劉月，王玉巧，楊如萍，劉蔚，陸濛，周道年，明章銀

八寶眼膏是一種具有清熱退赤，止癢去翳等功效的中藥軟膏無(wú)菌制劑，藥物組成為煅爐甘石、琥珀、麝香、牛黃、珍珠、冰片、硼砂、硵砂。臨床上主要用于風(fēng)火上擾所致的眼睛紅腫痛癢、流淚、眼瞼紅爛等癥狀[1]。暴露性角膜炎是指角膜失去眼瞼的保護(hù)而暴露于空氣中，引起角膜干燥、上皮脫落，從而繼發(fā)感染的角膜炎癥[2]。本實(shí)驗(yàn)主要研究八寶眼膏對(duì)暴露性角膜炎大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，8 周齡，雄性，購(gòu)買(mǎi)自武漢市疾病控制中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018）。自由飲水，飲食，自然光照。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

八寶眼膏（馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：Z42021455）；維生素A 棕櫚酸酯眼用凝膠（沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20073905）；4%多聚甲醛固定液（武漢谷歌生物科技有限公司）；檸檬酸（PH6.0）抗原修復(fù)液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；組化試劑盒DAB 顯色液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Muc-5ac 多克隆抗體（Bioswamp）；山羊抗兔IgG HRP（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔二抗，Biosharp）。

1.3 動(dòng)物分組及給藥方法

將32 只SD 大鼠隨機(jī)分成4 組，正常組、模型組、治療組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組8 只（8 只眼）大鼠。

暴露性角膜炎模型：將大鼠麻醉后固定，用2-0/T縫合線(xiàn)將大鼠上下眼瞼分別縫合固定在眼眶周?chē)鄳?yīng)的皮膚上，使其不能正常瞬目[3]。制造模型6 d 后，開(kāi)始給予不同處理，每日9:00 和17:00 各給藥1 次，連續(xù)給藥3 d。

給藥方法：（1）正常組，不給予任何處理；（2）模型組，給予對(duì)應(yīng)空白基質(zhì)（凡士林）涂眼，每日2 次，每次0.15g；（3）治療組，給予八寶眼膏涂眼，每日2 次，每次0.15g；（4）陽(yáng)性對(duì)照組，給予維生素A 棕櫚酸酯眼用凝膠涂眼，每日2 次，每次0.15 g。后3 組在連續(xù)給藥3 d 后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)

1.4.1 眼表變化情況 所有檢查都在同一時(shí)間、地點(diǎn)，光照、溫度等其他條件均相同，并且由同一人完成，保證各組實(shí)驗(yàn)條件一致。

1.4.2 Schirmer I 試驗(yàn)（schirmer I test，SⅠt）[4]采用購(gòu)買(mǎi)的1 mm 寬淚液試紙條進(jìn)行試驗(yàn)，用鑷子將該試紙條置于大鼠下眼瞼外側(cè)穹窿部，紙條接觸淚液時(shí)，顏色會(huì)成黃色，經(jīng)過(guò)5 min 后測(cè)量從彎折處至變色終端的長(zhǎng)度。

1.4.3 淚膜破裂時(shí)間（tear break-up time，BUT）[5]將大鼠麻醉后，放置于裂隙燈下，然后將大鼠的眼睛對(duì)準(zhǔn)鏡頭，手動(dòng)讓大鼠瞬目1 次，然后拉開(kāi)大鼠的上下眼瞼，開(kāi)始計(jì)時(shí)，然后觀(guān)察大鼠眼角膜的淚膜，出現(xiàn)第1 個(gè)破裂點(diǎn)（1 個(gè)黑點(diǎn)或1 道裂痕）時(shí)停止計(jì)時(shí)，平均每只眼睛測(cè)3 次，記錄平均值。

1.4.4 角結(jié)膜熒光素染色（fluorescein vital staining，F(xiàn)L）[6]用移液器取2%熒光素鈉注射液30 μl 至大鼠下眼瞼結(jié)膜囊內(nèi)，手動(dòng)讓大鼠瞬目1 次，使得熒光素鈉均勻的分布于大鼠的眼睛表面，在鈷藍(lán)色彌散光下檢查大鼠眼表的染色情況，并拍照記錄。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，將角結(jié)膜分成角膜、上方球結(jié)膜、下方球結(jié)膜、顳側(cè)結(jié)膜4 個(gè)部分，每個(gè)部分根據(jù)染色程度和面積然后再分為4 個(gè)等級(jí)，分值標(biāo)準(zhǔn)如下（表1）。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：（1）陰性，總分值＜3 分；（2）弱陽(yáng)性，3 分≤總分值≤6 分；（3）陽(yáng)性，6 分≤總分值≤9 分；（4）強(qiáng)陽(yáng)性，總分值≥9 分。

表1 大鼠角結(jié)膜熒光素鈉染色分值標(biāo)準(zhǔn)

1.4.5 組織病理學(xué) 將大鼠頸椎脫臼處死后，取眼球，于4%多聚甲醛中固定，脫水包埋，進(jìn)行常規(guī)HE 染色，在光鏡下觀(guān)察，并比較各組大鼠角膜結(jié)構(gòu)的變化。

1.4.6 Muc-5ac 表達(dá) 按上述方法取結(jié)膜組織，4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，水化，抗原熱修復(fù)，室溫封閉30 min，一抗（工作濃度為1:100），4℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗后加入二抗（工作濃度1:400），室溫孵育50 min。之后DAB 顯色，復(fù)染細(xì)胞核，然后脫水封片。以檢測(cè)結(jié)膜杯狀細(xì)胞胞漿中Muc-5ac 的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0 軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用方差分析中LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼表情況和熒光素鈉染色情況

造模6 d 后，正常組大鼠眼角膜、結(jié)膜潤(rùn)澤透亮，熒光素染色未著色；模型組大鼠眼角膜渾濁、干燥無(wú)光澤，角膜、結(jié)膜上皮片狀熒光素著色（圖1）。熒光素鈉染色積分以及評(píng)價(jià)結(jié)果比較可以觀(guān)察到正常組大鼠的角膜、上方球結(jié)膜、下方球結(jié)膜、顳側(cè)結(jié)膜均沒(méi)有熒光素著色，染色結(jié)果為陰性（0 分）；模型組大鼠角膜呈密集點(diǎn)狀染色（2 分），顳側(cè)結(jié)膜和上下球結(jié)膜為絲狀、片狀或塊狀染色（各3 分），染色結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性（共11 分）。

圖1 各組大鼠眼表情況及熒光素染色情況。1A 正常組;1B 模型組；1C 治療組，用藥3 d 后；1D 陽(yáng)性對(duì)照組，用藥3 d 后

給藥后角膜熒光染色：正常組、陽(yáng)性對(duì)照組和治療組大鼠的角膜、上方球結(jié)膜、下方球結(jié)膜、顳側(cè)結(jié)膜均沒(méi)有熒光素著色，染色結(jié)果為陰性（0 分）。模型組大鼠角膜有密集點(diǎn)狀染色，顳側(cè)結(jié)膜和球結(jié)膜為絲狀、片狀或塊狀染色，染色結(jié)果顯示為強(qiáng)陽(yáng)性（11 分）。

2.2 SⅠt

4 組間SⅠt（單位：mm/5 min）比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.930，P=0.001）。兩兩比較，正常組（11.75±1.64）與模型組（7.88±1.29）相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.686,P=0.000）；陽(yáng)性對(duì)照組（11.5±1.66）、治療組（11.5±1.80）與模型組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t陽(yáng)性=4.246，t治療=4.393；均P=0.001）。而陽(yáng)性對(duì)照組與治療組及正常組之間比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 BUT

4 組間BUT（單位：s）比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=80.941，P=0.000）。兩兩比較，正常組BUT（25.36±0.627）較模型組（10.78±0.949）高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.267,P=0.000）；陽(yáng)性對(duì)照組（25.07±0.763）、治療組（24.52±0.719）與模型組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t陽(yáng)性=12.507，t治療=14.877；均P=0.000）。而陽(yáng)性對(duì)照組與治療組及正常組之間比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 組織病理學(xué)

正常組角膜HE 染色，各層清晰可見(jiàn)，表皮光滑完整，沒(méi)有脫落，沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)質(zhì)層細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)完整。模型組上皮層紊亂，排列不規(guī)則，實(shí)質(zhì)層形態(tài)不規(guī)則并有部分丟失。治療組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型組相比，其角膜組織結(jié)構(gòu)的完整性都有所改善，上皮層細(xì)胞排列較為緊密，實(shí)質(zhì)層細(xì)胞的形態(tài)也較為規(guī)則。治療組實(shí)質(zhì)層細(xì)胞排列更為緊密，結(jié)構(gòu)也較為完整（圖2）。

圖2 用藥3 d 后各組角膜組織切片HE 染色（×200）。2A 正常組；2B 模型組；2C 治療組；2D 陽(yáng)性對(duì)照組

2.5 Muc-5ac 表達(dá)

Muc-5ac 陽(yáng)性表達(dá)在眼結(jié)膜組織杯狀細(xì)胞的胞漿，為棕黃色顆粒狀。Muc-5ac 陽(yáng)性著色部位顏色越深，代表治療效果愈好。正常組、治療組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型組相比，Muc-5ac 陽(yáng)性著色部位均呈現(xiàn)較深顏色（圖3）。

圖3 用藥3d 后各組結(jié)膜Muc-5ac 單克隆抗體免疫組化染色（×100）。3A 正常組；3B 模型組；3C 治療組；3D 陽(yáng)性對(duì)照組

3 討論

目前暴露性角膜炎臨床缺乏特效藥，一般主要采用紅霉素眼膏、小牛血去蛋白提取物，妥布霉素眼膏，維生素A 棕櫚酸鈉等眼藥對(duì)癥支持治療[7-8]。有文獻(xiàn)[9]報(bào)道，柴芍大發(fā)散有一定作用，但僅應(yīng)用于角膜潰瘍,對(duì)于治療暴露性角膜炎療效欠佳。中醫(yī)通常采用中藥熏蒸，緩解干眼患者的癥狀。中藥熏蒸操作方便，不經(jīng)過(guò)體內(nèi)腸肝循環(huán)代謝，毒副作用少，對(duì)眼部無(wú)不良刺激反應(yīng)[10]。

八寶眼膏方中牛黃苦甘涼，有清肝解毒，化瘀開(kāi)竅之功，對(duì)肝火上擾目竅所致眼疾皆屬所宜，為君藥。麝香辛香透達(dá)，能開(kāi)竅避穢，解毒散瘀，以退目翳，為臣藥。爐甘石、珍珠、琥珀、硼砂收濕斂瘡，退赤去翳；硇砂消積軟堅(jiān)，破瘀散結(jié)，去惡瘡目翳，共為佐藥。冰片通諸竅，散郁火，去翳明目，故為使藥。諸藥合用，共奏清熱退赤，止癢去翳之功。馬應(yīng)龍八寶眼霜可以通過(guò)抗炎、降低血流量的作用來(lái)改善黑眼圈[11]。推測(cè)八寶眼膏的某些成分有抗炎作用，從而修復(fù)角膜和結(jié)膜組織結(jié)構(gòu)的損傷，使得結(jié)膜組織中杯狀細(xì)胞的數(shù)目增加。杯狀細(xì)胞分泌的粘蛋白能滋潤(rùn)眼表，穩(wěn)定淚膜，從而改善暴露性角膜炎引發(fā)的一系列癥狀。

本研究發(fā)現(xiàn)八寶眼膏可以增加暴露性角膜炎模型大鼠的淚液分泌量，降低了角膜熒光素鈉染色強(qiáng)度，延長(zhǎng)淚膜破裂時(shí)間，增強(qiáng)淚膜穩(wěn)定性，這些效應(yīng)與陽(yáng)性對(duì)照藥維生素A 棕櫚酸酯眼用凝膠相當(dāng)。角膜組織HE 染色結(jié)果提示八寶眼膏能改善角膜的損傷，使上皮層細(xì)胞排列較為緊密，實(shí)質(zhì)層細(xì)胞的形態(tài)亦較為規(guī)則，Muc-5ac 免疫組化結(jié)果說(shuō)明八寶眼膏增加了杯狀細(xì)胞Muc-5ac 表達(dá)，這可能是其增加淚液分泌量的原因之一。因此，認(rèn)為八寶眼膏對(duì)暴露性結(jié)膜炎引起的角膜和結(jié)膜的損傷均有一定的修復(fù)作用。