張婷婷，詹妙新，張賓樂，于立志，王茵

(1.武夷學院 茶與食品學院，福建 南平 354300；2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361012；3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

牡蠣是我國四大養(yǎng)殖經濟貝類之一，屬低脂高蛋白食物，含有豐富的營養(yǎng)物質及呈味氨基酸[1-2]。牡蠣提取物具有抑菌、降血脂、降血壓、抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性，因此在食品及藥用方面都具有極高的應用價值[3]。近年來，牡蠣的產量不斷提高，由于水產品存在較難保鮮、傳統(tǒng)加工技術利用率低的問題，僅靠傳統(tǒng)加工工藝已經不能滿足社會的需求，因此對牡蠣進行更高效的開發(fā)利用迫在眉睫。目前我國牡蠣主要以菜肴及加工干制品為主，除了家庭常用佐料——蠔油是以牡蠣為原料制成外，其他的牡蠣加工制品并不多見。隨著生物科學技術的發(fā)展和人們生活水平的提高，高值化水產品的需求量大幅上升，水解蛋白產品則為其中最受歡迎的一種。蛋白質被水解后變成小分子肽，營養(yǎng)價值升高，功能性質也有所提升，被越來越多的研究者所青睞[4]。在眾多新型加工技術中，酶處理的技術作用條件溫和，反應過程易于控制且可以較好地保留氨基酸等營養(yǎng)物質，尤其受到人們的青睞。以天然海產品為原料，采用酶制劑以適當條件進行水解，所得的酶解液即為海鮮調味基料。海鮮調味基料再經過復配、調配、濃縮或噴霧干燥得到最終產品——海鮮調味料。酶解法制備的海鮮調味料含有氨基酸、多肽、糖、有機酸、核苷酸等呈味成分和?；撬岬缺＝〕煞郑兜勒鎸崫庥?，經濟適用，污染浪費程度很小，因此酶解法在海鮮調味料行業(yè)中應用廣泛[5-6]。由于新鮮牡蠣在實驗過程中不易保存，在儲存及運輸過程中易腐臭，因此本研究以干制牡蠣為原料。當前針對牡蠣多采用單酶水解法，但酶解產物常常存在氨基酸態(tài)氮含量低、蛋白質回收率不高等問題。因此，本研究選取牡蠣干酶解效果較優(yōu)的兩種酶類，采用復合酶解法，以酶解液的氨基酸態(tài)氮含量及感官品質為指標，通過單因素實驗和響應面優(yōu)化，制備感官品質和營養(yǎng)價值最優(yōu)的牡蠣干海鮮調味基料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣干：產自福建省泉州市惠安縣，依據GB 5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的直接干燥法，測定其含水率為19.7%。

風味蛋白酶(酶活力1.0×105U/g)：浙江一諾生物科技有限公司；堿性蛋白酶(酶活力2.0×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力1.5×105U/g)：河南仰韶生化工程有限公司；木瓜蛋白酶(酶活力2.0×105U/g)：南寧龐博生物工程有限公司；活性干酵母：安琪酵母有限公司；小蘇打(食品級)：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；白醋(食品級)：江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司。

甲醛：三明市三明圓化學試劑有限公司；乙醇：西隴科學股份有限公司；酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉：上海展云化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4CW電熱恒溫水浴鍋 金壇市鴻科儀器廠；L18-Y915S九陽破壁機 九陽股份有限公司；Neofuge 15R高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；FA224電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ZFD-A5040A全自動新型鼓風干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司；Sartourius PB-10酸度計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；CJJ78-1磁力攪拌器 金壇市大地自動化儀器廠；RE-2000A旋轉蒸發(fā)器 上海亞蒙生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

牡蠣干制備海鮮調味基料的工藝流程：

1.3.2 操作要點

將牡蠣干清洗后，以料水比1∶5(g/mL)添加蒸餾水，在室溫下浸泡約24 h后，連同浸泡水一同放入破壁機中打漿，得到牡蠣勻漿。用食用小蘇打水和食用白醋調節(jié)pH，加入一定濃度的蛋白酶，置于一定溫度的水浴鍋中酶解，再在沸水浴中滅酶10～15 min，冷卻至室溫。將酶解液在8000 r/min高速冷凍離心機中離心15 min后取上清液，加入1%活性干酵母混勻，在40 ℃水浴1 h，以去除腥味，再過濾除去活性干酵母[7-8]，最后在55 ℃下真空濃縮至原始體積的1/3，得到牡蠣風味的海鮮調味基料。

1.3.3 復合蛋白酶品種的確定

參考文獻[9]和[10]，選用風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶。依據廠商提供的最適酶解參數(shù)(見表1)，在總加酶量3500 U/g的條件下分別對牡蠣勻漿酶解8 h，測定氨基酸態(tài)氮含量及感官評分。以氨基酸態(tài)氮含量為主要考察指標，在氨基酸態(tài)氮含量接近的情況下輔助考察感官評分指標。比較4種蛋白酶的酶解效果差異，選取最適的兩類進行后續(xù)的復合酶解實驗。

表1 不同蛋白酶的最適酶解參數(shù)Table 1 The optimum enzymatic hydrolysis parameters of different proteases

1.3.4 復合酶解的單因素實驗設計

以氨基酸態(tài)氮含量作為考察指標[11]，判斷不同酶解條件對酶解效果的影響，每組實驗均重復操作3次，取平均值。

酶解時間的確定：酶解時間分別設為2，3，4，5，6 h，其他工藝參數(shù)為：總加酶量3000 U/g，酶解溫度55 ℃，酶解pH值7，風味蛋白酶與中性蛋白酶的酶活比1∶2(U/U)。

酶解溫度的確定：酶解溫度分別設為45，50，55，60，65 ℃，其他工藝參數(shù)為：總加酶量為3000 U/g，酶解時間3 h，酶解pH值7，風味蛋白酶與中性蛋白酶酶活比1∶2(U/U)。

酶解pH值的確定：酶解pH值分別設為6，6.5，7，7.5，8，其他工藝參數(shù)為：總加酶量3000 U/g，溫度55 ℃，酶解時間3 h，風味蛋白酶與中性蛋白酶酶活比1∶2(U/U)。

總加酶量的確定：總加酶量分別設1000，2000，3000，4000，5000 U/g，其他工藝參數(shù)為：酶解時間3 h，酶解溫度55 ℃，酶解pH值7，風味蛋白酶與中性蛋白酶的酶活比1∶2(U/U)。

復合酶酶活配比的確定：風味蛋白酶與中性蛋白酶的酶活比分別設為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 (U/U)，其他工藝參數(shù)為：總加酶量3000 U/g，酶解時間3 h，酶解溫度55 ℃，酶解pH值7。

1.3.5 復合酶解的響應面優(yōu)化設計

根據單因素實驗結果，以氨基酸態(tài)氮含量為考察指標，通過正交實驗對總加酶量、酶解水浴溫度和酶解時間3個因素進行優(yōu)化，實驗設計見表2。

表2 響應面實驗因素與水平Table 2 The factors and levels of response surface experiment

1.3.6 測定方法

1.3.6.1 酶解液中氨基酸態(tài)氮的測定

根據GB 5009.235-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的酸度計法進行測定。

1.3.6.2 酶解液的感官評定

參考文獻[12]設置感官評定標準，見表3。挑選10名食品專業(yè)的教師組建感官評定小組，依據表3對酶解液的色澤、組織狀態(tài)、口感和腥味4個方面進行感官評分。

表3 感官評定標準Table 3 The sensory evaluation standard

1.3.7 數(shù)據處理

采用SPSS 18.0的Duncan法對實驗所得數(shù)據進行顯著性差異分析，單因素實驗采用Excel 2016作圖，響應面優(yōu)化采用Design-Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類的確定

蛋白酶具有作用位點專一的特點，不同蛋白酶水解位點不同，同一種蛋白質使用不同外源性蛋白酶進行酶解時，水解效果呈現(xiàn)明顯差異[13]。由圖1可知，添加風味蛋白酶的氨基酸態(tài)氮含量最高，其次是堿性蛋白酶與中性蛋白酶接近，最低的是木瓜蛋白酶。該結果與馮丹丹研究得出的“牡蠣酶解液中氨基酸態(tài)氮含量較高的是中性蛋白酶和風味蛋白酶，較低的是木瓜蛋白酶”結果接近。由于風味蛋白酶氨基酸態(tài)氮含量最高，且感官評分也較高，因此確定風味蛋白酶為后續(xù)復合酶解的種類之一。堿性蛋白酶與中性蛋白酶的氮基酸態(tài)氮含量接近，但堿性蛋白酶的感官評分最低，因此選取中性蛋白酶為后續(xù)復合酶解的種類之二。由于木瓜蛋白酶氮酸基態(tài)氮的含量最低，因此不作選擇。影響感官評分的因素除了氨基酸含量外，還有其他水解產物，如?；撬?、有機酸、核苷酸、糖及鋅、銅、硒等微量元素。選取風味蛋白酶及中性蛋白酶進行后續(xù)的復合酶解實驗，與馮丹丹研究得出的“中性蛋白酶及風味蛋白酶對牡蠣的水解度較優(yōu)”的結果相符。

圖1 不同蛋白酶對酶解效果及感官品質的影響Fig.1 Effects of different proteases on enzymatic hydrolysis effect and sensory quality

2.2 復合酶解的單因素實驗結果

2.2.1 酶解時間的確定

由圖2可知，氨基酸態(tài)氮含量隨著酶解時間的延長而升高。這是由于時間越長，底物蛋白質被水解成小肽和氨基酸等小分子成分越充分。當酶解時間低于4 h時，隨著酶解時間的遞增，氨基酸態(tài)氮含量顯著上升(p<0.05)。當酶解4 h時，氨基酸態(tài)氮含量達2.6 mg/mL，與之前相比顯著提高(p<0.05)。在酶解4 h之后，氨基酸態(tài)氮含量雖有上升，但速度趨于平緩，5 h和4 h相比，并未顯著提高(p>0.05)。這是由于隨著酶解的進行，底物不斷減少，蛋白酶活力逐漸降低，水解速率下降。因此，考慮成本，將響應面優(yōu)化實驗中酶解時間設為4 h左右為宜。

圖2 酶解時間對酶解效果的影響Fig.2 Effects of enzyme hydrolysis time on enzymatic hydrolysis effect

2.2.2 酶解溫度的確定

由圖3可知，隨著溫度的升高，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢。當溫度為60 ℃時酶解效果最佳，氨基酸態(tài)氮含量為2.1 mg/mL。該結果與表1顯示的該廠家提供的風味蛋白酶和中性蛋白酶的最適溫度為50 ℃相違背，這是由于實驗過程恰逢寒冬季節(jié)，室內溫度僅為4～6 ℃，當水浴溫度設在50 ℃時，酶解液中心達不到酶解反應的最佳溫度，酶解效果不理想。因此，在室溫低時，酶解溫度可在廠家提供的最適溫度上適當提高。當水浴溫度升高至55～60 ℃時，氨基酸態(tài)氮含量顯著提高(p<0.05)，60 ℃時達到最高點。高于60 ℃后，曲線顯著下降(p<0.05)，這是由于溫度過高，易引起蛋白質變性，使酶失活。因此，在響應面優(yōu)化實驗中，酶解水浴溫度設在60 ℃左右為宜。

圖3 酶解溫度對酶解效果的影響Fig.3 Effects of enzyme hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis effect

2.2.3 酶解pH的確定

由圖4可知，隨著pH值的上升，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后下降的趨勢。當pH值為7時酶解效果最好，氨基酸態(tài)氮含量為2 mg/mL。越偏離中性條件，酶解效果越差。由表1也可知，該廠家提供的風味蛋白酶和中性蛋白酶的最適pH值分別為6.5和7，由于兩者的添加比例為酶活比1∶2，即中性蛋白酶的添加比例更大，根據理論分析，最佳pH應在6.5～7，且更趨近于7，與本實驗的結果相符。因此，pH值可直接設定為6.8，不再進行響應面優(yōu)化實驗。

圖4 酶解pH值對酶解效果的影響Fig.4 Effects of enzyme hydrolysis pH value on enzymatic hydrolysis effect

2.2.4 總加酶量的確定

由圖5可知，隨著加酶量的增加，氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。當加酶量低于2000 U/g時，氨基酸態(tài)氮含量顯著上升(p<0.05)。當加酶量為2000 U/g時，氨基酸態(tài)氮含量為1.9 mg/mL。當加酶量超過2000 U/g時，氨基酸態(tài)氮含量上升的速率較為平緩。這是由于底物含量是固定的，當加酶量接近或大于底物含量時，即使加酶量不斷增加，酶解速率基本達到最大值，上升空間不大。因此，綜合成本因素考慮，在響應面優(yōu)化實驗中，總加酶量設定在2000 U/g左右為宜。

圖5 總加酶量對酶解效果的影響Fig.5 Effects of total enzyme additive amount on enzymatic hydrolysis effect

2.2.5 酶配比的確定

由圖6可知，當酶活配比為1∶2時，酶解效果最好，其他配比的酶解效果略低于1∶2。風味蛋白酶和中性蛋白酶的最適酶解參數(shù)相近，因此，不同配比對酶解效果影響不大。根據圖6曲線的最高點，確定風味蛋白酶與中性蛋白酶以酶活比1∶2復配，不再進行響應面優(yōu)化。

圖6 酶活比對酶解效果的影響Fig.6 Effects of enzyme activity ratio on enzymatic hydrolysis effect

2.3 復合酶解的響應面優(yōu)化結果

2.3.1 回歸模型確定及響應面分析

選用風味蛋白酶和中性蛋白酶進行復合酶解優(yōu)化實驗，該響應面實驗的自變量為酶解時間、酶解溫度和加酶量，響應值是牡蠣勻漿中的氨基酸態(tài)氮生成量，實驗設計及結果見表4。

表4 響應面設計方案及結果Table 4 Response surface design scheme and results

利用Design-Expert 8.0.6對響應面結果進行二次多元回歸擬合，得到(A)酶解時間、(B)酶解溫度、(C)總加酶量的二次多項回歸方程：Y=2.23+0.096A+8.75×10-3B+0.18C-0.018AB+0.11BC-0.32A2-0.072B2-0.33C2。

由表5的方差分析結果可知，模型的p=0.0033<0.01，而失擬項不顯著(p=0.9674>0.05)，表明模型顯著，二次模型選擇合適。該模型的R2=0.9262，RAdj2=9.679，表明該模型擬合度良好，實驗誤差小，適合對牡蠣酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量進行分析和預測。因素C、A2、C2對結果的影響極為顯著(p<0.01)，因素A、B、AB、AC、BC、B2對結果的影響不顯著(p>0.05)。因素分析表明，反應條件對氨基酸態(tài)氮含量的影響大小為酶添加量>酶解時間>酶解溫度。

表5 方差分析Table 5 Variance analysis

2.3.2 響應面曲面圖

酶解溫度和酶解時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖7，酶解溫度和加酶量對氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖8，酶解時間和加酶量對氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖9。

圖7和圖8的等高線呈橢圓形，說明酶解時間和酶解溫度、酶解溫度和加酶量的交互作用顯著；圖9的等高線呈圓形，說明酶解時間和加酶量的交互作用不顯著。圖7中固定總加酶量為3000 U/g，由此可以看出，與酶解溫度相比，酶解時間軸上的響應值更陡峭，說明酶解時間比酶解溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響更大；圖8三維圖中固定酶解時間為4 h，與酶解溫度相比，加酶量軸上的響應值更陡峭，說明加酶量比酶解溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響更大；圖9中固定酶解溫度為55 ℃，與酶解時間相比，加酶量軸上的響應值更陡峭，說明加酶量比酶解時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響更大。由此可知，得出的結論與方差分析相一致。由圖7的三維圖可知，氨基酸態(tài)氮含量隨酶解溫度和酶解時間的增加而增加，當達到它的最高峰時又逐漸減弱，且酶解時間變化的幅度比較大，酶解溫度較為平緩，這說明酶解時間和酶解溫度過高或過低，氨基酸態(tài)氮含量都不會達到最大。圖8和圖9中的情況大致相同，同理可得。

圖7 酶解時間和酶解溫度對氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面和等高圖Fig.7 Response surface and contour map of the effect of enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis temperature on amino acid nitrogen content

圖8 酶解溫度和加酶量對氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面和等高圖Fig.8 Response surface and contour map of the effect of enzymatic hydrolysis temperature and enzyme additive amount on amino acid nitrogen content

圖9 酶解時間和加酶量對氨基酸態(tài)氮含量影響的響應面和等高圖Fig.9 Response surface and contour map of the effect of enzymatic hydrolysis time and enzyme additive amount on amino acid nitrogen content

2.3.3 最佳工藝參數(shù)驗證實驗

根據所建立的響應面擬合方程進行參數(shù)最優(yōu)分析，得到預測最佳工藝條件：酶解時間4.14 h，酶解溫度61.32 ℃，總加酶量2303.73 U/g。為了便于操作，酶解時間設為4 h，酶解溫度設為61 ℃，總加酶量設為2304 U/g，在此條件下進行3組平行實驗，氨基酸態(tài)氮含量的實際測得值為(2.29±0.01) mg/mL，與模型預測值2.26 mg/mL接近，相對誤差為1.33%。

2.4 成品感官檢驗

依據表3對最優(yōu)工藝下制備的牡蠣調味基料進行成品感官檢驗，色澤呈黃綠色，組織狀態(tài)均一穩(wěn)定，鮮味明顯，無異味，有牡蠣特有的海鮮風味，略帶腥味，感官評分為86分。

3 結論與討論

3.1 結論

以水分含量為19.7%的牡蠣干為原料，在料水比1∶5(g/mL)，酶解pH 6.8，風味蛋白酶與中性蛋白酶以酶活比1∶2(U/U)復配，酶解時間4 h，酶解溫度61 ℃(室內溫度4～6 ℃)及總加酶量2304 U/g的條件下，得到牡蠣酶解液的氨基酸態(tài)氮含量實際測得值為2.29 mg/mL，與預測值2.26 mg/mL的相對誤差為1.33%。制得的牡蠣海鮮調味基料呈黃綠色，組織狀態(tài)均一穩(wěn)定，有牡蠣特有的海鮮風味，但略帶腥味，感官評分為86分。

3.2 討論

本研究針對牡蠣干，選取酶解效果較優(yōu)的兩種酶類——風味蛋白酶與中性蛋白酶，采用復合水解法優(yōu)勢互補，制備的牡蠣海鮮調味基料的營養(yǎng)價值及風味物質優(yōu)于其他同類型產品。劉艷[14]曾以總酶量12%，pH 6.5，酶解時間3 h，無花果蛋白酶與風味蛋白酶的比例為3∶1制備牡蠣酶解液，氨基酸態(tài)氮含量僅為2.12 mg/mL。該研究為后續(xù)的復合海鮮調味料的開發(fā)制備提供了工藝參數(shù)和研發(fā)的參考依據。

該研究采用酵母對牡蠣進行脫腥，但成品中仍有腥味，這是由于酵母在發(fā)酵反應中產生的次級代謝產物對水產食品雖有增香及掩蓋異味等作用，能一定程度上去除腥味，但去腥效果較為一般[15-16]。目前水產品脫腥手段主要有掩蔽除腥法、物理除腥法、化學除腥法及生物除腥法，若單一處理方式效果不理想時，可將幾種方式聯(lián)合使用，有助于獲得更優(yōu)的除腥效果。因此，該研究在脫腥環(huán)節(jié)還需進一步優(yōu)化。

海鮮調味料是調味料發(fā)展的一個重要方向，還有以扇貝裙邊、貽貝、蛤仔及羅非魚下腳料等為原料，采用酶法制備海鮮調味料的類似研究，均取得較好的成果[17-19]，我國豐富的海洋資源亦為其快速發(fā)展提供了物質基礎[20]。因此，復合海鮮調味料的開發(fā)在我國具有豐富的物質基礎、廣闊的市場空間和良好的發(fā)展前景。