26,71.26倍(圖4)，與前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果趨勢一致。

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)opuCA/B/C/D基因的啟動(dòng)子與gfp3融合的重組質(zhì)粒在Δgrx中釋放的熒光量相較于野生株EGD-e顯著增強(qiáng)(圖5A)；Δgrx中報(bào)告基因的熒光釋放強(qiáng)度是野生株EGD-e的4.23倍(圖5B)。以上結(jié)果表明：grx缺失導(dǎo)致LMopuCA/B/C/D基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，grx與opuC基因啟動(dòng)子之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測opuC/A/B/C/D基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

A.熒光顯微鏡下觀察；B.多功能酶標(biāo)儀檢測結(jié)果(***.P=0.000 2)

3 討論

肉堿作為有機(jī)相容性溶質(zhì)，對于李斯特菌的滲透壓保護(hù)至關(guān)重要。將LM滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因opuCA/B/C/D敲除后，突變株攝取肉堿、甘氨酸和甜菜堿的能力均下降，但是攝取相容性溶質(zhì)的能力并沒有完全喪失[13]，而opuC突變株感染小鼠后，在小鼠肝和脾中的定殖能力相較于野生株分別減弱了20和3倍[13,16]。而敲除grx后，grx突變株相較于野生株的抗氧化能力和在小鼠脾和肝組織的定殖能力都顯著增強(qiáng)[6]。本研究中熒光定量結(jié)果驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果中篩選出的與氧化應(yīng)激相關(guān)的滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因opuCA、opuCB、opuCC和opuCD，得出滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因opuCA/B/C/D轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平相較于野生株EGD-e明顯上調(diào)。此檢測結(jié)果與前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致，說明在氧化應(yīng)激條件下，LM能夠通過滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)OpuC的表達(dá)來攝取體外培養(yǎng)基中的相容性溶質(zhì)，抵抗?jié)B透壓脅迫和氧化應(yīng)激，使自身生存能力增強(qiáng)。

在金黃色葡萄球菌中，YhcR蛋白能夠與opuC基因啟動(dòng)子序列結(jié)合，調(diào)控opuC參與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成[17]。在LM中敲除sigB基因后，sigB缺失株在添加有1 mmol/L肉堿和甜菜堿的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，較野生株生長速率分別降低了2.5倍和20%；并且在高鹽濃度環(huán)境下檢測到opuCA基因的轉(zhuǎn)錄水平較野生株顯著降低，表明opuC基因啟動(dòng)子是依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子sigB調(diào)控的[18]。有研究表明SigB在LM感染宿主期間可以調(diào)控opuC抵抗?jié)B透壓脅迫[19]。grx突變株在氧化劑肼的脅迫下，sigB轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較野生株下調(diào)3.55倍[6]。通過綠色熒光蛋白報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，初步證明LM Grx與opuC啟動(dòng)子之間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。但是Grx與滲透轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因opuCA/B/C/D之間的調(diào)控關(guān)系是直接負(fù)調(diào)控還是間接負(fù)調(diào)控？目前還沒有得出結(jié)論，該過程涉及的相關(guān)分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。