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        花生黑腐病抗病品種篩選及抗病相關(guān)酶活性測(cè)定

        2021-09-10 06:25:56袁匯濤張?jiān)葡?/span>向梅梅董章勇
        核農(nóng)學(xué)報(bào) 2021年10期

        袁匯濤 張?jiān)葡?向梅梅 羅 梅 董章勇

        (1仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物健康創(chuàng)新研究院,廣東 廣州 510225;2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,廣東 廣州 510225)

        花生黑腐病(peanut black rot)是由花生黑腐病菌(Calonectria ilicicola,冬青麗赤殼,無(wú)性階段為寄生柱帚霉Cylindrocladium parasiticum)引起的花生毀滅性病害。該病于1966年首次在美國(guó)喬治亞州的花生產(chǎn)區(qū)被發(fā)現(xiàn)[1],隨后擴(kuò)散到日本、韓國(guó)和澳大利亞等國(guó)家[2-6]。2009年,我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)花生黑腐病,部分花生產(chǎn)區(qū)發(fā)病率高達(dá)50%[7];隨后,還發(fā)現(xiàn)了由花生黑腐病菌引起的大豆紅冠腐病,該菌對(duì)華南地區(qū)的優(yōu)質(zhì)大豆品種具有極強(qiáng)的侵染力,個(gè)別地塊發(fā)病率高達(dá)80%[8]。潘汝謙等[9]根據(jù)國(guó)際植物檢疫措施標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的有害生物風(fēng)險(xiǎn)性分析程序,評(píng)估得出花生黑腐病菌在中國(guó)屬于高度風(fēng)險(xiǎn)性有害生物,對(duì)花生和大豆等作物的生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。我國(guó)修訂的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》將花生黑腐病菌列為新外來(lái)入侵檢疫性病菌[10]。

        花生黑腐病菌的侵染力強(qiáng),寄主范圍廣,能以微菌核的形式在土壤中存活很長(zhǎng)時(shí)間,可通過(guò)種子、帶菌土壤、病殘組織等多種途徑傳播[9,11-12]。一旦侵染發(fā)病,可引起花生的果針、莢果和根系變黑腐爛,最終導(dǎo)致患病植物萎焉和死亡,造成損失一般在10%以上,受害嚴(yán)重時(shí)損失率高達(dá)50%[1,6]。殺菌劑雖然可以有效減少苗期病害的產(chǎn)量損失[6,13-14],但篩選和培育抗病品種是防治病害最為經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的途徑[15-19]。藍(lán)國(guó)兵等[20]用苗期接種法對(duì)廣東推廣種植的15 個(gè)主要花生品種的花生黑腐病抗性水平進(jìn)行了鑒定,篩選到2 個(gè)抗病品種,1 個(gè)高感品種。但該研究篩選的花生品種數(shù)量較少,且未對(duì)其抗性機(jī)制進(jìn)行探究。

        本研究擬通過(guò)幼芽水培接種方法對(duì)128 個(gè)花生品種進(jìn)行花生黑腐病的抗性鑒定,通過(guò)盆栽接種方法進(jìn)行檢驗(yàn),并測(cè)定花生接種病原菌后抗病相關(guān)酶活性的變化,以期為花生黑腐病抗病育種及品種的田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        花生黑腐病菌菌株Ci14017 分離自廣東省梅州市花生田間病株,由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。128 個(gè)供試花生品種(或材料)由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鄭奕雄教授惠贈(zèng)。

        1.2 抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

        根腐等級(jí)參照Dong 等[21]的方法劃分為5 級(jí),分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)描述如下:0 級(jí):沒(méi)有癥狀;1 級(jí):莖基部輕微變褐;2 級(jí):莖基部變黑,主根變黑長(zhǎng)度小于50%;3 級(jí):莖基部變黑,主根變黑長(zhǎng)度大于50%,有少許次生根存在;4 級(jí):主根完全變黑并開(kāi)始腐爛,次生根腐爛掉落;5 級(jí):主根完全變黑腐爛,植株萎蔫甚至死亡。

        病情指數(shù)=∑(各級(jí)發(fā)病株數(shù)×各級(jí)代表數(shù)值)/(調(diào)查總數(shù)×最高病情級(jí)數(shù))×100。

        免疫(Ⅰ):病情指數(shù)=0;高抗(HR):0<病情指數(shù)≤10;中抗(MR):10<病情指數(shù)≤20;中感(MS):20<病情指數(shù)≤30;高感(HS):病情指數(shù)>30。

        1.3 水培花生的抗病性測(cè)定

        選取健康的花生種子放入培養(yǎng)皿中,加無(wú)菌水放置于30℃培養(yǎng)箱中黑暗催芽2 d。每隔12 h 換一次水。選取胚根1~2 cm 長(zhǎng)的幼芽用于試驗(yàn)。

        將花生黑腐病菌接種于馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose,PD)培養(yǎng)液中,25℃、180 r·min-1培養(yǎng)5 d。用滅菌紗布過(guò)濾菌液,刮取菌絲,吸干水分后稱取5 g 菌絲加入1 L 無(wú)菌水中勻漿備用。幼芽以0.5%菌絲懸浮液浸泡10 min 接種,保濕2 d 后水培,25℃光照培養(yǎng)室中生長(zhǎng)10 d 后觀察。對(duì)128 份花生品種進(jìn)行抗病性鑒定,以無(wú)菌水為對(duì)照,每個(gè)品種3 次重復(fù),每個(gè)重復(fù)10 株。

        1.4 盆栽花生的抗病性測(cè)定

        稱取30 g 燕麥粒煮沸30 min,裝入100 mL 組培瓶中滅菌,將花生黑腐病菌接種至燕麥粒培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)7 d,晾干備用。

        將T09、AS09、P562、桂花35、云花生1 號(hào)等5 個(gè)花生品種催芽,以帶菌燕麥粒拌土接種法進(jìn)行溫室盆栽抗性試驗(yàn),接種濃度為0.5%,每次品種3 次重復(fù),每次重復(fù)10 株。25℃恒溫光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d 后觀察。

        1.5 抗病相關(guān)酶的提取和活性測(cè)定

        以T09 和P562 兩個(gè)花生品種為研究對(duì)象,采用上述幼芽水培的方法進(jìn)行病原菌接種。每個(gè)處理3 次重復(fù),每次重復(fù)15 粒種子。分別于接種后0、0.25、0.5、1、3、5、7、9 d 取樣,提取粗酶液進(jìn)行酶活性的測(cè)定。

        過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo-nialyase,PAL) 和多酚氧化酶(polyphenoloxidase,PPO)提取和活性測(cè)定參照范蘭蘭等[22]的方法;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的提取和活性測(cè)定參照王輝[23]的方法。

        1.6 數(shù)據(jù)處理

        數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用Excel 軟件與DPS 進(jìn)行。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 水培花生的抗病性評(píng)價(jià)

        由表1 可知,病情指數(shù)大于30 的品種有72 個(gè),病情指數(shù)為20~30 的品種有43 個(gè),病情指數(shù)為10~20品種有13 個(gè),病情指數(shù)在10 以下的品種有1 個(gè)。由此可知,128 個(gè)花生品種中,對(duì)花生黑腐病表現(xiàn)出免疫、高抗、中抗、中感、高感的品種分別有0、1、13、42 和72 個(gè),分別占供試花生品種的0、0.8%、10.2%、33.7%和56.3%。其中,T09 的病情指數(shù)最低,為8.0,發(fā)病率為36.7%;P562 的病情指數(shù)最高,為46.0,發(fā)病率為100%。

        表1 128 個(gè)花生品種抗花生黑腐病的病情統(tǒng)計(jì)Table 1 Disease statistics of 128 peanut varieties resistant to peanut black rot

        2.2 盆栽花生的抗病性評(píng)價(jià)

        以水培測(cè)試后確定不同抗性的T09(HR)、AS09(MR)、P562(HS)、桂花35(HS)、云花生1 號(hào)(MS)為研究對(duì)象,以帶菌燕麥粒拌土接種法進(jìn)行花生盆栽抗性試驗(yàn)。接種30 d 后觀察發(fā)現(xiàn),接種花生黑腐病菌的花生植株全部發(fā)病,根部基本變黑或腐爛死亡,而對(duì)照花生根莖健康無(wú)病癥(圖1)。其中,P562 花生發(fā)病最為嚴(yán)重,植株死亡率為41.1%,部分植株莖基部已經(jīng)長(zhǎng)出紅色子囊果;桂花35 發(fā)病程度次之,植株死亡率為25%,亦有部分死亡植株莖基部長(zhǎng)出子囊果;而云花生、AS09、T09 發(fā)病程度較輕,死亡率分別為15%、13.3%和11.1%(表2)。由此可見(jiàn),T09 最抗病,P562最感病。盆栽試驗(yàn)的結(jié)果與幼芽水培接種試驗(yàn)的結(jié)果一致。

        2.3 抗病相關(guān)酶活性的變化

        2.3.1 PAL 活性的變化 由圖2 可知,T09 和P562兩個(gè)品種接種花生黑腐病菌后,PAL 活性均升高。其中,高抗品種T09 的PAL 活性在接種后0.5 和5 d 分別出現(xiàn)高峰,而高感品種P562 在接種后1 d 出現(xiàn)高峰。T09最大峰值為451.09 U·g-1·h-1FW,P562最大峰值為318.37 U·g-1·h-1FW??共∑贩N在接種病原菌后PAL 活性峰值出現(xiàn)較早,峰值出現(xiàn)的次數(shù)也較多;感病品種在接種病原菌后PAL 活性峰值出現(xiàn)較晚,峰值出現(xiàn)的次數(shù)較少。

        表1(續(xù))

        2.3.2 PPO 活性的變化 由圖3 可知,T09 和P562 兩個(gè)品種接種花生黑腐病菌后PPO 活性均升高,高抗品種T09 的PPO 活性在接種后0.5 d 出現(xiàn)峰值,最大峰值為271.67 U·g-1·min-1FW;高感品種P562 在接種后1 d出現(xiàn)峰值,最大峰值為160.02 U·g-1·min-1FW。高抗品種接種病原菌后其酶活性出現(xiàn)峰值較早且峰值大,而高感品種接種病原菌后其酶活性出現(xiàn)峰值較晚且峰值較小。

        表2 不同花生抗性品種室內(nèi)盆栽試驗(yàn)花生黑腐病的發(fā)病情況Table 2 Incidence of black rot of peanut in laboratory pot experiment of different peanut resistant varieties

        2.3.3 POD 活性的變化 由圖4 可知,兩個(gè)品種接種花生黑腐病菌后POD 活性均升高,其中,高抗品種T09的POD 活性在接種后0.5 d 出現(xiàn)高峰,最大峰值為239.23 U·g-1·min-1FW,高感品種P562 均在接種后0.25 d 出現(xiàn)高峰,最大峰值為135.75 U·g-1·min-1FW。高抗品種接種病原菌后其酶活性雖出現(xiàn)峰值較晚但峰值較高,而高感品種接種病原菌后其酶活性雖出現(xiàn)峰值較早但峰值較低。

        2.3.4 SOD 活性的變化 由圖5 可知,兩個(gè)品種接種花生黑腐病菌后SOD 活性均升高,其中,高抗品種T09 在接種后的第7 天出現(xiàn)高峰,最大峰值為28.08 U·g-1·h-1FW;高感品種P562 在接種后的第3 天出現(xiàn)高峰,最大峰值為16.79 U·g-1·h-1FW。

        3 討論

        本研究使用幼芽水培接種的方法對(duì)128 個(gè)花生品種的抗性進(jìn)行篩選,通過(guò)帶菌燕麥粒拌土接種的方法對(duì)不同抗性水平的5 個(gè)品種進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果與幼芽水培接種鑒定的結(jié)果一致。關(guān)于花生黑腐病抗性鑒定方法有田間自然誘發(fā)鑒定和溫室人工接種鑒定兩種[20]。然而,田間影響花生黑腐病發(fā)生的因素有很多,因此田間自然誘發(fā)的鑒定結(jié)果穩(wěn)定性不高,試驗(yàn)重復(fù)性較差。溫室人工接種鑒定方法有微菌核拌土接種法和麥粒菌種拌土接種法,但微菌核拌土接種最少需要12 周,麥粒菌種拌土接種最少需要7 周,試驗(yàn)周期較長(zhǎng)[21,24]。本研究所建立的菌絲懸浮液浸泡幼芽,保濕后水培的花生黑腐病抗性鑒定方法簡(jiǎn)便、高效,10 d 即可獲得結(jié)果,且所得結(jié)果穩(wěn)定性好、重復(fù)性高,非常適合應(yīng)用于苗期抗病品種的大規(guī)模篩選。

        本研究的128 個(gè)花生品種對(duì)黑腐病表現(xiàn)出抗病和感病的品種分別為14 和114 個(gè),占11%和89%。藍(lán)國(guó)兵等[20]對(duì)15 個(gè)花生品種進(jìn)行抗性水平鑒定,獲得抗病和感病品種分別為9 和6 個(gè),占60%和40%。抗感品種的比例有較大差別,原因可能有以下三點(diǎn):首先,使用的花生品種不一樣,難以直接對(duì)比;其次,接種方法和抗性標(biāo)準(zhǔn)不同也可能會(huì)造成鑒定結(jié)果的差異;再次,其他研究選擇的是致病力中等的菌株進(jìn)行抗病性鑒定,而本研究所用的Ci14017 菌株則是高致病力菌株,雖然沒(méi)有直接比較兩者之間的致病力差異,但使用的菌株不同也可能是造成鑒定結(jié)果的比例有差異的原因。本研究盡管沒(méi)有篩選出對(duì)花生黑腐病免疫的品種,但只要擴(kuò)大篩選范圍,將會(huì)繼續(xù)豐富抗病品種的數(shù)量,為花生品種的推廣和布局提供更充足的依據(jù)。

        本研究所鑒定的128 份品種多數(shù)為農(nóng)家種和外引材料,未涉及非近緣種和野生種。抗性鑒定結(jié)果表明,雖然不同遺傳背景花生品種對(duì)黑腐病的抗性存在差異,但大部分為感病品種,高抗花生黑腐病型材料嚴(yán)重缺乏。本研究結(jié)果表明,表現(xiàn)中抗的品種大部分為農(nóng)家種,因此應(yīng)重視和加強(qiáng)對(duì)農(nóng)家種、野生種和非近緣種的篩選鑒定。同時(shí),要特別重視材料水平抗性的鑒定和篩選,確保材料抗病性的穩(wěn)定和適用范圍。

        PAL、PPO、POD 和SOD 被認(rèn)為和抗病性密切相關(guān)[25-28],在抗病花生品種中酶的活性會(huì)顯著升高[22,29]。本研究選用高抗品種T09 以及高感品種P562 測(cè)定PAL、PP、 POD 和SOD 活性。在接種花生黑腐病菌之前,T09 的4 種酶活性都比P562 的高,說(shuō)明這些酶都不同程度地參與了花生的抗病性,并且在抗病品種中參與程度更高。在接種花生黑腐病菌之后,T09 的4 種酶活峰值比P562 的更高,表明在病原菌的脅迫下,抗病品種的防御相關(guān)酶得到充分的誘導(dǎo),更多抗性物質(zhì)被調(diào)用,形成保護(hù)屏障,抵抗病原微生物的侵害。

        4 結(jié)論

        本研究128 個(gè)花生品種對(duì)花生黑腐病表現(xiàn)出抗病和感病的品種分別14 和114 個(gè),占11%和89%;其中T09 為高抗品種,P562 為感病性最高的高感品種。在接種花生黑腐病菌之前,T09 的PAL、PPO、POD 和SOD 四種酶活性都比P562 的高;在接種花生黑腐病菌之后,T09 的四種酶活峰值均比P562 的更高。本研究為后續(xù)深入探討花生黑腐病的抗病機(jī)制及花生高抗品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

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