楊秀蘭 石其宇 彭俊森 劉勤超 黃世安 許興亮 朱守亮 董曉慶

(1貴州大學農(nóng)學院/貴州省果樹工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025；2 貴州省果樹蔬菜工作站，貴州 貴陽 550025)

貴長獼猴桃(Actinidia chinensis Planch)是貴州省果樹科學研究所選育出的優(yōu)質(zhì)獼猴桃品種，果實香甜適口、營養(yǎng)價值高，深受廣大消費者喜愛[1]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，采后易出現(xiàn)腐爛和霉變等問題。貯藏期間霉菌侵染是導致獼猴桃果實腐爛的主要原因，由青霉菌引起的青霉病是影響獼猴桃果實的重要病害之一[2]。段愛莉等[3]研究表明，引起獼猴桃霉爛的病原菌共5 種，分別為青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、 交 鏈 孢 霉 屬(Alternaria)、 毛 霉 屬(Mucor)和擬青霉屬(Paecilomyces)，其中青霉屬為優(yōu)勢菌，占63.3%。青霉菌易從果實傷口及其他病原菌侵染點侵入，過熟或長時間貯藏的獼猴桃果實也易遭受青霉菌侵染，發(fā)生青霉病，導致果實腐爛，而且青霉菌還會產(chǎn)生真菌毒素(棒曲霉素)而危及食品安全[4]。目前控制獼猴桃青霉病的常用方法多使用化學殺菌劑，但化學殺菌劑的濫用不僅會增強病原菌抗藥性，而且會造成環(huán)境的嚴重污染，損害人類身體健康。

天然植物源殺菌保鮮劑是果蔬采后病害的常用殺菌劑，不僅具有較強的抑菌活性，而且低毒、對環(huán)境友好，更重要的是能誘導寄主產(chǎn)生抗性，因此受到越來越多的關(guān)注[5]。葡萄籽提取物(grape seed extract，GSE)是從葡萄種子中提取出的一種多酚類物質(zhì)混合物，其中的原花青素具有極強的抗氧化能力[6]。研究表明，GSE 不僅有抗氧化作用，還具有強烈的抑菌作用[7－8]。董曉敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有明顯抑制作用。劉永衡等[10]研究表明，葡萄籽正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(Escherichia coli)以及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有較強的抑菌效果。高海艷等[11]研究發(fā)現(xiàn)，GSE 處理能降低采后桃果實的自然發(fā)病率，增強其抗病性。崔旸等[12]研究發(fā)現(xiàn)GSE 具有延緩鴨梨果實成熟衰老，維持果實品質(zhì)，控制鴨梨果實采后失重、腐爛及果柄褐變的功效。Duran 等[13]以殼聚糖(chitosan，CH)作為GSE 的載體所制成的抗菌活性涂料包裝對草莓的嗜氧細菌有較好的抑制作用，可極大延長草莓貨架期。吳寧等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GSE 處理能保持鮮香菇良好的感官品質(zhì)，降低失重速率和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，還能有效抑制香菇中細菌的生長。但是GSE 在獼猴桃采后貯藏中的效果研究甚少，關(guān)于獼猴桃果實病害防治中的研究更是鮮有報道。

因此，本試驗以貴長獼猴桃為試材，研究GSE 處理對獼猴桃果實接種青霉菌后的作用效果，探索GSE在獼猴桃果實青霉病防治的應用價值及可能機制，以期為GSE 作為天然抗菌物質(zhì)在果蔬病害防治方面的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗供試材料貴長獼猴桃，于2016年9月22月采自貴州省修文縣平灘村管理良好的果園(26.81°N，106.46°E；海拔1 019 m)，選擇無機械損傷、無病蟲害、大小基本一致的果實用于試驗。

病原菌為擴展青霉(Penicillium expansum)，由中國科學院北京植物研究所李博強課題組提供，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；GSE 為新疆紅葡萄籽水提取物，具體品種為赤霞珠，原花青素含量95%以上，購于西安昌岳生物科技有限公司。氫氧化鈉、聚乙二醇6000(polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVPP)、TritoX－100、愈創(chuàng)木酚、30%H2O2溶液、鄰苯二酚、亞油酸鈉、二水磷酸氫二鈉、一水磷酸氫二鈉、硼酸、硼砂、β－巰基乙醇、L－苯丙氨酸，均為分析純，購于貴州省塞蘭博科技有限公司；濃鹽酸、幾丁質(zhì)、丙酮、脫鹽蝸牛酶、四硼酸鉀、對二甲氨基苯甲醛、N－乙酰葡萄糖胺、乙醇、昆布多糖、3，5－二硝基水楊酸、沒食子酸、葡萄糖、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)等，均為分析純，購于貴州省格瑞恩科技有限公司；蘆丁生化試劑，購于美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ－2D 型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CP213 型電子天平，昆山吉和力儀器有限公司；FA－2104 型分析天平，上海啟閔生物科技有限公司；Eppendorf 移液槍(1 000 μL、100 μL)，德國Eppendorf 公司；SPX－250BⅢ生化培養(yǎng)箱、DK－98－Ⅱ型雙列八孔電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；YG16W 型臺式高速冷凍離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；UV752 紫外分光光度計，上海佑科儀器有限公司；DW-HL678 型超低溫冰箱，成都川弘科生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌及孢子懸浮液的制備 將擴展青霉接種于PDA 培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)活化7 d，隨后用含有0.05%吐溫－20 的無菌水沖下孢子，并采用血球計數(shù)板法計數(shù)，調(diào)整孢子濃度約為1×106個·mL－1。

1.3.2 試驗處理 獼猴桃果實(硬度約16.0 kg·m－2，可溶性固形物約7.5%)用95%的乙醇擦拭，自然晾干，在每個獼猴桃果實的赤道部位用無菌不銹鋼鐵釘(Φ ＝4 mm)刺一個大小、深度一致的傷口(4 mm×5 mm)。將刺傷的果實分為兩組，每組150 個果實:于20±1℃將一組獼猴桃果實浸泡在10 L 7 mg·mL－1GSE溶液(預試驗篩選出的GSE 最佳濃度為7 mg·mL－1，稱取葡萄籽提取物3.278 g 用水配制)中2 min，用于抗性誘導效果的研究；同樣溫度下將另一組浸泡在10 L的清水中2 min(作為對照)。自然條件下晾干，24 h后接種青霉菌孢子(用消毒的鑷子將孢子直接放在獼猴桃赤道損傷部位)，接種后用PE 塑料袋密封保濕(相對濕度85%～90%)，室溫(20±1℃)放置。每天測定病斑直徑和發(fā)病率，連續(xù)測定7 d。每處理3 個重復，每重復20 個果實。分別在接菌第0、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7 天每組分別隨機選擇3 個獼猴桃果實測定果實硬度以及可溶性固形物，3 次重復；并且取病斑周圍1.5 cm 范圍內(nèi)果肉組織混勻，用留樣袋裝好后于－80℃超低溫冰箱中保存進行各項酶活性以及指標測定。每處理3 次重復，每重復2 個果實。

1.3.3 指標測定方法

1.3.3.1 病斑直徑和發(fā)病率測定 病斑直徑采用十字交叉法，取平均值；以病斑直徑≥0.5 mm 確定為發(fā)病，按公式計算發(fā)病率:

1.3.3.2 總酚和類黃酮含量測定 參考曹建康等[15]的方法略加修改。稱取2.0 g 獼猴桃果肉樣品，加入9 mL 經(jīng)4℃預冷的1%HCl－甲醇，充分混勻，4℃避光提取20 min，期間搖動數(shù)次，4℃、12 000×g離心15 min，取上清液于280 nm 和325 nm 波長處比色測定吸光度值(OD)。以每克樣品在波長280 nm 處吸光度值表示總酚含量，即OD280nm·g－1；以每克樣品在波長325 nm波長處吸光度值表示類黃酮物質(zhì)含量，即OD325nm·g－1。

1.3.3.3 MDA 含量測定 參考曹建康等[15]的方法。稱取1.0 g 獼猴桃樣品，加入5.0 mL TCA 溶液(100 g·L－1)，研磨成勻漿后于4℃、10 000×g離心20 min，取2.0 mL 上清液(對照空白管中加入2.0 mL TCA 溶液代替提取液)，加入2.0 mL 0.67% TBA 溶液，混合后在沸水中煮沸20 min，取出冷卻后再離心一次，分別測定上清液在450、532 和600 nm 波長處的吸光度值。

式中，Ⅴ0為樣品提取液總體積，mL；Ⅴ1為測定時所取樣品提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3.4 酶液提取與酶活性測定 參考曹建康等[15]的方法。準確稱取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入不同的提取緩沖液制成酶提取液并測定各酶活性，結(jié)果以U·g－1表示。

脂氧合酶(lipoxygenase，LOX):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預冷(4℃)的提取緩沖液(含1%TritonX－100 和4% PVPP)，在冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

幾丁質(zhì)酶(chitinase，CHI):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預冷(4℃)的提取緩沖液[含1 mmol·L－1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和5 mmol·L－1β－巰基乙醇]，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

β－1，3 葡聚糖酶(β－1，3-glucanase，GLU):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預冷(4℃)的提取緩沖液(含1 mmol·L－1EDTA、5 mmol·L－1β－巰基乙醇和1 g·L－1L－抗壞血酸)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO):取5.0 g獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預冷(4℃)的提取緩沖液(含1 mmol·L－1PEG、4% PVPP 和1%TritonX－100)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

苯丙氨酸氨解酶(phenylalanine amonialyase，PAL):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 預冷的提取緩沖液(含40 g·L－1PVP、2 mmol·L－1EDTA 和5 mmol·L－1β－疏基乙醇)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

過氧化物酶(peroxidase，POD):取5.0 g 獼猴桃果肉樣品加入5 mL 經(jīng)預冷(4℃)的提取緩沖液(含1 mmol·L－1EDTA，4% PVPP 和1%TritonX－100)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析應用Excel 2013 軟件作圖，并采用SAS12.0 軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSE 處理對損傷接菌后獼猴桃果實發(fā)病率和病斑直徑的影響

由圖1 可知，GSE 處理可有效延緩獼猴桃果實接種擴展青霉后果實發(fā)病率的上升。對照組獼猴桃果實在接種擴展青霉1 d 后開始發(fā)病，在接種5 d 后發(fā)病率達100%；GSE 處理組獼猴桃果實在接種2 d 后才開始發(fā)病，接種6 d 后發(fā)病率達100%。GSE 處理組獼猴桃果實比對照組果實接種后發(fā)病率上升較慢，開始發(fā)病時間與全部發(fā)病時間皆延后1 d(圖1-A)。獼猴桃果實接種擴展青霉后，果實病斑直徑隨時間延長不斷擴大。GSE 處理組獼猴桃果實病斑直徑均小于對照組，在接種7 d 后對照組獼猴桃果實病斑直徑為1.58 cm，而GSE 處理組獼猴桃果實病斑直徑則為0.85 cm，較對照組減小46.20%(圖1-B)。在試驗周期7 d 內(nèi)，GSE 處理均顯著抑制了接種后獼猴桃果實病斑直徑的擴大(P<0.05)。

圖1 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實發(fā)病率(A)和病斑直徑(B)的影響Fig.1 Effects of GSE treatment on infection incidence (A) and lesion diameter (B) of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.2 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實總酚和總類黃酮含量的影響

酚類物質(zhì)是植物體中常見的次級代謝物，具有殺菌和抗氧化的作用[4]。獼猴桃果實接種擴展青霉后，其總酚含量呈先升高后下降隨后升高再下降的波動變化。除接種7 d 后對照組獼猴桃果實總酚含量高于GSE 處理組果實外，在接種后1～6 d 期間，經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實總酚含量均顯著(P<0.05)高于對照組(圖2-A)。

類黃酮具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌抗病毒的功能[16]。在接種擴展青霉后0～7 d 期間，獼猴桃果實總類黃酮含量共出現(xiàn)2 個峰值。接種1 d 后，GSE處理果實和對照組獼猴桃果實總類黃酮含量達到第一個峰值，其含量分別為3.22 和2.97 OD325nm·g－1。接種后1～4 d 期間獼猴桃果實總類黃酮含量呈下降趨勢，4～6 d 期間呈上升趨勢。接種后6 d 總類黃酮含量達到第二個峰值，GSE 處理組和對照組總類黃酮含量分別為2.95 和2.60 OD325nm·g－1(圖2-B)。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實接種擴展青霉后的1～7 d 期間其果實總類黃酮含量顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實總酚含量(A)和總類黃酮含量(B)的影響Fig.2 Effects of GSE treatment on total phenols content (A) and total flavonoids content (B) of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.3 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實CHI 和GLU 活性的影響

CHI 和GLU 是兩類重要的能降解病原體細胞壁的病程相關(guān)蛋白，CHI 可降解病原真菌細胞壁中的幾丁質(zhì)成分，GLU 能催化β－1，3－葡聚糖多聚體水解成寡糖，在以寡糖為誘發(fā)因子誘導植物的保衛(wèi)反應，保衛(wèi)素破壞病原真菌細胞壁，從而對病原菌的生長起抑制作用[17]。

獼猴桃接種擴展青霉后GSE 處理組果實CHI 活性大致呈先升高后下降隨后升高再下降的趨勢。GSE處理組和對照組獼猴桃果實CHI 活性最低值均在接種后4 d，分別為17.57 和10.32 U·g－1，兩者相差7.25 U·g－1。對照組獼猴桃果實CHI 活性最高值為55.49 U·g－1，在接種后6 d 出現(xiàn)，此時GSE 處理組獼猴桃果實CHI 活性為58.20 U·g－1，仍高于對照組果實(圖3-A)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，接種擴展青霉后，經(jīng)GSE 處理的果實CHI 活性在2～5 d 時顯著高于對照組(P<0.05)。

獼猴桃接種擴展青霉后GSE 處理組果實GLU 活性在0～7 d 期間總體上呈逐漸升高的趨勢。0 d 時，GSE 處理組和對照組獼猴桃果實GLU 活性分別為10.59 和2.34 U·g－1，接種后7 d 其活性分別為15.81和7.95 U·g－1，分別上升了5.22 和5.61 U·g－1(圖3-B)。在接種擴展青霉后0～7 d 期間，經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實GLU 活性顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實CHI 活性(A)和GLU 活性(B)的影響Fig.3 Effects of GSE treatment on CHI activity (A) and GLU activity (B) of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.4 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實MDA 含量的影響

MDA 是膜脂過氧化的產(chǎn)物，是反映細胞膜受傷害程度的重要指標[15]。MDA 含量越高，果實氧化越嚴重，果實抗逆性越差。接種擴展青霉后，獼猴桃果實MDA 含量大致呈現(xiàn)略微上升而后下降的趨勢。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實MDA 含量始終低于對照組，在接種3 d 后兩組果實MDA 含量差值最大，相差0.13 μmol·g－1(圖4)。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實MDA 含量顯著低于對照組(P<0.05)。

圖4 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實MDA含量的影響Fig.4 Effects of GSE treatment on MDA content of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.5 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實LOX 活性的影響

LOX 能夠啟動細胞膜的過氧化反應，將不飽和脂肪硬催化為游離脂肪酸等物質(zhì)，加速膜脂降解，破壞細胞的正常功能[18－19]。接種擴展青霉后，對照組獼猴桃果實LOX 活性在接種后0～4 d 呈先上升后下降的趨勢，在接種后2 d 其活性達到最高，為49.20 U·g－1；而GSE 處理組獼猴桃果實LOX 活性變化則與之相反，呈先下降后上升的趨勢，在接種后2 d 其活性最低，為4.33 U·g－1。在其后的4～7 d 兩者活性變化趨勢也大致相反。接種擴展青霉后，除0 和4 d 對照組果實LOX活性低于處理組外，其余時間對照組果實LOX 活性均高于處理組(圖5)。在接種后的1、2、3、5、6 d，經(jīng)GSE處理的獼猴桃果實在接種擴展青霉后其LOX 活性顯著低于對照組(P<0.05)。

圖5 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實LOX活性的影響Fig.5 Effects of GSE treatment on LOX activity of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.6 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實PPO 活性的影響

PPO 可通過催化形成木質(zhì)素及其他酚類氧化產(chǎn)物等保護性屏障使植物體免受病菌侵害，也可通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗菌作用[20]。獼猴桃果實接種擴展青霉后，在0 d 時果實PPO 活性處于極低水平。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實PPO 活性在1～3 d 時處于較高水平(大于0.18 U·g－1)，后期較低；而對照組獼猴桃果實除接種后6 d 的PPO 活性達到0.25 U·g－1，其余時間其活性都不高。GSE 處理組獼猴桃果實PPO 活性在接種后1 d 達到最大值0.36 U·g－1，比對照組最大值(接種后6 d)高0.10 U·g－1(圖6)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在接種后1～3 d期間，經(jīng)GSE處理的獼猴桃果實PPO 活性顯著高于對照組(P<0.05)，但在接種后4～6 d 時，經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實PPO活性卻顯著低于對照組(P<0.05)。

圖6 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實PPO 活性的影響Fig.6 Effects of GSE treatment on PPO activity of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

2.7 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實PAL 和POD 活性的影響

作為苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，PAL 與酚類、木質(zhì)素、植保素以及類黃酮等抗病物質(zhì)的合成密切相關(guān)[21]。POD 參與木質(zhì)素的合成，能促進細胞壁的木質(zhì)化，有利于提高植物體的抗病能力[22]。

接種擴展青霉后，對照組獼猴桃果實PAL 活性呈先升高后下降再升高的變化趨勢，GSE 處理組果實PAL 活性呈現(xiàn)上下起伏的波動變化(圖7-A)。處理組果實和對照組之間PAL 活性在接種后4～6 d 時差異顯著(P<0.05)。

獼猴桃接種擴展青霉后，其果實POD 活性呈先升高后下降隨后升高再下降的趨勢，與果實總酚、總類黃酮、CHI 等與植物體抗病相關(guān)的物質(zhì)變化趨勢基本一致。在接種后1 d，GSE 處理組獼猴桃果實POD 活性達到最高，為0.25 U·g－1，此時對照組果實POD 活性為0.048 U·g－1，其活性僅為處理果實的20%左右。對照組果實POD 活性在接種后3 d 最高為0.14 U·g－1，此時處理果實POD 活性為0.17 U·g－1，仍高于對照組果實(圖7-B)。經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實POD 活性整體顯著高于對照組(P<0.05)。

圖7 GSE 處理對損傷接菌后的獼猴桃果實PAL 活性(A)和POD 活性(B)的影響Fig.7 Effects of GSE treatment on PAL activity (A) and POD activity (B) of kiwifruit with inoculation of Penicillium expansum

3 討論

本研究結(jié)果表明，GSE 作為外源因子可有效抑制由擴展青霉引起的貴長獼猴桃果實青霉病的發(fā)生。GSE 處理不僅延遲了獼猴桃損傷接種擴展青霉后果實發(fā)病率的上升，還抑制了獼猴桃果實青霉病病斑直徑的擴大，提高了果實對擴展青霉的抗性，增強了果實的抗病能力。這與GSE 對鴨梨黑斑病和青霉病的抑制作用相一致[8]。GSE 可抑制果實的發(fā)病率及病斑直徑擴展，可能的原因是GSE 粗提物中含有多種具有抑菌以及提高果實抗病性的物質(zhì)[16]。

GSE 是從葡萄籽中分離提取的一種天然抗氧化物質(zhì)，其主要成分為低聚原花青素。原花青素是植物中一大類由兒茶素、表兒茶素、沒食子酸和表兒茶素沒食子酸酯等單體聚合而成的，以黃烷－3－醇為主要結(jié)構(gòu)的聚多酚類化合物的總稱[23]。此外，GSE 中還含有大量酚性羥基，可在體內(nèi)以競爭性結(jié)合自由基的方式有效清除體內(nèi)過量的自由基[24]，具有優(yōu)越的抑菌、抗氧化、清除自由基等重要作用[25]。Duran 等[13]研究證明，與不加入GSE 相比，加入GSE 的殼聚糖涂膜液能夠減少新鮮草莓表面的微生物含量，抑制病原菌的生長。

酚類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物具有抑制病原菌生長的作用，是植物抗病的機制之一[26]。類黃酮不僅可以抵御活性氧及自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害[27]，還能提高植物抗菌抗病毒的能力[28]。本研究結(jié)果表明，GSE 處理顯著提高了獼猴桃果實的總酚和總類黃酮含量。這與多種誘抗劑如茉莉酸甲酯[29]、苯丙噻重氮[30]、銀杏葉提取物[16]的研究結(jié)論一致。

MDA 是植物細胞膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量可用于表示膜脂過氧化程度[31]。MDA 的大量積累會破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，從而使細胞喪失正常功能，失去對病原菌的防御能力[32]。本試驗經(jīng)GSE 處理的獼猴桃果實MDA 含量顯著降低，表明GSE 處理可降低細胞膜脂過氧化程度，抑制獼猴桃的氧化損傷，從而提升獼猴桃果實的抗病性。也有研究表明，GSE 可降低香菇在4℃貯藏過程中的MDA 含量，減緩貯藏過程中細胞膜的損傷[14]。LOX 可啟動膜脂過氧化反應，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)與功能，導致細胞屏障受損[33]。本試驗中，獼猴桃果實經(jīng)GSE 處理后其LOX 活性顯著低于對照組，進一步說明了GSE 具有抑制獼猴桃果實膜脂過氧化的功能。

CHI 和GLU 是植物中研究最廣泛、性質(zhì)最明確的兩類病程相關(guān)蛋白，無論是單獨作用還是聯(lián)合作用，都有助于植物抵御病原體的侵染[34]?？共≌T導劑誘導的抗病反應與CHI 和GLU 活性升高有關(guān)，其抗病作用在楊梅[35]、蘋果[36]、桃[37]等果實的研究中已得到證明。本試驗結(jié)果顯示，GSE 處理提高了獼猴桃在損傷接種擴展青霉后果實的CHI 和GLU 活性，這說明GSE處理提升了獼猴桃果實的抗病性，對獼猴桃防御青霉菌侵染的效果明顯。

PPO、PAL 和POD 不僅參與植物體內(nèi)酚類、木質(zhì)素和植保素等抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，還參與活性氧的清除[38－39]，具有抵御活性氧自由基傷害、增強植物體抗性的作用，是植物體內(nèi)重要的防御酶。研究證明植物抗病性的提高與誘抗劑處理后能夠誘導體內(nèi)防御相關(guān)的酶活性提高，從而降低對真菌侵染的敏感性密切相關(guān)[29，40－43]。如Pan 等[29]研究表明，茉莉酸甲酯可通過提高金魁獼猴桃果實內(nèi)POD 和PPO 活性，降低獼猴桃軟腐病的發(fā)生；熱水和山梨酸鉀單獨或者聯(lián)合處理均可提高徐香獼猴桃PPO、POD 和PAL 活性，抑制獼猴桃灰霉病的發(fā)生[41]。本試驗中，GSE 處理顯著提高了獼猴桃果實POD 活性，從第4 天開始顯著提高了PAL 活性，增強了果實多酚類物質(zhì)的合成，提高了果實抗氧化特性。而GSE 處理并未一直提高PPO 活性，而是在前期顯著提升了獼猴桃果實的PPO 活性，但到后期處理組果實PPO 活性低于對照組果實。這可能是由于前期接種擴展青霉后果實PPO 活性被誘導顯著提升以抵御病原入侵，但隨著接種時間的延長，獼猴桃果實抗性降低，PPO 活性也隨之下降。但其具體的原因還有待進一步分析與探討。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，GSE 處理可以通過降低獼猴桃果實MDA 含量、LOX 活性，提高獼猴桃果實的總酚、總類黃酮含量，提升獼猴桃果實CHI、GLU、PPO、PAL和POD 活性以抑制接種擴展青霉后果實病情的發(fā)展，延緩果實發(fā)病率的上升，同時抑制果實病斑直徑的擴大，GSE 對獼猴桃果實采后青霉菌侵染病害具有一定的抑制作用，對獼猴桃果實青霉病防治具有較好的作用。綜上，GSE 可作為綠色天然防腐劑應用于果蔬貯藏保鮮。