焦天偉，粟暉*，黃金，梁宗杭，黃曉程，姚志湘,2

(1.廣西科技大學 生物與化學工程學院 廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；2.廣西蔗糖產業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004)

果葡糖漿又稱高果糖漿或異構糖漿，被廣泛應用于甜味劑[1]，其主要成分包括果糖、葡萄糖和少量的低聚糖，其中提高甜度的主要成分是果糖，按果糖占干物質的比重不同，一般將果葡糖漿分為F42、F55和F90[2]。目前果葡糖漿中果糖定量分析方法主要有高效液相色譜法[3]、分光光度法[4]和核磁法[5]等。歐少沛等利用高效液相色譜法測定果葡糖漿中果糖與葡萄糖含量，并采用外標法和面積歸一法進行比對分析，結果表明，高效液相色譜配合面積歸一法可以快速、準確定量果葡糖漿中的果糖及葡萄糖。徐慧詮等采用間苯二酚-分光光度法測定葡萄糖異構糖漿中果糖的含量，結果表明，異構糖漿經過顯色反應后在473 nm處的吸光度與果糖含量線性關系良好，定量準確性高。Yan等利用核磁共振波譜法定量分析蜜糖漿中的果糖、葡萄糖及蔗糖，結果表明，采用鄰苯二甲酸氫鉀作為內標物，可以準確測定蜜糖漿中的果糖、葡萄糖及麥芽糖。但是，以上方法普遍存在分析成本高、效率低和前處理復雜等問題，難以滿足快速分析的要求。因此，建立一種快速、準確可以應用到果葡糖漿體系的果糖測定方法具有重要的現(xiàn)實意義。

拉曼光譜技術以其信息豐富、水的影響小、無需樣品預處理等獨特優(yōu)點，近些年來在藥物分析[6]、食品[7]和化工[8]等領域得到迅猛發(fā)展。果糖和葡萄糖互為同分異構體，拉曼特征波段主要集中在300～1500 cm-1和2700～3400 cm-1。譜圖中波峰重疊和偏移現(xiàn)象嚴重，難以單純依靠光譜響應強度實現(xiàn)果糖的定量分析。Ilaxlan等[9]采用拉曼光譜結合偏最小二乘(partial least squares， PLS)的方法分析了商業(yè)飲料中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量，結果表明，果糖的拉曼響應良好，利用拉曼光譜結合化學計量學的方法定量分析果糖是可行的。但是，PLS較為依賴光譜的特征響應，激發(fā)光的穩(wěn)定性、聚焦、固體顆粒的散射、積分時間的改變和光程差的變動等乘性干擾無法避免。乘性干擾在漫反射近紅外(DRS)、拉曼光譜等光學儀器測量時普遍存在，而且若應用于糖液體系，折射率的波動會成倍放大分析誤差，影響分析模型的穩(wěn)定性。Wang等[10]采用DRS測定肉蓯蓉中果糖、葡萄糖等7種主要成分，分別進行標準正態(tài)變換(standard normal variate transformation， SNV)和多元散射校正(multiplicative scatter correction， MSC)消除乘性干擾后，再利用PLS建模，模型的決定系數(shù)均略大于0.94，結果表明，SNV和MSC處理后的數(shù)據(jù)結果相似。SNV主要消除散射和光程變化對漫反射光譜的影響，但是該方法假設所有變量的標準偏差一致，當體系組分性質變化較大時，誤差會變大。MSC則必須建立“標準光譜”，即含量與強度呈理想線性關系，建立“標準光譜”的質量直接影響誤差校正結果，但在實際中，這種“標準光譜”是難以獲取的。綜上，糖液體系折射率波動導致放大的乘性干擾問題并沒有得到很好的解決。

姚志湘等[11]發(fā)現(xiàn)若將光譜視為向量，體系總體誤差分布變化則與被關注向量與其他向量所構成的子空間向量夾角有關，且該向量和其他向量子空間的關系如果確定，則體系總體誤差呈正態(tài)分布。以此為理論基礎，提出通過計算向量空間角消除乘性干擾的方法[12]，并進一步提出一種基于子空間角度轉換的近似線性定量方法，實現(xiàn)采用中紅外光譜結合向量夾角直接定量三氯蔗糖合成過程的組分含量測定[13]，并將該方法推廣應用于蔗糖-6-乙酸酯的定量分析[14]。該方法的特點是克服乘性干擾；不依賴光譜特征響應；光譜特征信息保留度高；高效、便捷、穩(wěn)定性好，為快速準確的定量分析提供了參考。本文采用子空間角度轉換方法和拉曼光譜結合，建立果葡糖漿中果糖含量的快速分析方法，以間苯二酚-分光光度法作為比對，并檢測該方法精密度。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

ExR610拉曼光譜儀 西派特(北京)有限公司；AR124CN電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；S-3100紫外可見分光光度計 韓國SCINCO公司。

果糖(生化試劑 BR)：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖(食品級)：廣東光華科技股份有限公司；間苯二酚(分析純)：上海凌峰化學試劑有限公司；鹽酸(36.0%～38.0%，分析純)：西隴科學股份有限公司；果葡糖漿：市售。

1.2 子空間角度轉換結合拉曼光譜分析模型建立

1.2.1 建模樣本的配制

取5 mL的F42果葡糖漿(UV，果糖質量分數(shù)為29.23%)為基液，按一定配比添加果糖或50%質量分數(shù)的葡萄糖溶液，配制一系列果葡糖漿樣本，果糖質量分數(shù)在1%～60%的范圍內，每兩個樣本間隔3%，共配制21個樣本，編號為S1～S21。

1.2.2 樣本拉曼光譜采集

將樣本S1～S21分別置于測量瓶中，采集拉曼數(shù)據(jù)，每個樣本采集3次取平均值，采集參數(shù)：積分時間9 s，平滑點數(shù)0，中心波長532 nm，功率等級9，拉曼位移范圍為300～3500 cm-1。

1.2.3 建模步驟

分析模型建立的步驟見圖1。

圖1 分析模型建立流程圖Fig.1 The flow chart of analysis mode

1.3 市售果葡糖漿中果糖含量分析

取F42、F55、F60 3種不同品牌不同批次的果葡糖漿樣品，采集各樣本拉曼光譜。數(shù)據(jù)處理參照1.2.3，分析各樣本中果糖含量，此過程平行5次，計算相對標準偏差，檢驗方法精密度。

1.4 間苯二酚-分光光度法分析果葡糖漿中的果糖含量

參照文獻[4]，配制果糖質量分數(shù)呈梯度分布在0.0158‰～0.1183‰之間的8份樣本，采集其可見光譜，建立果糖含量-吸光度標準曲線，用于分析果葡糖漿樣本。

2 結果與討論

2.1 間苯二酚分光光度法建立果糖含量-吸光度標準曲線

選取各樣本在波長485 nm處對應的吸光度值，建立果糖含量-吸光度標準曲線。果糖含量在0.0158‰～0.1183‰范圍內，線性方程為y=102.56x+0.0795，相關系數(shù)r=0.9955。

2.2 基于拉曼光譜結合子空間角度轉換的快速分析模型建立

2.2.1 系列樣本拉曼光譜

果葡糖漿、建模樣本、葡萄糖及果糖對照品的系列樣本拉曼特征峰集中分布在300～1500 cm-1與2500～3500 cm-1兩部分。葡萄糖和果糖在2500～3500 cm-1波段皆有兩個明顯特征峰，但重疊與覆蓋現(xiàn)象嚴重，果葡糖漿等兩糖混合樣本易出現(xiàn)波峰偏移問題，所以不考慮將其作特征區(qū)間。300～1500 cm-1波段特征響應顯著。取待測樣本及對照品譜圖的300～2000 cm-1波段，見圖2。

圖2 F60果葡糖漿、葡萄糖對照品、果糖對照品與30%果糖質量分數(shù)的建模樣本的譜圖Fig.2 Raman spectrogram of F60 HFCS, glucose reference sample, fructose reference sample and modeling sample with 30% fructose

2.2.2 果糖質量分數(shù)與夾角值EE的關聯(lián)方程建立

建模樣本與參比樣本的選?。喊凑臻g隔4%選取建模樣本，使樣本果糖質量分數(shù)均勻分布在1%～60%的范圍內。選取S1、S2、S4、S5、S7、S8、S10、S11、S13、S14、S16、S17、S19、S20作為建模樣本。參比樣本應具有唯一性并且其光譜與背景光譜差異性最大。果糖為測量組分，背景光譜中不含有果糖特征峰，即果糖含量最大的樣本譜圖與背景光譜差異性最大，樣本S21果糖質量分數(shù)最大，為60%，且無相同果糖含量的樣本存在，具有唯一性，故選擇S21為參比樣本。

光譜平滑降噪：樣本中的熒光是導致基線漂移的主要原因。針對熒光干擾，參照熒光褪色差分法[17](FBDA)校正基線。采用一階濾波求導對樣本原始光譜進行降噪處理。果葡糖漿的拉曼光譜經降噪與基線校正處理前后見圖3。

圖3 果葡糖漿基線校正前后的拉曼光譜Fig.3 Raman spectra of HFCS before and after baseline correction

由圖3可知，經過降噪和基線校正處理前的譜圖，噪聲大且基線漂移嚴重，校正后的譜圖信噪比顯著提高，且能完整的保留原始光譜的形狀。

關聯(lián)方程建立：分別取二階、一階濾波求導與零階導，移動窗口寬度取波段波數(shù)的1/38與1/19，取最大果糖含量樣本S21作為參比樣本，建立移動窗口，窗口從最小波數(shù)點向波數(shù)點增大方向移動，計算樣本光譜與參比光譜的夾角值EE，取果糖質量分數(shù)為橫坐標，夾角值EE為縱坐標，采用線性擬合方法，建立相應關聯(lián)方程，見圖4。對比各方程決定系數(shù)，確定最優(yōu)方案。

圖4 果糖含量與角度值的關聯(lián)方程Fig.4 The correlation equations between fructose content and angle value

圖4(a)、(b)使用未經濾波求導的譜圖計算所得，相較采用濾波求導的(c)、(d)、(e)、(f)離散程度大，說明譜圖經過相應濾波降噪可提高EE與果糖含量的線性關系。經二階濾波求導降噪后，計算得方程(e)、(f)，一階濾波得(c)、(d)。經計算得到各方程相關系數(shù)(R)。方程(c)、(d)相關系數(shù)R均大于0.99，擇優(yōu)錄取，選擇方程(c)建立果糖含量分析方法。

2.2.3 方法驗證

取S3、S6、S9、S12、S15、S18樣本，依照2.2.2步驟計算得到EE值，代入建立的關聯(lián)方程，預測值與誤差分析結果見表1。絕對誤差在0.07%～2.46%之間，相對誤差在0.20%～5.98%之間，結果表明，模型精度高，測定結果準確。

表1 驗證集樣本的EE值與誤差分析結果Table 1 The EE values and error analysis results of validation set samples

2.3 市售果葡糖漿果糖含量分析

同2.2取S21為參比樣本，計算得到果葡糖漿樣品與參比樣本的夾角值EE，代入2.2.2建立的關聯(lián)方程中，計算得到各樣本中果糖含量，并與間苯二酚-分光光度法測定值作比對，結果見表2。

表2 市售果葡糖漿果糖含量預測值與誤差分析結果Table 2 The predictive values and error analysis results of fructose content in commercial HFCS

由表2可知，拉曼光譜結合子空間角度轉換方法預測值與間苯二酚-分光光度法預測值絕對誤差在0.64%～2.31%之間，相對誤差在1.89%～6.77%之間。平行分析各市售果葡糖漿5次，計算相對標準偏差(RSD)，結果見表3。

表3 精密度分析結果Table 3 The precision analysis results

由表3可知，各樣本的RSD在0.34%～2.32%，說明所建立的拉曼光譜結合子空間角度轉換的方法精密度高、準確性好，適用于無損、快速分析果葡糖漿中果糖含量。

3 結論

本文采用拉曼光譜采集樣品信息，以子空間角度轉換的化學計量學方法消除乘性干擾，建立了市售果葡糖漿的拉曼光譜快速分析方法。果糖含量-夾角值關聯(lián)模型相關系數(shù)R為0.9991，相對誤差在1.89%～6.77%之間，對市售果葡糖漿的分析相對標準偏差為0.34%～2.32%。本方法分析效率高、操作簡單、穩(wěn)定性好，可用于果葡糖漿生產過程中產品的品質監(jiān)控和商品的市場監(jiān)督。