王賽楠，李利杰，趙振超，孫文杰，張世華，何春輝，李新生

(河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450002)

雞新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的禽類的一種急性、高度接觸性、傳染性疫病[1]，其主要癥狀為高熱，精神沉郁，呼吸加快，食欲減退，下痢，以及翅、腿麻痹，運動失調(diào)等[2]，該病傳播快、發(fā)病率和死亡率高，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類動物疫病[3]。自1926年被報道以來，ND在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，伴隨著疫苗的廣泛應用，ND的毀滅性大流行已基本得到控制[4]，因為缺乏區(qū)域性協(xié)調(diào)的NDV綜合防控策略，其在全球主要養(yǎng)雞地區(qū)雞群仍時有發(fā)生。

NDV屬于副黏病毒科副黏病毒屬的禽副黏病毒Ⅰ型，是具囊膜的負鏈RNA病毒，僅有1個血清型[5]。ND的確診常常使用病毒分離鑒定、RT-PCR、血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)等，但這些方法均難以區(qū)分分離到的NDV是流行強毒株還是是弱毒疫苗株[6]。單克隆抗體有潛力作為NDV不同毒株抗原性差異區(qū)分的重要鑒別手段[7-8]。區(qū)分NDV毒力強弱的常用方法是測定NDV分離毒株的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)，結合F2蛋白羧基端113～116位是否含有至少3個精氨酸或者賴氨酸，F(xiàn)1蛋白的第117位是否為苯丙氨酸來進行綜合判定[9]。到目前為止，尚未見顯著區(qū)分NDV強、弱毒單克隆抗體制備和鑒定的報道。本課題組為建立快速區(qū)分NDV強毒和弱毒疫苗株病毒的檢測方法，進行相關探索和研究。

1 材料與方法

1.1 病毒、實驗動物和主要試劑NDV La Sota株(基因Ⅱ型，ICPI=0.3)、F48E9株(基因Ⅸ型，ICPI=2.0)、HN09-68株(基因Ⅶ型，ICPI=1.5)、AIV H9N2亞型X-13株、IBDV C4株、FAdV-4 WZ株、NS0細胞均由河南農(nóng)業(yè)大學鑒定保存；BALB/c小鼠購自鄭州大學動物實驗中心；SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司；弗氏佐劑、HAT培養(yǎng)基等購自Sigma公司。

1.2 病毒的增殖和濃縮純化采用雞胚尿囊腔接種法增殖NDV La Sota株，收獲尿囊液，4℃，3 000 r/min離心30 min，棄沉淀，取上清4℃，20 000 r/min離心2 h，沉淀以適量PBS緩沖液重懸，10%～60%蔗糖連續(xù)密度梯度，38 000 r/min離心4 h，收集病毒液，脫糖，檢測HA效價，作為免疫原，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物免疫用0.1%的甲醛滅活上述純化的La Sota病毒，與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下分點接種6周齡BALB/c小鼠2只，0.2 mL/只。二免和三免用弗氏不完全佐劑制備，每次接種0.2 mL/只。免疫間隔為2周。三免后1周，斷尾采血，測定血清效價，達到要求后，于融合前3 d以病毒液腹腔接種加強免疫。

1.4 間接ELISA方法的初步建立按照棋盤法倍比稀釋La Sota株病毒抗原和對照血清，確定最佳抗原稀釋倍數(shù)、陽性血清稀釋倍數(shù)，建立間接ELISA方法。隨機選取未免疫的健康小鼠10只，斷尾，采集陰性血清。在最佳ELISA條件下，計算陰陽臨界值(陰陽臨界值=陰性標本D450平均值+3×標準差)。

1.5 小鼠血清效價的測定將待檢小鼠斷尾采血，用建立的間接ELISA方法檢測抗體效價。

1.6 細胞融合按照文獻[10]方法，無菌采集免疫小鼠的脾臟，研磨分離成單個脾細胞，與NS0進行融合。將細胞懸液加入有飼養(yǎng)細胞的96孔HAT選擇性培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)板中，置37℃、5% CO2培育箱中培養(yǎng)。

1.7 陽性雜交瘤細胞的篩選及亞克隆培養(yǎng)10～14 d時，選擇只有單個細胞群落的細胞孔，吸取培養(yǎng)液，檢測其ELISA效價。對陽性單克隆細胞用有限稀釋法進行3次亞克隆。穩(wěn)定分泌特異性單抗的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)、凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 腹水的制備和純化取12周齡經(jīng)產(chǎn)BALB/c母鼠，腹腔注入無菌液體石蠟，0.5 mL/只。7～10 d后每只小鼠腹腔注射1.0×106個雜交瘤細胞。連續(xù)觀察，待小鼠腹部明顯膨大有波動感時，用穿刺針無菌收集腹水，離心取上清，親和層析法純化，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 單抗效價的測定用上述間接ELISA方法測定單克隆雜交瘤上清液和純化單抗效價。

1.10 雜交瘤細胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測將雜交瘤細胞進行傳代培養(yǎng)10代以上，凍存，2個月后復蘇，然后再連續(xù)傳至10代，用建立的間接ELISA方法檢測其效價。

1.11 單抗特異性鑒定分別用AIV H9N2亞型X-13株、IBDV C4株、FAdV-4 WZ株包被96孔酶標板，采用間接ELISA方法鑒定各株單抗反應特異性，用本研究制備的單克隆抗體作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，測定篩選鑒定的陽性單抗與上述參考病毒的反應性。

1.12 單抗中和活性測定將NDV La Sota株雞胚尿囊液用PBS緩沖液進行10-5，10-6，10-7，10-8稀釋，分別與等體積的純化單抗混合，37℃作用1 h，與不加單抗的病毒稀釋液，各尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，37℃培養(yǎng)96 h后收集接種雞胚的尿囊液，測定HA效價，檢測單抗的中和效果。

1.13 單抗亞型鑒定按照IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit說明書，對獲得的單克隆抗體進行亞型鑒定。

1.14 陽性單抗與不同毒力NDV的結合能力鑒定按照1.4中的抗原最佳包被濃度，用NDV La Sota株、F48E9株和HN09-68株純化病毒液分別包被96孔酶標板，用上述陽性單抗作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，TMB顯色，測定D450值，判定單抗與不同毒力NDV毒株的結合特性。

1.15 Western blot鑒定將純化的La Sota病毒進行SDS-PAGE電泳，電轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別使用1E3、7A8、8F11作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，DAB避光顯色10 min，確定一抗對應的目的帶。

1.16 蛋白鑒定收集純化Western blot中單抗對應的目的蛋白，送生工生物工程有限公司進行二級質(zhì)譜測定。

2 結果

2.1 間接ELISA方法的初步建立將純化后的La Sota株抗原用碳酸鹽緩沖液分別稀釋為54.8，27.4，13.7，6.9 mg/L，包被酶標板。使用SPF健康小鼠的陰性血清或免疫制備的陽性血清作為一抗，將血清1∶12 800～1∶204 800作倍比稀釋，進行ELI-SA檢測，測定結果見表1。當抗原的包被質(zhì)量濃度為13.7 mg/L，血清稀釋度為1∶102 400時，陽性血清D450值最接近1.0，同時P/N>2.0，陰性血清D450值也最低，所以13.7 mg/L為La Sota株最佳包被質(zhì)量濃度。

表1 抗原包被質(zhì)量濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定

2.2 陰陽臨界值的確定取10只SPF健康小鼠的血清，按照13.7 mg/L包被酶標板，將陰性血清用5%脫脂奶粉稀釋至1∶102 400，測定D450值。10只陰性小鼠血清D450平均值為0.085，標準差為0.015，根據(jù)公式：陰陽臨界值=陰性標本D450平均值+3×標準差，陰陽臨界值為0.130。

2.3 陽性雜交瘤細胞的建立經(jīng)細胞融合和亞克隆培養(yǎng)，使用上述ELISA方法篩選獲得3株分泌抗NDV La Sota株單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其分泌的單抗分別命名為1E3、7A8、8F11。

2.4 陽性雜交瘤細胞的穩(wěn)定性和單克隆抗體效價的測定將上述3株定株的雜交瘤細胞株凍存2個月后復蘇，然后連續(xù)傳至第10代，測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和相應腹水的效價(表2)。

2.5 單抗特異性鑒定3株單抗僅與La Sota株包被的酶標板呈陽性反應，而與AIV H9N2亞型X-13株、IBDV C4株、FAdV-4 WZ株均呈陰性反應(表3)，證明3株單抗均具有良好的特異性。

表2 第10代雜交瘤細胞上清和腹水中不同單抗的ELISA效價

表3 不同單抗與不同包被抗原ELISA測定結果

2.6 單抗中和活性測定雞胚中和試驗結果(表4)顯示，1E3中和組和8F11中和組與對照組相比，雞胚感染數(shù)量無顯著性差異，對NDV La Sota株無中和活性。7A8中和組，在10-7稀釋度時對NDV La Sota株具有顯著的中和活性。

2.7 單抗亞型鑒定如圖1所示，使用羅氏抗體分型診斷試紙判定1E3和8F11為IgG1亞型，7A8為IgM亞型，其輕鏈均為κ鏈。

2.8 不同單抗與不同毒力NDV結合能力的鑒定如表5所示，當上述純化的單克隆抗體1∶51 200倍稀釋時，只有1E3與La Sota呈強陽性反應。使用不同毒力的NDV包被的酶標板，1E3與La Sota反應的D450值為2.543，呈陽性反應，而強毒株F48E9和HN09-68與單克隆抗體的反應小于陰陽臨界值，呈陰性反應。1E3與弱毒的反應和與強毒F48E9、HN09-68的反應之間P<0.05，差異性顯著。由此可見，1E3具備區(qū)分NDV強毒和弱毒的能力。

表4 不同單抗對NDV La Sota株雞胚中和試驗結果

圖1 單抗亞型的鑒定

表5 單克隆抗體與不同NDV毒株反應

2.9 NDV La Sota株病毒SDS-PAGE電泳、Western blot和二級質(zhì)譜鑒定為識別1E3、7A8、8F11所針對的NDV抗原種類，使用純化的La Sota病毒進行SDS-PAGE、Western blot，只有單抗1E3可見穩(wěn)定清晰的結果(圖2B)，La Sota病毒顆粒中相對分子質(zhì)量約為53.8 kDa與1E3發(fā)生了特異性反應。二級質(zhì)譜測定證明該抗原蛋白的一級結構含有LGVEYAQAQGSSINE DMAAELK序列(圖3)，經(jīng)De novo，確認該蛋白為La Sota株NP蛋白。

A．純化的La Sota病毒SDS-PAGE分析; B.Western blot分析。M.蛋白Marker；1.空白對照；2．純化的La Sota病毒

圖3 結合單克隆抗體1E3的蛋白部分片段的二級質(zhì)譜圖

3 討論

多年來，我國一直采用弱毒疫苗聯(lián)合滅活疫苗接種來預防和控制ND的感染和傳播。由于免疫程序安排不當，或者疫苗存放或使用不當?shù)龋Ｖ旅庖呤11]。當前，ND仍是我國養(yǎng)禽業(yè)必須預防的禽類重大疫病之一[12]。臨床診斷中，常分離到NDV，由于ND弱毒疫苗的廣泛使用，很難短時間內(nèi)區(qū)分分離到的NDV是流行的強毒株，還是疫苗弱毒株。

NDV強毒株和弱毒株不同的抗原性是由于強毒株和弱毒株所含抗原表位的差異所致，單克隆抗體可以特異性識別單個抗原表位，常用于NDV抗原差異性的研究[13]。ALEXANDER等[14]對單抗在毒株鑒定和分類方面進行了深入研究，應用針對病毒表面糖蛋白的單克隆抗體進行強毒株的鑒定和分型，以區(qū)別抗原性的變異。本研究篩選獲得3株生長狀態(tài)良好且穩(wěn)定分泌抗NDV單克隆抗體雜交瘤細胞株。單抗7A8重鏈為IgM亞型，輕鏈為κ鏈，其對NDV La Sota株有顯著的中和活性，具有重要的臨床治療潛力；1E3與NDV的強毒和弱毒存在截然不同的結合能力，可與疫苗弱毒株La Sota株發(fā)生強烈的結合反應，而與基因Ⅶ型NDV HN09-68株和經(jīng)典基因Ⅸ型NDV F48E9株結合反應呈陰性?；颌餍偷腘DV是當前我國流行的強毒NDV的主要優(yōu)勢基因型。由此可見,1E3具有區(qū)分NDV流行強毒和疫苗弱毒的重要應用價值。

經(jīng)SDS-PAGE電泳、Western blot、二級質(zhì)譜測定，證實1E3對應的抗原為NDV的NP蛋白。通常認為,NDV的F蛋白裂解位點兩側堿性氨基酸的含量決定了NDV毒力的強弱[3]。對比NDV弱毒株La Sota株、強毒株F48E9株、HN09-68株的NP蛋白的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)：La Sota株與F48E9株NP蛋白的氨基酸差異有38個氨基酸，La Sota株與HN09-68株NP蛋白的氨基酸差異有46個。胡順林等[15]把NDV強毒株ZJ1株NP蛋白基因替換為中等毒力毒株BC株NP蛋白基因，拯救獲得的重組NDV毒力顯著減弱，可見，NDV毒力的強弱與NDV NP蛋白氨基酸的組成相關。DORTMANS等[16]也證實NP蛋白與NDV的毒力密切相關。提示除F蛋白外，NP蛋白變異氨基酸也可能是NDV毒力強弱分子基礎的重要組成，可以利用能夠識別這種變異的單抗來區(qū)分NDV毒株毒力強弱。

眾所周知，NDV強、弱毒的快速鑒別一直是NDV臨床快速診斷的瓶頸，區(qū)分NDV毒株毒力的強弱，常常需要測定F基因裂解位點特征序列，并進行1日齡SPF雞腦內(nèi)致病指數(shù)測定(ICPI)，該方法要求較高，且費時費力[17]。單抗1E3的發(fā)現(xiàn)，預示可以利用1E3與疫苗弱毒株La Sota株超強的結合能力以及與經(jīng)典和現(xiàn)行流行強毒的陰性結合反應的顯著差異，研發(fā)快速診斷試紙或者夾心ELISA試劑盒，豐富NDV分離株毒力強弱的快速區(qū)分診斷工具。