陳玉青 王 恩 施海璐 蘭公劍

(南京正大天晴制藥有限公司，江蘇南京，210046)

基因毒性雜質(zhì)(genotoxic impurity GTI)是指能直接或間接損害DNA，導致基因突變或具有致癌傾向的物質(zhì)。其特點是在較低濃度時即可造成人體遺傳物質(zhì)的損傷，具有致突變性和致癌性，嚴重威脅到人類的健康[1]。隨著研究的深入，不斷出現(xiàn)已上市藥品中痕量的基因毒性雜質(zhì)殘留而發(fā)生醫(yī)療事故的案例，給藥廠造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]，更多的藥企在新藥研發(fā)過程中就開始關(guān)注基因毒性雜質(zhì)的控制和檢測。

5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮為重要的合成起始原料，可用于替尼類抗腫瘤藥物的合成，而5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮的合成過程中使用了鹽酸羥胺，故可能會引入到原料及其制劑中，鹽酸羥胺具有遺傳毒性[3]，需要進行控制。目前無文獻報道基因毒性雜質(zhì)鹽酸羥胺的測定方法，本文根據(jù)鹽酸羥胺的結(jié)構(gòu)特點，開發(fā)一種HPLC方法，可以準確方便地檢測鹽酸羥胺的含量。參考ICH指導原則[4]，查詢到羥胺PDE值為2μg·day-1，根據(jù)該制劑說明書每日最大劑量為117mg，可計算出鹽酸羥胺的限度為0.0036%，本文采用將鹽酸羥胺衍生化成具有紫外吸收的苯甲醛肟后再進行檢測，反應方程式見圖1。

圖1 衍生化反應方程式

1 儀器與試藥

1.1 儀器

表1 儀器

1.2 試劑與試藥

見表2。

表2 試劑與試藥

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.2 溶液配制

2.2.1 衍生化試劑貯備液

精密量取苯甲醛2mL，置于100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 衍生化試劑溶液

精密量取衍生化試劑貯備液1mL，置于20mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 對照品貯備液

取鹽酸羥胺對照品5mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置于50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 對照品溶液

精密量取對照品貯備液2mL，置于10mL量瓶中，精密加入衍生化試劑溶液1mL，用水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置反應1h。

問題5-2 在等差數(shù)列{an}中，Sn為其前n項和，則數(shù)列S3,S6-S3,S9-S6,…是等差數(shù)列.試證明上述結(jié)論，并通過類比，找出等比數(shù)列的相關(guān)結(jié)論.

2.2.5 供試品溶液

取本品0.1g，置于10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置于10mL量瓶中，精密加入衍生化試劑溶液1mL，用水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置反應1h。

2.2.6 加標供試品溶液

取本品0.1g，置于10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置于10mL量瓶中，依次精密加入對照品貯備液2mL、衍生化試劑溶液1mL，用水稀釋至刻度，搖勻，室溫放置反應1h。

2.3 專屬性

分別精密量取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，空白溶劑不干擾鹽酸羥胺測定，供試品溶液中鹽酸羥胺未檢出，方法專屬性良好，結(jié)果見圖2。

圖2 專屬性試驗圖譜

2.4 檢測下限與定量下限

取對照品貯備液，逐級稀釋，按信噪比不小于10時作為定量下限溶液。鹽酸羥胺的定量下限為0.03μg·mL-1(相當于限度濃度16.6%)，連續(xù)進樣6次，其峰面積RSD為7.5%，表明定量下限精密度良好。

取對照品貯備液，逐級稀釋，按信噪比不小于3時作為檢測下限溶液，鹽酸羥胺的檢測下限為0.01μg·mL-1(相當于限度濃度5.5%)，表明本方法靈敏度良好，滿足檢測要求。

2.5 線性范圍考察

精密移取2.2項下對照品貯備液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL，分別置于10mL量瓶中，再分別精密加入苯甲醛溶液1mL，用水稀釋至刻度，搖勻，放置1h，作為系列濃度對照品溶液。精密量取上述溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。鹽酸羥胺線性方程為：y=91894x+531.53；相關(guān)系數(shù)r=0.9991，結(jié)果表明鹽酸羥胺濃度在0.05～0.44μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 進樣精密度

精密量取對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖，鹽酸羥胺峰面積的RSD為0.2%，結(jié)果表明進樣精密度良好。

2.7 重復性與準確度

準確度是向供試品溶液中添加已知量的雜質(zhì)對照品，并設(shè)計成相當于雜質(zhì)限度50%、100%、150%水平的3種濃度，每種濃度制備3份，采用9份樣品進行評價，以測得的雜質(zhì)含量與加入量的比值表示回收率，同時考察方法的重復性，不同濃度水平的加標供試品溶液中鹽酸羥胺回收率均在90%—110%之間，平均回收率為99.9%，RSD為0.9%，結(jié)果表明方法準確度和重復性良好。

2.8 耐用性

適當調(diào)整流動相中水相pH值2.3±0.1、柱溫(40℃±5℃)、不同批次色譜柱、流速1.0±0.1 mL·min-1，考察100%加標供試品溶液中鹽酸羥胺的含量，結(jié)果表明色譜條件發(fā)生微小變化時對鹽酸羥胺的檢測無影響，方法耐用性良好。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

鹽酸羥胺本身無紫外吸收，在一定條件下與苯甲醛反應生成具有紫外吸收的苯甲醛肟用于檢測，測定對照品溶液最大吸收波長為253nm，因此選擇254nm作為檢測波長。

3.2 衍生化時間的選擇

衍生化反應在室溫下即可進行，對照品溶液和加標供試品溶液在加入衍生化試劑后放置時間越長，反應越完全，主峰峰面積越大，放置1h時峰面積達最大值，繼續(xù)放置峰面積保持穩(wěn)定，說明1h為衍生化反應的最佳時間，因此選擇室溫放置1h進行衍生化反應。

4 小結(jié)

試驗表明，采用衍生化后再選擇HPLC法檢測藥物中的鹽酸羥胺含量，方法專屬性強、準確度高、靈敏度滿足分析要求，實際操作過程簡單，可以有效地檢測5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮中基因毒性雜質(zhì)鹽酸羥胺的殘留。