劉浩，吳葉，張建萍，陳尚龍，劉輝

(徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221018)

羊肉是一種低脂、低膽固醇、高蛋白的肉類食品，富含脂肪27.9%(低于豬肉)，優(yōu)質(zhì)蛋白10.9%(高于豬肉)，相比于其他畜禽肉，羊肉富含更多的鈣、鐵、磷、碘等礦物質(zhì)，并且含有人體所需要的維生素B1、B2[1]。

發(fā)酵香腸是利用微生物的發(fā)酵作用，通過將肉、脂肪、香辛料、發(fā)酵劑等混合均勻后灌入腸衣，再經(jīng)過后期干燥成熟，制成的pH低于5.3，能夠在常溫下貯藏運輸，兼具風(fēng)味與色澤的發(fā)酵肉制品[2]。在我國不同的地方有著各自特色的香腸，如廣東香腸、江蘇如皋香腸、東北紅腸等。我國傳統(tǒng)發(fā)酵香腸風(fēng)味獨特、易于貯藏、食用方便，可直接拼盤食用，也可煎、炒、烹、炸，深受消費者的歡迎，但是存在著生產(chǎn)周期過長、鹽分含量過高、香腸品質(zhì)參差不齊的問題，甚至存在生物胺、致病菌等嚴(yán)重的食品安全隱患[3]。隨著科技進步，傳統(tǒng)的發(fā)酵香腸工藝已不適應(yīng)現(xiàn)代化的要求，現(xiàn)代發(fā)酵香腸已實現(xiàn)了規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，在縮短周期的同時還提高了產(chǎn)品品質(zhì)，但是致病菌、生物胺等食品安全隱患依然存在。過酸、高脂高鹽的加工不能滿足消費者對食品品質(zhì)的要求，因此低脂低鹽、具有益生性的發(fā)酵香腸具有很大的市場潛力[4]。

乳桿菌屬是發(fā)酵香腸中最重要的微生物菌群，發(fā)酵香腸常用的乳桿菌主要有清酒乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌等[5]。這類細(xì)菌生長以糖類為營養(yǎng)物質(zhì)，分解產(chǎn)生乳酸，乳酸能夠降低發(fā)酵香腸的pH，香腸的pH降低后，致病菌和雜菌的生長受到抑制，從而延長發(fā)酵香腸的貨架期[6]。由于單一菌種發(fā)酵過程中會出現(xiàn)生物胺、亞硝酸鹽積累的風(fēng)險，所以現(xiàn)在發(fā)酵香腸中越來越多地采用復(fù)配發(fā)酵劑。復(fù)配發(fā)酵劑是將幾種發(fā)酵劑按比例混合，彌補單一菌種發(fā)酵劑的缺陷，發(fā)揮各菌種的優(yōu)勢，提高香腸的風(fēng)味品質(zhì)[7]。

我國羊肉產(chǎn)量位居世界第一，但是對羊肉的消費大多停留在生鮮肉階段，多見于火鍋、紅燒、烤制等烹調(diào)方式中[8]。由于羊肉特有的膻味，傳統(tǒng)香腸基本以豬肉為原料，很少見到用羊肉灌制香腸，利用發(fā)酵劑發(fā)酵香腸，在一定程度上可以抑制膻味，改善香腸的色澤和品質(zhì)，延長貨架期[9]，促進我國畜牧業(yè)發(fā)展，為消費者提供一種新型羊肉制品，在滿足消費者味蕾的同時兼具營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：羊后腿瘦肉、豬背膘：徐州云龍萬達永輝超市；天然豬腸衣：申源腸衣品牌直銷店。

輔料：食用鹽、蔗糖、白酒、白胡椒粉、蒜粉、姜粉：徐州云龍萬達永輝超市；葡萄糖：山家人；亞硝酸鈉：山東優(yōu)索化工科技有限公司；D-異抗壞血酸鈉：糖柜旗艦店。

發(fā)酵劑：植物乳桿菌、木糖葡萄球菌：徐州工程學(xué)院微生物實驗室提供。

試劑：苯酚(AR)、石油醚(AR)：天津福晨化學(xué)試劑廠；鹽酸萘乙二胺(AR)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸(AR)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；7230G可見分光光度計 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；BGZ-70電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造有限公司；S2-A81絞肉機 九陽股份有限公司；DK-98-II型萬用電爐 天津泰斯特儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 江蘇德?？萍純x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵羊肉香腸工藝流程

原料肉預(yù)處理(去筋、漂洗)：瘦肉絞碎→肥肉切丁→加入輔料及腌制劑→攪拌均勻→低溫腌制→接種混合菌發(fā)酵劑→灌腸→恒溫發(fā)酵24 h→干燥成熟。

基本配方：新鮮羊瘦肉(去筋)與豬背膘質(zhì)量比為8∶2，蔗糖1%，葡萄糖0.6%，食鹽3%，白胡椒0.1%，姜粉0.2%，蒜粉0.2%，白酒1.2%，冰水10%，亞硝酸鈉0.010%，D-異抗壞血酸鈉0.075%(均為在羊肉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.3.2 菌株之間的拮抗作用

用接種環(huán)挑取單菌落，在固體培養(yǎng)基上劃一條直線，37 ℃培養(yǎng)24 h后，再用接種環(huán)挑取另一菌株，沿菌落邊緣從垂直方向接種，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察是否存在抑菌區(qū)[10]。

1.3.3 單因素實驗

探究接種量對發(fā)酵羊肉香腸品質(zhì)的影響時，將接種量作為變量，控制植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌1∶1、發(fā)酵溫度30 ℃、相對濕度90%、發(fā)酵時間24 h不變，5組發(fā)酵香腸分別接種104，105，106，107，108CFU/g，測定24 h后發(fā)酵香腸的pH，待發(fā)酵香腸成熟后進行感官評分。

探究發(fā)酵溫度對發(fā)酵羊肉香腸品質(zhì)的影響時，將發(fā)酵溫度作為變量，控制植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌1∶1、接種量107CFU/g、相對濕度90%、發(fā)酵時間24 h不變，5組發(fā)酵香腸分別于15，20，25，30，35 ℃下發(fā)酵，測定24 h后發(fā)酵香腸的pH，待發(fā)酵香腸成熟后進行感官評分。

探究菌種配比對發(fā)酵羊肉香腸品質(zhì)的影響時，將菌種配比作為變量，控制接種量107CFU/g、發(fā)酵溫度30 ℃、相對濕度90%、發(fā)酵時間24 h不變，5組發(fā)酵香腸分別接種植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌比例為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的混合菌，測定24 h后發(fā)酵香腸的pH，待發(fā)酵香腸成熟后進行感官評分。

1.3.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素實驗結(jié)果，用Design-Expert 8.0.6軟件，選取感官評分為響應(yīng)值，進行三因素三水平共17個實驗點的中心組合實驗[11]，對混合菌發(fā)酵羊肉香腸工藝進行優(yōu)化，對響應(yīng)曲面得出的最佳配比進行感官評分，各因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素和水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.5 發(fā)酵香腸pH的測定

參照GB 5009.237-2016《食品pH值的測定》規(guī)定的方法，將香腸視為非均質(zhì)化試樣，使用校準(zhǔn)后的pH計，貼于已用小刀打孔的香腸中，讀數(shù)穩(wěn)定后，可直接讀出pH，同一點重復(fù)測定3次，讀數(shù)精確至0.01[12]。發(fā)酵香腸pH必須在48 h內(nèi)降低至5.3才能保證香腸的安全性[13]。

1.3.6 感官評分體系

選擇來自不同省份的16名(8男8女)經(jīng)過食品感官鑒評專業(yè)培訓(xùn)的學(xué)生組成感官鑒評小組，要求從色澤、組織結(jié)構(gòu)、膻味、口感4個方面進行評分，每位同學(xué)必須對所有樣品進行評分，評分過程中不允許交流。每次評分之前，需用溫水漱口，10 min后進行下一次評定，減少連續(xù)品嘗帶來的不利影響，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評分體系Table 2 The sensory scoring system

1.3.7 發(fā)酵香腸品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)

發(fā)酵羊肉香腸隸屬于中式香腸，必須符合GB/T 23493-2009[14]《中式香腸》標(biāo)準(zhǔn)，其他肉制品標(biāo)準(zhǔn)也必須符合，見表3。

表3 中式香腸理化標(biāo)準(zhǔn)Table 3 The physicochemical indexes of Chinese sausage

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對香腸pH、感官評分的影響

由圖1可知，發(fā)酵24 h后，20 ℃和25 ℃的兩組香腸pH下降至5.89，5.42，均高于5.3，不符合標(biāo)準(zhǔn)；30 ℃和35 ℃的兩組香腸pH最終降至4.88，4.46，均低于5.30，綜合感官評分來看，35 ℃組由于過酸，感官評分低于30 ℃組，所以發(fā)酵溫度為30 ℃時香腸整體品質(zhì)最佳。

圖1 發(fā)酵溫度對香腸pH、感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the pH values and sensory scores of sausage

2.1.2 接種量對香腸pH、感官評分的影響

由圖2可知，發(fā)酵24 h后，接種量為104,105CFU/g的發(fā)酵香腸pH降至5.65,5.48，高于5.30，不符合標(biāo)準(zhǔn)，接種106,107,108CFU/g的發(fā)酵香腸pH最終下降到5.16，4.84，4.28，均低于5.3，考慮到香腸成熟過程中，香腸pH會出現(xiàn)一定程度的回升[15]，不能很好地確保安全，故接種量為106CFU/g的香腸不予考慮。接種量為108CFU/g的香腸pH下降得太低，酸味過于強烈。結(jié)合感官評分來看，接種量為107CFU/g的發(fā)酵香腸評分最高，所以接種量為107CFU/g比較合適。

圖2 接種量對香腸pH、感官評分的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the pH values and sensory scores of sausage

2.1.3 菌種配比對香腸pH、感官評分的影響

由圖3可知，5組香腸發(fā)酵24 h后pH均低于5.3，符合標(biāo)準(zhǔn)，植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌為3∶1時pH最低，主要是由于該組乳酸菌比例最高。pH過低時，發(fā)酵香腸過酸，消費者很難接受，綜合感官評分來看，復(fù)配比為1∶1時最合適。

圖3 菌種配比對香腸pH、感官評分的影響Fig.3 Effect of strain ratios on the pH values and sensory scores of sausage

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果及方差分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Response surface experiment design and results

利用Design-Expert 8.0.6進行回歸擬合得到接種量、復(fù)配比、發(fā)酵溫度對香腸感官評分的二次多項式回歸方程為：Y=+84.45-1.61A+1.16B+0.70C+0.34AB-0.75AC+0.093BC-8.84A2-3.05B2-3.40C2。R2=0.9656，校正系數(shù)RAdj2=0.9213，表明響應(yīng)值變化的96.56%能用該模型解釋。對該模型進行方差分析，結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 5 Response surface variance analysis results

由表5方差分析結(jié)果可知，該模型極顯著，失擬項不顯著，A2、B2、C2對模型的影響極顯著，影響感官評分的各因素順序為：接種量>復(fù)配比>發(fā)酵溫度。

2.2.2 因素間的交互作用分析

由圖4～圖6可知，3種因素兩兩之間的交互作用不明顯，綜上所述，植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌1.39∶1、接種量6.69 1g CFU/g、發(fā)酵溫度30.58 ℃時制得的發(fā)酵香腸最佳，此時感官評分為85.43。

圖4 復(fù)配比和接種量對發(fā)酵羊肉香腸感官評分交互作用的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface of the interaction of mixed ratio and inoculation amount on sensory score of fermented mutton sausage

圖5 接種量和發(fā)酵溫度對發(fā)酵羊肉香腸感官評分交互作用的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface of the interaction between inoculation amount and fermentation temperature on sensory score of fermented mutton sausage

圖6 復(fù)配比和發(fā)酵溫度對發(fā)酵羊肉香腸感官評分交互作用的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface of the interaction of mixed ratio and fermentation temperature on sensory score of fermented mutton sausage

2.2.3 驗證實驗

為了滿足實際生產(chǎn)的需求，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為：植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌1∶1，接種量107CFU/g，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間24 h。進行3次驗證實驗，發(fā)酵香腸的感官評分平均值為85.15，與模型理論值相近，說明該工藝條件即最佳工藝條件。

2.3 發(fā)酵羊肉香腸質(zhì)量分析結(jié)果

對采用最佳工藝制備的香腸與未添加混合菌種的普通羊肉香腸對照進行質(zhì)量分析，見表6。

表6 質(zhì)量分析Table 6 The analysis of quality

發(fā)酵香腸中的各項指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵組的水分含量明顯低于對照組，說明添加混合菌有助于羊肉香腸水分含量的降低，較低的水分含量可以抑制微生物生長，提高香腸的安全性。添加發(fā)酵劑的香腸中，微生物細(xì)胞內(nèi)含有的蛋白酶可能使蛋白質(zhì)分解，蛋白質(zhì)含量低于未添加混合菌的香腸。由于植物乳桿菌利用葡萄糖產(chǎn)酸，發(fā)酵組的總糖含量低于普通香腸。發(fā)酵香腸的過氧化值和亞硝酸鹽含量低于普通香腸，混合菌能夠抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生，在一定程度上提高了發(fā)酵香腸的安全性，發(fā)酵香腸的安全性和貯藏性更好。

3 結(jié)論

以感官評分、pH值作為評價香腸的理化指標(biāo)，確定香腸的最佳發(fā)酵時間，通過單因素實驗，確定菌種配比、發(fā)酵溫度、接種量最佳配比的范圍，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以感官評分為響應(yīng)值，進行三因素三水平的響應(yīng)面分析，當(dāng)接種量為107CFU/g，發(fā)酵溫度為30 ℃，植物乳桿菌∶木糖葡萄球菌配比為1∶1時，發(fā)酵羊肉香腸的品質(zhì)最佳。

以中式香腸國家標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，對貯藏30 d的發(fā)酵羊肉香腸進行產(chǎn)品質(zhì)量分析，添加混合菌的發(fā)酵羊肉香腸的水分含量、總糖含量、氯化物含量、蛋白質(zhì)含量和脂肪含量均低于未添加發(fā)酵劑的香腸，混合菌發(fā)酵香腸更健康、安全，符合國家特級中式香腸的要求；添加混合菌的發(fā)酵羊肉香腸的過氧化值和亞硝酸鹽含量低于未添加發(fā)酵劑的香腸，遠低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的殘留量，說明混合菌發(fā)酵香腸能夠延長貨架期，提高產(chǎn)品質(zhì)量。